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    肉制品中沙門氏菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

    2017-05-18 17:11於穎顧其芳陳敏張紅芝
    上海預(yù)防醫(yī)學(xué) 2017年4期
    關(guān)鍵詞:沙門氏菌肉制品

    於穎+顧其芳+陳敏+張紅芝

    摘要:目的 制備用于檢測(cè)肉制品中沙門氏菌熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。方法 設(shè)計(jì)針對(duì)沙門氏菌invA基因的引物,擴(kuò)增特異片段,轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,進(jìn)行優(yōu)化后的實(shí)時(shí)熒光定量PCR,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,并考察該標(biāo)準(zhǔn)品靈敏性及穩(wěn)定性。結(jié)果 成功構(gòu)建含有沙門氏菌invA基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用其建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值(Ct值)與模板的拷貝數(shù)呈良好線性關(guān)系(r2=0.9979),最低可以檢出10 拷貝/反應(yīng)。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒經(jīng)驗(yàn)證具有良好的穩(wěn)定性。用該質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌,經(jīng)2h增菌后,可在7h內(nèi)完成對(duì)樣本的檢測(cè)。結(jié)論 所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品可用于熒光定量PCR檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌,為考量實(shí)驗(yàn)質(zhì)量提供參考依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;熒光定量PCR;沙門氏菌;肉制品;

    當(dāng)前,微生物污染引起的食源性疾病已引發(fā)人們的普遍關(guān)注和深入研究。在各類食源性病原菌及危害因子中,沙門氏菌是主要致病因子[1]。根據(jù)我國統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,由沙門氏菌導(dǎo)致的食源性疾病占總數(shù)的10.2%,且以肉制品受污染居多[2,3]。建立有效手段快速檢測(cè)肉制品中沙門氏菌,對(duì)防控和監(jiān)測(cè)這類食源性疾病意義重大。

    熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法可快速并靈敏地對(duì)沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè),而擁有可靠的標(biāo)準(zhǔn)品保證了檢測(cè)的穩(wěn)定和可重復(fù)性[4]。目前,獲得熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品的方法有許多,包括菌液提取模板DNA、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、PCR擴(kuò)增目的片段割膠純化以及構(gòu)建含與目的基因片段相同序列的重組質(zhì)粒等,其中以質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品最為穩(wěn)定,且制備簡(jiǎn)單,使用方便。本研究選擇質(zhì)粒作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品,設(shè)計(jì)選取了沙門氏菌invA基因特異性片段,將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,以此保證快速、準(zhǔn)確檢測(cè)肉制品中沙門氏菌,為快速檢測(cè)該致病菌導(dǎo)致的食源性疾病提供技術(shù)依據(jù)。

    1.材料和方法

    1.1材料和試劑

    1.1.1試驗(yàn)菌株

    本實(shí)驗(yàn)采用菌株:鼠傷寒沙門氏菌(ATCC 14028)、阪崎腸桿菌(ATCC 51329)、大腸埃希菌(ATCC 25922)、副溶血弧菌(ATCC 17802)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)、宋內(nèi)志賀菌(ATCC 11060)、創(chuàng)傷弧菌(總18-85)、小腸結(jié)腸耶爾森菌(Y1)。ATCC菌株購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心,其余菌株為本實(shí)驗(yàn)室收集、鑒定、編號(hào)并保存的菌株。

    1.1.2主要試劑和儀器

    LB培養(yǎng)液(上海市疾病預(yù)防控制中心試劑供應(yīng)研究中心);mericon DNA Bacteria Kit(Qiagen公司);pMD? 18-T Vector Cloning Kit、大腸埃希菌DH5α感受肽細(xì)胞(日本TaKaRa公司);TaqMan? Environmental Master Mix 2.0,ABI 7900HT熒光定量PCR儀(美國lifetechnologies公司);NanoDrop2000核酸蛋白儀(賽默飛世爾科技(上海)有限公司)。

