高硼暴露通過誘導細胞焦亡加劇雞肝細胞損傷

摘 要： 旨在探索硼暴露誘導雞肝細胞損傷的作用機制。試驗選取30只AA肉雞隨機分為對照組（control group，CG）、低硼組（low boron group，LBG）和高硼組（high boron group，HBG），在基礎日糧中分別添加不同劑量硼進行飼喂：基礎日糧（硼 0 mg · kg-1），低硼日糧（硼 120 mg · kg-1）、高硼日糧（硼 240 mg · kg-1），處理7及14 d后采集肝組織。使用ICP-MS測定肝組織中的硼含量，全自動血生化分析儀檢測ASL及ALT水平，HE染色觀察肝組織病理變化，透射電鏡觀察肝細胞超微結構變化，免疫組化和免疫熒光檢測肝細胞焦亡相關蛋白NLRP3及IL-1β定位表達情況，RT-qPCR和Western blot 檢測NLRP3、Casapse-1、IL-1β、IL-18和GSDMD的mRNA和蛋白表達水平。結果顯示，蓄積于肝組織中的硼含量隨著硼暴露時間和劑量的增加而增加。此外，14 d-低硼組（14 d-LBG）和高硼組（14 d-HBG）的肝組織結構明顯破壞，并且細胞焦亡水平隨硼劑量的增加而加?。慌c同時間的CG相比，14 d-LBG中NLRP3、Caspase-1、IL-18的mRNA表達水平顯著上升（Plt;0.05），14 d-HBG的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18及GSDMD的mRNA和蛋白表達水平顯著上升（Plt;0.05）。高硼暴露可通過誘導細胞焦亡進而造成雞肝細胞損傷。

關鍵詞： 硼；細胞焦亡；雞；肝細胞

中圖分類號：S856.9

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）10-4747-13

收稿日期：2023-11-22

基金項目：廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2023A1515012811；2022A1515110090）

作者簡介：何 婷（1998-），女，廣西崇左人，碩士，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail： hting1017@163.com

*通信作者：劉忠華，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail：liuzh@scau.edu.cn;余文蘭，主要從事畜禽代謝病研究，E-mail：yuwenlan1989@scau.edu.cn

High Levels of Boron Exposure Aggravated Hepatocytes Damage in Broilers via Pyroptosis

HE" Ting1， LIU" Siying1， QUAN" Jinwen1， SU" Weiqian1， HUANG" Jiangli1， LI" Yumeng1， LIU" Zhonghua

1，2*， YU" Wenlan1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.Laboratory Animal Center， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" We aim to explore the mechanism of boron-induced hepatocytes damage in broilers. Thirty AA broiler chickens were randomly divided into control group （CG）， low boron group （LBG） and high boron group （HBG）. They were fed with different additional doses of boron in the basal diet： the basal diet （boron 0 mg · kg-1）， low boron diet （boron 120 mg · kg-1） and high boron diet （boron 240 mg · kg-1）， respectively. Liver tissues were collected 7 and 14 days after treatment. The content of boron in liver tissue was determined by ICP-MS， the ASL and ALT levels were tested by automatic blood biochemistry analyzer， the pathological changes in liver tissue were observed by Hamp;E staining， ultrastructural changes in liver tissue were observed by transmission electron microscopy， and the localized expressions of NLRP3 and IL-1β in liver tissue were detected by immunohistochemistry and immunofluorescence. The mRNA and protein expression levels of NLRP3， Casapse-1， IL-1β， IL-18， and GSDMD were detected by RT-qPCR and Western blot. The results showed that the amount of boron stored in the liver tissue as along dietary boron levels increased， with the duration and dosage of exposure. In addition， the structural integrity of the liver tissue of 14-day-low boron group （14 d-LBG） and 14-day-high boron group （14 d-HBG） was significantly compromised， with an increase in pyroptosis levels with an increase in boron dosage. Compared with CG at the same time， a significant upregulation of mRNA expression levels of NLRP3， Caspase-1 and IL-18 was observed in the 14 d-LBG（Plt;0.05）. Furthermore， a significant upregulation of both mRNA and protein expression levels of NLRP3， Caspase-1， IL-1β， IL-18 and GSDMD was observed in the 14 d-HBG （Plt;0.05）. High levels of boron exposure could induce hepatocytes damage in broilers through the pyroptosis pathway.

Key words： boron; pyroptosis; broiler; hepatocyte

*Corresponding authors：" LIU Zhonghua， E-mail： liuzh@scau.edu.cn; YU Wenlan， E-mail： yuwenlan1989@scau.edu.cn

硼（boron，B）是生物機體所需的關鍵微量元素之一，在增強機體免疫力、提高生長性能及促進骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用［1-2］。畜禽飼料的原料中包含豆粕、玉米等作物，研究表明，在豆類作物種植過程中施用含硼的肥料能夠明顯促進其生長及增產(chǎn)［3-4］。此外，有研究結果表明，在面制品及豆制品中加入硼砂可使其保持亮麗色澤及筋道的口感，但硼砂的過量攝入對人體同樣會產(chǎn)生不可逆的毒性作用［5］。硼的過量或不合理使用不僅會通過飼料原料或食品添加劑等方式被動物及人體攝入繼而產(chǎn)生毒性作用，還會通過污染土壤和水源進入食物鏈中危害人類生命健康。肝作為機體內(nèi)金屬代謝和蓄積的主要靶器官，金屬一旦進入體內(nèi)，必須經(jīng)過肝進行代謝。過量或長期攝入硼可能會在肝中蓄積，但目前不同水平硼暴露對肝的損傷機制尚不明確。

細胞焦亡是一種促炎性的細胞死亡方式，也稱為繼發(fā)性壞死，它的發(fā)生依賴于半胱天冬酶家族的酶活性［6-7］。細胞焦亡發(fā)生時，細胞質膜會形成1～2 nm的Caspase-1活性孔隙，進而影響跨膜離子通量，促使細胞質腫脹、膜破裂，最終導致細胞質炎性細胞因子泄漏、細胞裂解死亡［8］。同時，大量研究表明，大多數(shù)的肝疾病常伴隨著細胞焦亡的發(fā)生及參與，細胞焦亡在不同方式誘導的肝損傷中具有重要且不同的作用［9-10］。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一些重金屬或類金屬會誘導細胞焦亡，促進細胞焦亡相關炎癥因子的表達，進而造成組織損傷［11-13］。為進一步探究高硼暴露對雞肝毒性的作用機制，本研究通過飼料添加不同濃度硼建立硼暴露模型，觀察硼暴露對雞肝細胞的功能及結構的影響，利用分子生物學技術檢測細胞焦亡關鍵基因和蛋白的表達水平，旨在為臨床硼中毒提供分子病理學研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物分組與設計

本試驗經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物倫理委員會批準（編號：2022A051）。30只1日齡健康AA肉品雞購自魯東禽業(yè)，肉雞進行常規(guī)免疫后飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心［SYXK（粵）2022-0136］。肉雞均自由飲水和進食，飲用水中的硼含量小于0.5 mg·L-1，符合國家《生活飲用水衛(wèi)生標準》GB 5749—2002要求，基礎日糧中的硼含量為10 mg·kg-1。飼養(yǎng)環(huán)境要求符合國家標準GB14925，溫度控制20～28℃，空氣相對濕度為50％～70％，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。經(jīng)過7 d的適應性飼養(yǎng)后，隨機分為3組（每組10只），硼酸為硼源，根據(jù)飼料中額外添加硼的劑量分組：對照組（硼 0 mg·kg-1，CG）， 低硼組（硼 120 mg·kg-1，LBG）、高硼組（硼 240 mg·kg-1，HBG），硼的劑量依據(jù)前期研究結果，最低劑量為LD50的1/20 ，最高劑量為LD50 的1/10［14-15］。各組肉雞自由飲水、采食，連續(xù)飼喂7和14 d，肉雞飼料符合國家實驗動物飼料營養(yǎng)標準NRC（1994），日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗結束后，用1.5%戊巴比妥納靜脈注射安樂死，快速將肝組織從體內(nèi)分離并將其置于生理鹽水中進行清洗。清洗完畢后用干凈的吸水紙吸凈組織表面多余的水分并將一部分肝組織放入4%多聚甲醛溶液中進行樣本固定，剩余組織放入凍存管中并置于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

硼酸購自上海美妮生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司；TRIzol購自TaKaRa公司；Prime ScriptRT Master Mix、蛋白定量劑試盒、ECL化學發(fā)光試劑盒以及2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；GAPDH、 Caspase1、IL-1β及NLRP3一抗（均為兔源抗體），購自由艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；預染Marker、HRP標記的羊抗兔二抗購自廣州凱閣生物科技有限公司；多聚甲醛購自廣州維寧生物科技有限公司；切片石蠟、中性樹膠購自國藥集團公司。除此之外，其他所有試劑均為國產(chǎn)分析純。

電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）購自美國熱電公司；LightCycler 480型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Unique-R10型超純水儀購自廈門銳思捷科學儀器有限公司；DM1000型光學顯微鏡購自廣州德真科學儀器有限公司。