    1.2方法

    1.2.1引物設(shè)計(jì)和探針制備

    根據(jù)GenBank公布的沙門氏菌invA基因(GenBank: M90846.1)的高保守序列[5],利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7設(shè)計(jì)引物、探針,并用BLAST檢查序列的特異性。引物序列為:invA-F:5-TCTACATTGACAGAAT-3,invA-R:5- CGAACGTGGCGATAATTTC-3;探針序列:invA-P:5'-FAM-CAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAAT-TAMRA-3',克隆質(zhì)粒擴(kuò)增引物:invA-S:5-CGGCAATAGCGTCACCTT-3,invA-AS:5-AGTGCTCGTTTACGACCTG-3。由生物工程(上海)有限公司合成。

    1.2.2細(xì)菌DNA提?。?/p>

    按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的說明書提取模板DNA。DNA模板保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:

    對(duì)加入模板DNA、引物、探針的量進(jìn)行優(yōu)化,并選擇最佳退火溫度。在20 μL反應(yīng)體系中, TaqMan? Environmental Master mix10 μL,引物invA-F和invA-R終濃度為0.75 μM,探針invA-P終濃度為0.2 μM ,模板DNA2 μL,ddH2O補(bǔ)足至反應(yīng)總體積。反應(yīng)條件:95℃變性5s,60℃退火30s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行。用SDS2.4軟件(Life technologies)分析結(jié)果。

    1.2.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備:

    用invA-S和invA-AS引物擴(kuò)增PCR產(chǎn)物電泳以后用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物片段,再連接到pMD18-T載體后,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受肽細(xì)胞中,篩選陽性克隆菌落,經(jīng)PCR及測(cè)序(生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序)來鑒定片段序列。

    1.2.5重組質(zhì)粒熒光定量PCR檢測(cè):

    將所制備的重組質(zhì)粒與8株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),其中鼠傷寒沙門氏菌為陽性對(duì)照,其他7株非沙門氏菌(阪崎腸桿菌、大腸埃希菌、副溶血弧菌、銅綠假單胞菌、宋內(nèi)志賀菌、創(chuàng)傷弧菌、小腸結(jié)腸耶爾森菌等)為陰性對(duì)照,以檢驗(yàn)所制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品含有沙門氏菌invA基因特異序列。

    1.2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    提取質(zhì)粒DNA,用核酸蛋白儀測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度,換算成基因的拷貝數(shù)。將制備的重組質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋至10-3~10-10,作為標(biāo)準(zhǔn)模板溶液,進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):

    將重組質(zhì)粒置-20℃冷凍保存6個(gè)月,分別在每個(gè)月取出稀釋至100、10-3、10-6進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),考察質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性。

    1.2.8肉制品樣本的檢測(cè)

    采集市售肉制品樣本35份,稱取25g剪碎后加入225mL 胰大豆肉湯培養(yǎng)基,置37℃增菌2h。吸取待測(cè)樣本1mL于離心管中,經(jīng)13000×g離心5分鐘,吸棄上清,再加入1mL滅菌去離子水重懸沉淀[6]。隨后提取DNA,進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。同時(shí)與培養(yǎng)分離方法作對(duì)照。

    2. 結(jié) 果

    2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建結(jié)果

    將構(gòu)建的重組質(zhì)粒提取DNA得到沙門氏菌的質(zhì)粒DNA,長(zhǎng)度為577bp。將測(cè)序結(jié)果與Genbank中沙門氏菌invA基因序列進(jìn)行BLAST比對(duì),符合率達(dá)100%。(見圖1)經(jīng)測(cè),質(zhì)粒DNA的濃度為78 ng/μL,轉(zhuǎn)換得到質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的原始濃度為2.0×1010 copies/μL。

    2.2 重組質(zhì)粒熒光定量PCR分析:

    對(duì)已構(gòu)建的重組質(zhì)粒和8株菌株進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果見圖2。重組質(zhì)??墒占矫黠@的熒光信號(hào),Ct值為18.64。陽性對(duì)照菌株(鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株)也可見明顯熒光擴(kuò)增信號(hào)指數(shù)期,Ct值為20.23。其他菌株作為陰性對(duì)照均未見明顯擴(kuò)增信號(hào)。由此可見,成功構(gòu)建含有沙門氏菌invA基因特異序列的重組質(zhì)粒。

    2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:

    將重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋,制成1×101~1×108 copies/反應(yīng)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。由拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值和Ct值對(duì)應(yīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)與Ct值之間存在對(duì)應(yīng)線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)r?=0.9979,斜率為-3.2548,PCR的擴(kuò)增效率為102.88%在可接受范圍內(nèi),且方法誤差較小,最低可以檢出10 copies/反應(yīng)的沙門氏菌。