1.3 肝系數(shù)

試驗結束后，將所有肉雞進行稱重并安樂死。將肝迅速從體內(nèi)取出后進行稱重并記錄數(shù)值，按照公式計算肝系數(shù)：肝系數(shù)=肝質量（g）×100% /體重（g）。

1.4 肝組織硼含量的測定

按照食品安全國家標準GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》第一法，使用Agilent 7700系列ICP-MS電感耦合等離子體系譜儀測定硼信號強度并根據(jù)標準濃度曲線分析樣品中的硼含量［16］。

1.5 血清中轉氨酶的測定

將肉雞保定，通過翅下靜脈取血5 mL，靜置30 min，3 000 r·min-1離心15 min，收集上層血清100 μL置于血液生化檢測杯中，利用全自動血生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase， ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase， AST）水平。

1.6 肝組織病理學觀察

將肝組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，將組織塊形狀修整至接近正方體后移入包埋盒中，自來水流水過夜。組織塊經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，放入融化的石蠟中進行石蠟包埋。將包埋塊切至5 μm厚的組織切片，并固定于載玻片上，置于37℃展片臺上過夜。切片用蘇木精核染12 min，接著進行20 s的鹽酸酒精分色，隨后用自來水流水返藍，最后用伊紅復染；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。最后，通過光學顯微鏡觀察肝組織的病理學變化并拍照記錄。

1.7 透射電鏡觀察

將肝組織切碎至1 mm3 ，并置于2.5%戊二醛中48 h進行樣本前固定，用0.1 mol·L-1 PBS 緩沖液漂洗4次，15 min·次-1；酒精梯度脫水（30%、50%、70%、80%、90%、100%），過渡到丙酮中處理2次，15 min·次-1。以樹脂為包埋劑，將包埋劑與丙酮的混合液（V/V=1/3）、（V/V=1/1）分別滲透4.5及12 h后，樹脂和丙酮的混合液（3/1）滲透7 h。再用100%純樹脂包埋過夜，70 ℃聚合樹脂24 h。最后，用修塊機將包埋塊修至1 mm3的大小，用超薄切片機切片，用醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛溶液對切片進行雙重染色。染色切片晾干后，使用美國FEI公司TalosL120C型透射電鏡進行觀察并拍照記錄。

1.8 實時熒光定量PCR

使用TRIzol法提取肝組織總RNA，并通過Nanodrop-2000超微量分光光度計檢測其濃度和純度。在逆轉錄得到的cDNA用DEPC水進行10倍稀釋，采用染料法進行RT-qPCR反應。RT-qPCR反應體系：cDNA 1 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL ，引物F/R各0.4 μL，DEPC水 3.2 μL。擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。檢測GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18 mRNA的相對表達量?；蛐蛄袕腉enBank獲取，本試驗選擇管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，使用Primer Express 5.0軟件設計引物序列，基因序列如表2所示。

1.9 免疫印跡分析

取50 mg肝組織，加入400 μL RIPA 裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1）進行組織勻漿，4 ℃離心后，抽取上清液，得到肝組織總蛋白原液，使用BCA試劑盒測定蛋白量。加入RIPA裂解液對蛋白原液進行定量稀釋，將蛋白稀釋液與5×Loading Buffer（體積比=4∶1）混勻并于95 ℃水浴使蛋白充分變性。利用SDS-PAGE凝膠電泳技術對蛋白進行分離并轉移至PVDF膜上方，使用快速封閉液在室溫下封閉15 min，隨后用TBST溶液清洗膜3次，每次清洗時間均為5 min。在此之后，將膜置于一抗中在4 ℃過夜孵育，然后使用二抗在26℃下孵育2 h，TBST溶液清洗膜4次，每次清洗時間均為5 min。最后，使用發(fā)光液顯影條帶，并通過凝膠成像系統(tǒng)成像并記錄結果。

1.10 免疫組織化學染色

將石蠟切片在55℃烘片40 min，在室溫下放涼，并使用二甲苯透明、梯度酒精復水，使用10 mmol·L-1檸檬酸鈉緩沖液（pH=6.0）進行抗原修復。PBS洗滌3次，用10%馬血清于37℃封閉1 h，用NLRP3一抗4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，按照DAB試劑盒使用說明在顯微鏡下孵育顯色，顯色完全后置于PBS中終止顯色反應。將切片樣本置于蘇木精核染液中染色8 min，隨后，自來水流水返藍，梯度酒精脫水，使用二甲苯透明處理進一步增強染色效果。最后，使用中性樹膠封片將樣本固定在玻璃切片上便于光學顯微鏡的觀察，并通過ImageJ分析試驗結果的光密度值。