    2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:

    將保存1-6個(gè)月的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品取出,分別對(duì)經(jīng)稀釋后1010、107、104濃度水平的質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)Ct值,由表1可知,構(gòu)建的重組質(zhì)粒在6個(gè)月內(nèi)測(cè)定值無顯著差異。

    2.5 肉制品樣本的檢測(cè)

    對(duì)35份樣本分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和分離培養(yǎng)方法的檢測(cè),結(jié)果均檢出有3份樣品受沙門氏菌污染。由建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線上可得知,三份樣本的細(xì)菌濃度分別為2.4×106copies/μL 、4.3×105copies/μL和1.1×106copies/μL。對(duì)比兩種方法,本研究方法在7小時(shí)內(nèi)便能得到檢測(cè)結(jié)果,而傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法需4-5天(見表2)。

    3. 討 論

    沙門氏菌是污染肉制品的主要致病菌之一,我國是肉制品消費(fèi)大國,沙門氏菌污染造成的危害更為嚴(yán)重。目前對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)主要還是通過培養(yǎng)和分離鑒定,但傳統(tǒng)方法所需時(shí)間較長(zhǎng),且需花費(fèi)大量人力、物力,使用TaqMan探針進(jìn)行的熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)因其靈敏、快速、特異性等優(yōu)點(diǎn)受到研究者的親睞[7-9]。在熒光定量PCR反應(yīng)中,利用一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)測(cè)得的Ct值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,再將目的樣本基因的檢測(cè)結(jié)果在標(biāo)準(zhǔn)曲線上進(jìn)行判讀,從而獲得靶基因的量。穩(wěn)定的標(biāo)準(zhǔn)品為熒光定量PCR提供了可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線,而同樣的反應(yīng)條件使樣本基因與標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的擴(kuò)增效率,同時(shí)也減少了樣本模板基因抽提對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。因此,要保證檢測(cè)結(jié)果的一致性和可重復(fù)性必須構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的標(biāo)準(zhǔn)品。質(zhì)粒具有環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu),將其作為標(biāo)準(zhǔn)品可長(zhǎng)期保存,具有良好的穩(wěn)定性[10]。相較于菌液提取DNA模板,無須多次制作,減少了每次實(shí)驗(yàn)的步驟,且保證初始濃度一致,使用更為便捷。

    本研究沙門氏菌invA基因?yàn)榛A(chǔ),選擇特異性片段,該基因主要編碼沙門氏菌吸附和侵襲上皮細(xì)胞的表面蛋白——侵襲蛋白,并決定其致病能力,且是沙門氏菌A-E群中高度保守基因 [11-12]。通過設(shè)計(jì)了引物和探針,對(duì)特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增,并轉(zhuǎn)入質(zhì)粒載體。經(jīng)測(cè)序與GenBank中invA基因進(jìn)行比對(duì),符合率達(dá)到100%。經(jīng)熒光定量PCR試驗(yàn),結(jié)果呈陽性,證明成功構(gòu)建了含有invA基因特異片段的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。由其建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,Ct值與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈現(xiàn)理想的線性關(guān)系,最低能檢測(cè)10 copies/反應(yīng)。通過穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,不同保存時(shí)間的克隆質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定,可作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品,且適合長(zhǎng)期使用。

    使用所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)35份肉制品樣本進(jìn)行的檢測(cè),在2h增菌以后,結(jié)果顯示與傳統(tǒng)方法結(jié)果的符合率一致,并將檢測(cè)時(shí)間從原來的4-5天縮短至7小時(shí),大大提高了檢測(cè)的時(shí)效。

    綜上所述,使用本研究建立的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光定量PCR可幫助快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)肉制品中的沙門氏菌,且操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定。尤其在應(yīng)對(duì)感染性腹瀉等突發(fā)群體事件時(shí),可快速篩查病原菌,縮短響應(yīng)時(shí)間,為保障食品安全,加強(qiáng)現(xiàn)場(chǎng)處置及時(shí)提供準(zhǔn)確依據(jù)。

    4. 參考文獻(xiàn)

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