1.11 免疫熒光試驗

與免疫組織化學相似，將組織烘片、透明、復水后進行抗原修復。用PBS洗滌3次，0.5% Triton X-100透化20 min，1% BSA封閉1 h，IL-1β兔源抗體（一抗）在濕盒中4℃過夜孵育，增加抗體與抗原的結合機會，提高試驗的準確性和可靠性。次日，滴加已稀釋好的熒光羊抗兔二抗，在37 ℃避光孵育1.5 h，以確保標記物與抗原的充分結合。隨后，使用PBS洗滌3次以去除可能存在的非特異性結合。接著，滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑減少背景噪音，提高圖像的質量。最后，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖片，通過Image-J分析軟件對熒光強度進行分析。

1.12 統(tǒng)計分析

使用Excel 2021對試驗數(shù)據(jù)進行初步處理。處理后的數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤（x-±sx-）”的形式表示，其中，n=5。使用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行差異顯著性檢驗，并使用Graphpad Prism 9.0軟件制作圖表，利用Image J軟件對免疫組化及免疫熒光結果進行量化分析。在顯著性檢驗中，與對照組相比較，*.Plt;0.05，**.Plt;0.01，***.Plt;0.001，****.Plt;0.000 1；高硼組間的差異分析，#.Plt;0.05，##.Plt;0.01，###.Plt;0.001。當Plt;0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 "果

2.1 肝系數(shù)

肝系數(shù)分析結果見圖1。結果顯示，與7 d-CG（7 d，0 mg·kg-1）及14 d-CG（14 d，0 mg·kg-1）相比，7 d-HBG（7 d，240 mg·kg-1）與14 d-LBG肝系數(shù)顯著升高（Plt;0.05或Plt;0.01）。相比于14 d-CG，14 d-HBG肝系數(shù)顯著升高（Plt;0.001）。

2.2 肝組織中硼含量

如圖2所示，7 d-CG與14 d-CG肝中的硼含量無明顯差異，隨著添加在飼料中硼含量的增多，肉雞肝組織中的硼含量隨劑量的增加而升高。經(jīng)過7 d的硼暴露處理后，7 d-LBG（7 d，120 mg·kg-1）和7 d-HBG肝中的硼含量顯著增多（Plt;0.01或Plt;0.001）。同時，在14 d-LBG及HBG中，肝組織中的硼含量較14 d-CG顯著提高（Plt;0.001）。值得注意的是，在高硼組中，14 d肝中的硼含量相比7 d顯著升高（Plt;0.001）。

2.3 肝功能指標檢測結果

結果如表3所示。硼處理7 d時，與對照組相比，7 d-LBG肉雞的血清ALT水平顯著升高（Plt;0.05），7 d-HBG血清中的ALT及AST水平顯著升高（Plt;0.05）。同時，在14 d-LBG及HBG中，血清中的AST及ALT較14 d-CG顯著提高（Plt;0.05）。值得注意的是，在HBG中，14 d血清中的AST、ALT相比7 d顯著升高（Plt;0.05）。

2.4 肝組織病理學觀察

肝組織Hamp;E染色切片結果如圖3。根據(jù)圖3A和3D所示，7 d-CG與14 d-CG的肝細胞呈放射狀排列，以中央靜脈為中心，排列整齊，胞核明顯可見，門管區(qū)結構完整。從圖3B及3E可以看出，隨著硼含量的增加，14 d的低硼組及高硼組肝細胞出現(xiàn)了炎性細胞浸潤和肝細胞水腫變性等變化。如圖3C及3F所示，高硼處理的肝細胞損傷進一步加劇，隨著暴露時間的延長，14 d-HBG相較7 d-HBG不僅出現(xiàn)肝細胞水腫，且進一步發(fā)生了細胞核溶解。結果表明，高硼暴露會影響肝組織結構，導致肝細胞損傷、炎癥反應和細胞死亡等病理學改變。

2.5 肝超微結構觀察

不同劑量硼暴露處理的肝超微結構變化見圖4。根據(jù)圖4發(fā)現(xiàn)硼處理組均出現(xiàn)不同程度的線粒體腫脹，粗面內(nèi)質網(wǎng)內(nèi)質網(wǎng)擴張及核周間隙變寬。7 d-LBG、14 d-LBG出現(xiàn)線粒體腫脹現(xiàn)象，7 d-CG及14 d-CG的線粒體形態(tài)結構較為正常，而7 d-HBG和14 d-LBG的粗面內(nèi)質網(wǎng)出現(xiàn)明顯擴張，線粒體腫脹、空泡，14 d-HBG核周間隙明顯增寬，糖原蓄積增多，粗面內(nèi)質網(wǎng)消失。

2.6 硼暴露對肝細胞焦亡相關基因mRNA和蛋白表達水平的影響

如圖5所示，高硼處理下細胞焦亡相關基因的mRNA和蛋白表達量與對照組相比呈劑量依賴性增加。相對于對照組，高硼組焦亡相關基因NLRP3、Caspase-1、 IL-18和GSDMD的mRNA相對表達量顯著增加（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001），而NLRP3、Caspase-1和IL-1β在高硼組中的蛋白表達量顯著高于對照組（Plt;0.001，Plt;0.000 1）。在高硼組中，與7 d-HBG相比，14 d-HBG中Caspase-1和IL-18的mRNA相對表達量顯著升高，同時，14 d-HBG的NLRP3和IL-1β蛋白表達量顯著高于7 d-HBG（Plt;0.001）。

2.7 免疫組織化學結果

通過免疫組織化學法檢測細胞焦亡關鍵蛋白NLRP3在肝中的定位表達，結果如圖6I所示。NLRP3在細胞質和細胞核中均有分布，且陽性細胞呈現(xiàn)為黃棕色。在圖6Ⅰ-A和6I-D觀察到7 d-CG和14 d-CG僅含有少量黃棕色顆粒；然而，當飼料中的硼含量增加時，肝中的NLRP3陽性顆粒數(shù)量呈現(xiàn)出隨劑量性增加的趨勢。通過Image-J對圖像進行平均光密度（IOD）分析，結果發(fā)現(xiàn)（圖6II），硼處理組肝細胞中NLRP3蛋白的定位表達水平與對照組相比有顯著增加，且這種增強效果與硼的劑量呈依賴性（Plt;0.05），在高硼處理組中，14 d-HBG相較于7 d-HBG，NLRP3陽性表達率顯著增多（Plt;0.01）。結果表明，高濃度的硼導致受損肝細胞中NLRP3蛋白的異常表達和活化，從而加劇肝損傷。

2.8 免疫熒光結果

使用免疫熒光法檢測細胞焦亡關鍵蛋白IL-1β在肝細胞中的定位及定性表達，結果如圖7Ⅰ所示，IL-1β的蛋白表達量呈劑量依賴性上升；同時，在高硼處理組中，相較7 d-HBG，14 d-HBG的IL-1β蛋白表達量增多。通過Image-J分析軟件對熒光強度進行檢測，結果如圖7Ⅱ，可以觀察到硼處理組與對照組之間的平均光密度存在顯著差異，硼處理組的陽性表達量顯著增加（Plt;0.01）。

3 討 論

硼是在自然環(huán)境廣泛存在的非金屬元素［17］。在自然環(huán)境中，植物通過土壤吸收水溶性的硼，動物則通過飼料及飲水等方式攝?。?8］。一旦攝入過量的硼，則會打破其在生物體內(nèi)的代謝平衡，導致硼在體內(nèi)蓄積并造成組織損傷，最終對人和動物的健康造成威脅［19-20］。硼進入體內(nèi)后，可以通過血液循環(huán)至全身臟器組織，長期暴露于過量的硼會對機體的肝、脾和胸腺等器官產(chǎn)生不可逆轉的毒性作用［21-22］。本試驗結果表明，肝系數(shù)和硼暴露劑量之間存在正相關關系，特別在高硼暴露14 d時，肝系數(shù)明顯升高。同時，隨著硼暴露劑量的增加，各組肉雞肝中的硼含量也隨之增加。在正常生理耐受范圍內(nèi)，機體可通過正常的代謝可把多余的硼排出體外，但當添加含量達到240 mg·kg-1時，過量的硼會大量蓄積在肝中，影響肝正常生理功能，并造成肝細胞病變，導致肝細胞發(fā)生大面積空泡變性，胞核濃縮甚至消失。有研究發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B細胞經(jīng)過環(huán)境污染物暴露后，細胞內(nèi)質網(wǎng)出現(xiàn)不同程度的腫脹并發(fā)生細胞焦亡［23-24］。本試驗結果表明，隨著硼處理的劑量升高，肝細胞出現(xiàn)線粒體腫脹、內(nèi)質網(wǎng)擴張及核周間隙增寬的發(fā)生。結果表明，高水平硼暴露會在肝中蓄積，并造成肝細胞損傷。

細胞焦亡是一種近來被發(fā)現(xiàn)的新型細胞死亡方式，其本質為一種依賴于Caspase-1的病理性細胞死亡過程，在細胞焦亡過程中，Caspase-1起著至關重要的角色［25-26］。Caspase-1是由一種特殊的炎癥相關受體（如NLRP1或NLRP3）活化而來，能夠感知并識別損傷信號，例如ATP、PAMP（pathogen-associated molecular patterns）、胞質成分等［27］。當Caspase-1被活化后，可以形成炎癥復合體并接觸到相應的細胞膜底物并導致細胞膜發(fā)生穿孔，從而使胞內(nèi)物質借助穿孔的細胞膜釋放到胞外，進而引發(fā)炎癥反應［28］。此外，Caspase-1切割底物，進而激活一系列的下游效應蛋白，這些下游效應蛋白協(xié)同作用，引發(fā)細胞焦亡［29］。Zhang等［30］發(fā)現(xiàn)鎘和鉬可引起鴨腎小管上皮細胞穿孔，細胞空泡化，細胞活力降低，Caspase-1基因及蛋白表達量增多，進而誘發(fā)細胞焦亡。由此可見，重金屬可通過活化Caspase-1產(chǎn)生細胞毒性，并可誘導發(fā)生依賴于Caspase-1的細胞焦亡。從本試驗的RT-qPCR和Western blot研究結果也表明，隨著硼暴露劑量的增加，Caspase-1的mRNA及蛋白表達水平均呈現(xiàn)出上調趨勢，且Caspase-1的表達水平隨著暴露時間的增加而升高。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞焦亡除了由Caspase-1主導之外，細胞中許多炎癥體同樣參與了細胞焦亡過程，如NLRP3（NOD樣受體裂解蛋白3）。NLRP3是免疫系統(tǒng)中關鍵作用蛋白，它在炎癥小體復合物中起重要作用。當NLRP3受到刺激時，它能夠激活炎癥小體，炎性小體通過激活Caspase-1釋放炎癥介質，如IL-1β和IL-18，從而誘導細胞焦亡［24，31］。前期研究發(fā)現(xiàn)，不同金屬暴露后肝細胞中的NLRP3 mRNA及蛋白表達水平均明顯上調，下游焦亡關鍵基因IL-1β和IL-18的mRNA及蛋白表達呈現(xiàn)上升趨勢［32］。在本試驗中，隨著硼暴露濃度的增加，肝細胞中NLRP3和IL-1β的蛋白表達水平及分布明顯增加，RT-qPCR和Western blot結果同樣顯示，NLRP3、IL-1β及IL-18基因及蛋白表達呈劑量性上調，隨著硼暴露時間的增加，焦亡相關mRNA及蛋白水平上調趨勢更為顯著。本試驗結果表明，高硼暴露通過觸發(fā)NLRP3炎性小體的生成，進而激活Caspase-1，并促進IL-1β和IL-18的釋放，從而導致肝細胞發(fā)生焦亡，進而對肝造成損傷。

4 結 論

高水平硼暴露會在肝中蓄積，影響肝功能和肝細胞結構，并可通過誘導細胞焦亡進而造成雞肝細胞損傷。

參考文獻（References）：

［1］ WANG W， XIAO K， ZHENG X T， et al. Effects of supplemental boron on growth performance and meat quality in African ostrich chicks［J］. J Agric Food Chem， 2014， 62（46）：11024-11029.

［2］ XIAO K， ANSARI A R， REHMAN Z U， et al. Effect of boric acid supplementation of ostrich water on the expression of Foxn1 in thymus［J］. Histol Histopathol， 2015， 30（11）：1367-1378.

［3］ SCHON M K， BLEVINS D G. Foliar boron applications increase the final number of branches and pods on branches of field-grown soybeans［J］. Plant Physiol， 1990， 92（3）：602-607.

［4］ 侯 宇， 王 珂， 楊 蕓， 等. 噴施硼肥對小麥籽粒產(chǎn)量和面粉品質的影響［J］. 陜西農(nóng)業(yè)科學， 2022， 68（9）：30-32， 98.

HOU Y， WANG K， YANG Y， et al. Effect of spaying boron fertilizer on yield and quality of wheat［J］. Shaanxi Journal of Agricultural Sciences， 2022， 68（9）：30-32， 98. （in Chinese）

［5］ 萬洋靈， 郭順堂. 食品中硼的健康風險與控制研究進展［J］. 食品科學， 2016， 37（21）：265-270.

WAN Y L， GUO S T. Progress in understanding and controlling health risks associated with boron in foods［J］. Food Science， 2016， 37（21）：265-270. （in Chinese）

［6］ WEI Y N， YANG L， PANDEYA A， et al. Pyroptosis-induced inflammation and tissue damage［J］. J Mol Biol， 2022， 434（4）：167301.

［7］ VANDE WALLE L， LAMKANFI M. Pyroptosis［J］. Curr Biol， 2016， 26（13）：R568-R572.

［8］ HSU S K， LI C Y， LIN I L， et al. Inflammation-related pyroptosis， a novel programmed cell death pathway， and its crosstalk with immune therapy in cancer treatment［J］. Theranostics， 2021， 11（18）：8813-8835.

［9］ 關海梅， 曾陽玲， 王恬雯， 等. GSDMD介導的肝細胞焦亡在急性肝衰竭中的致病機制［J］. 海南醫(yī)學院學報， 2024， 30（9）：700-706.

GUAN H M， ZENG Y L， WANG T W， et al. Pathogenesis of GSDMD-mediated pyrodeath of hepatocytes in acute liver failure［J］. Journal of Hainan Medical University， 2024， 30（9）：700-706. （in Chinese）

［10］ 周 琦， 呂紅彬， 王亞平， 等. NLRP3炎癥小體在糖尿病視網(wǎng)膜病變神經(jīng)血管單元損傷中的機制研究［J］. 國際眼科雜志， 2023， 23（8）：1317-1322.

ZHOU Q， LYU H B， WANG Y P， et al. Research on the mechanism of NLRP3 inflammasome in neurovascular unit impairment of diabetic retinopathy［J］. International Eye Science， 2023， 23（8）：1317-1322. （in Chinese）

［11］ 梁文清， 劉忠華， 常曉月， 等. 長期高銅暴露通過影響線粒體自噬和細胞焦亡誘導大鼠肝組織損傷［J］. 畜牧獸醫(yī)學報， 2022， 53（12）：4490-4500.

LIANG W Q， LIU Z H， CHANG X Y， et al. Long-term exposure to high levels of copper induced liver injury in rats by affecting mitophagy and pyroptosis［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2022， 53（12）：4490-4500. （in Chinese）

［12］ WAN F， ZHONG G L， WU S F， et al. Arsenic and antimony co-induced nephrotoxicity via autophagy and pyroptosis through ROS-mediated pathway in vivo and in vitro［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2021， 221：112442.

［13］ LI Y X， ZHONG G L， HE T， et al. Effect of arsenic and copper in kidney of mice：Crosstalk between Nrf2/ Keap1 pathway in apoptosis and pyroptosis［J］. Ecotoxicol Environ Saf， 2023， 266：115542.

［14］ WEIR JR R J， FISHER R S. Toxicologic studies on borax and boric acid［J］. Toxicol Appl Pharmacol， 1972， 23（3）：351-364.

［15］ 王靳琎， 李雪瑩， 易進科， 等. 硼酸鈉對小鼠的急性毒性實驗研究［J］. 中國醫(yī)藥科學， 2023， 13（9）：22-25， 66.

WANG J J， LI X Y， YI J K， et al. Experimental study on the acute toxicity of sodium borate to mice［J］. China Medicine and Pharmacy， 2023， 13（9）：22-25， 66. （in Chinese）

［16］ 王行智， 張 文， 陳 婷， 等. 微波消解ICP-MS/MS測定畜禽表皮組織17種無機元素［J］. 食品工業(yè)， 2023， 44（2）：272-276.

WANG X Z， ZHANG W， CHEN T， et al. Determination of 17 inorganic elements in livestock and poultry epidermal tissue by microwave ICP-MS/MS［J］. The Food Industry， 2023， 44（2）：272-276. （in Chinese）

［17］ 尹玉霞. 硼泥的環(huán)境問題及資源化利用［J］. 中國資源綜合利用， 2020， 38（2）：72-75.

YIN Y X. Environmental problems and comprehensive utillization of boron mud［J］. China Resources Comprehensive Utilization， 2020， 38（2）：72-75. （in Chinese）

［18］ 杜 鵬， 韓京秀， 董少霞， 等. 硼的健康風險研究進展［J］. 環(huán)境衛(wèi)生學雜志， 2015， 5（2）：177-183.

DU P， HAN J X， DONG S X， et al. Research progress in health risks of boron［J］. Journal of Environmental Hygiene， 2015， 5（2）：177-183. （in Chinese）

［19］ 高小凈， 孫愛德， 張 旭， 等. 硼肥施用對辣椒果實中硼累積效果的影響［J］. 安徽農(nóng)學通報， 2023， 29（18）：17-20.

GAO X J， SUN A D， ZHANG X， et al. Effect of borax application on boron accumulation in capsicum fruit［J］. Anhui Agricultural Science Bulletin， 2023， 29（18）：17-20. （in Chinese）

［20］ 趙春芳， 金吉雄， 張夢玲， 等. 硼上調皖西白鵝產(chǎn)蛋期卵巢IGFBP3、DRD2和CDK1基因表達［J］. 安徽科技學院學報， 2022， 36（1）：1-6.

ZHAO C F， JIN J X， ZHANG M L， et al. Effect of boron on gene expression of IGFBP3， DRD2 and CDK1 in ovary of Wanxi white geese during laying period［J］. Journal of Anhui Science and Technology University， 2022， 36（1）：1-6. （in Chinese）

［21］ 趙春芳， 陳 寧， 張 路， 等. 硼對皖西白鵝產(chǎn)蛋期下丘腦中GRB2、HSP70和AMPK基因表達的影響［J］. 皖西學院學報， 2022， 38（2）：8-12.

ZHAO C F， CHEN N， ZHANG L， et al. Effect of boron on of GRB2， HSP70 and AMPK mRNA expression in the hypothalamus of Wanxi white geese during laying period［J］. Journal of West Anhui University， 2022， 38（2）：8-12. （in Chinese）

［22］ 丁永旺， 任 曼， 趙春芳， 等. 硼對大鼠肝臟顯微結構、肝糖原含量、抗氧化功能及細胞增殖和凋亡相關基因表達的影響［J］. 動物營養(yǎng)學報， 2022， 34（3）：1963-1974.

DING Y W， REN M， ZHAO C F， et al. Effects of boron on microstructure， hepatic glycogen content， antioxidant function， cell proliferation and apoptosis related gene expression in liver of rats［J］. Chinese Journal of Animal Nutrition， 2022， 34（3）：1963-1974. （in Chinese）

［23］ ZHANG Q， HE X， YU Q， et al. Endoplasmic reticulum stress regulates pyroptosis in BPDE-induced BEAS-2B cells［J］. Environ Toxicol， 2022， 37（7）：1768-1780.

［24］ 雷 倩， 易 燾， 陳 燦. 細胞焦亡效應機制及相關疾病研究進展［J］. 醫(yī)學研究生學報， 2017， 30（6）：648-652.

LEI Q， YI T， CHEN C. Research progresses of the effective mechanism of pyroptosis and its related diseases［J］. Journal of Medical Postgraduates， 2017， 30（6）：648-652. （in Chinese）

［25］ MCKENZIE B A， MAMIK M K， SAITO L B， et al. Caspase-1 inhibition prevents glial inflammasome activation and pyroptosis in models of multiple sclerosis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2018， 115（26）：E6065-E6074.

［26］ DE CARVALHO RIBEIRO M， SZABO G. Role of the inflammasome in liver disease［J］. Annu Rev Pathol， 2022， 17：345-365.

［27］ CHANG Y， ZHU J， WANG D， et al. NLRP3 inflammasome-mediated microglial pyroptosis is critically involved in the development of post-cardiac arrest brain injury［J］. J Neuroinflammation， 2020， 17（1）：219.

［28］ ZHANG Z H， BAI H， MA X Y， et al. Blockade of the NLRP3/caspase-1 axis attenuates ketamine-induced hippocampus pyroptosis and cognitive impairment in neonatal rats［J］. J Neuroinflammation， 2021， 18（1）：239.

［29］ JU J， LIU Y Y， LIANG H H， et al. The role of pyroptosis in endothelial dysfunction induced by diseases［J］. Front Immunol， 2023， 13：1093985.

［30］ ZHANG C Y， LIN T J， NIE G H， et al. Cadmium and molybdenum co-induce pyroptosis via ROS/PTEN/PI3K/AKT axis in duck renal tubular epithelial cells［J］. Environ Pollut， 2021， 272：116403.

［31］ HENAO-MEJIA J， ELINAV E， THAISS C A， et al. Inflammasomes and metabolic disease［J］. Annu Rev Physiol， 2014， 76（1）：57-78.

［32］ 廖建昭， 楊 帆， 裴若男， 等. 銅通過活性氧誘導雞肝細胞發(fā)生焦亡［J］. 中國獸醫(yī)學報， 2018， 38（12）：2374-2378.

LIAO J Z， YANG F， PEI R N， et al. Copper induces pyroptosis by generating ROS in chicken hepatocyte［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2018， 38（12）：2374-2378. （in Chinese）

（編輯 白永平）