兒童肺炎支原體感染三種實驗診斷方法評價

趙志偉　宋曼莉

【摘要】 目的：探討兒童肺炎支原體感染的快速、簡便、有效的臨床實驗室診斷方法。方法：對2016年12月收集的200例臨床呼吸道感染患兒的咽拭子和靜脈血樣本進(jìn)行肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)鏡檢、抗體檢測、抗原檢測及熒光定量PCR（Polymerase chain reaction）分析。以快速培養(yǎng)鑒定鏡檢法為診斷肺炎支原體感染金標(biāo)準(zhǔn)，比較抗體檢測、抗原檢測及熒光定量PCR三種診斷方法的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)（正確診斷指數(shù)）。結(jié)果：抗體檢測的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)分別為76.3%、77.9%、54.2%；抗原檢測為37.7%、89.5%、27.2%；熒光定量PCR為93.0%、96.5%、89.5%。熒光定量PCR法的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)均高于抗體檢測和抗原檢測法（P<0.05），三者Youden指數(shù)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：熒光定量PCR具有較高的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)，可以在未來替代快速鑒定培養(yǎng)鏡檢、抗體檢測和抗原檢測法，作為臨床診斷兒童肺炎支原體感染的快速、簡便而有效的實驗室診斷方法。

【關(guān)鍵詞】 肺炎支原體； 抗體檢測； 抗原檢測； 熒光定量PCR

【Abstract】 Objective：To explore the fast，simple and effective method to clinical diagnosis of mycoplasma pneumonia infection of children.Method：Throat swabs and venous blood samples were obtained from 200 children with respiratory infection，these samples were tested by rapid identification culture and microscopy，antibody detection，antigen detection，fluorescence quantitative PCR in December 2016.Rapid identification culture and microscopy was set as the diagnostic “gold standard”，sensitivity，specificity and youden index of three methods were compared.Result：The sensitivity，specificity and youden index of antibody detection were respectively 76.3%，77.9% and 54.2%；antigen detection were respectively 37.7%，89.5% and 27.2%；fluorescence quantitative PCR were respectively 93.0%，96.5% and 89.5%.The sensitivity，specificity and youden index of fluorescence quantitative PCR were higher than those of antibody detection and antigen detection（P<0.05），compared youden index of three methods，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The sensitivity，specificity and Youden index of fluorescence quantitative PCR are higher，it can take the place of rapid identification culture and microscopy，antibody detection and antigen detection in the future，and it is a rapid，convenient and effective laboratory diagnosis method to clinical diagnosis Mycoplasma pneumoniae infection of children.

【Key words】 Mycoplasma pneumoniae； Antibody detection； Antigen detection； Fluorescence quantitative PCR

First-authors address：Haicang Hospital of Xiamen，Xiamen 361026，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.25.017

肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間，缺乏細(xì)胞壁，能利用人工培養(yǎng)基生長繁殖的原核細(xì)胞型微生物，是人類支原體肺炎（M.pneumoniae pneumonia，MPP）的病原體。MP主要經(jīng)飛沫傳播，潛伏期2～3周，易感人群主要為兒童和青少年[1-3]。國內(nèi)外多項研究表明，MP的感染發(fā)病率從0.6%～47%不等，占兒童社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）病原體的70%左右。隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，其耐藥性有所增加，甚至出現(xiàn)了耐藥株。有效而靈敏的實驗室診斷方法是診斷MP感染的主要依據(jù)。目前，國內(nèi)大多醫(yī)院對MP感染的診斷，依舊停留在典型的臨床感染癥狀結(jié)合血常規(guī)及MP抗體檢測或MP培養(yǎng)進(jìn)行診斷的水平。近年來，熒光定量PCR（Fluorescencd quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）和抗原檢測診斷MP感染雖已在臨床科研中少量使用，但大多醫(yī)院并未廣泛應(yīng)用[4-6]。在國外，PCR基因診斷已作為臨床診斷的一種常用手段，以FQ-PCR為主。endprint

本研究采用MP快速鑒定培養(yǎng)鏡檢、ELISA抗原檢測、被動凝集抗體檢測和FQ-PCR對2016年12月收治的200例患兒進(jìn)行MP檢測，并以快速鑒定培養(yǎng)鏡檢為MP感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)對抗體檢測、抗原檢測、FQ-PCR三種方法進(jìn)行方法學(xué)評價，探討適合MP感染早期快速、簡便而有效的診斷方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2016年12月就診于廈門市海滄醫(yī)院兒科的0～10歲未使用抗菌藥物治療的CAP患兒，且在發(fā)病前三個月內(nèi)無呼吸道感染癥狀或血常規(guī)及胸片等相關(guān)檢查不支持呼吸道感染。男100例，女100例，男∶女=1∶1，平均年齡（4.87±1.21）歲。CAP診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會2006年制定的診斷和治療指南標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 儀器和試劑 （1）ABI7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國ABI公司）；（2）KDC-2046臺式低溫離心機（中國科大創(chuàng)新公司）；（3）超低溫冰箱（日本SANYO公司）；（4）恒溫培養(yǎng)箱（德國賀利氏公司）；（5）酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；（6）洗板機（上海新波生物技術(shù)有限公司）；（7）生物安全柜（中國東聯(lián)哈爾公司）；（8）平板混合器（江蘇金壇儀器廠）；（9）光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；（10）肺炎支原體抗體（MP-Ab）檢測試劑盒（日本富士瑞必歐公司）；（11）人肺炎支原體抗原（MP-Ag）檢測試劑盒（上海卡邁舒生物科技公司）；（12）肺炎支原體快速鑒定培養(yǎng)試劑盒（陜西百盛園生物科技公司）；（13）肺炎支原體核酸檢測試劑盒（杭州艾康生物技術(shù)公司）；（14）革蘭染色液試劑盒（英國貝索公司）。

1.3 方法 對初次就診的200例呼吸道感染患兒采集的雙份咽拭子分別進(jìn)行MP快速鑒定培養(yǎng)鏡檢和FQ-PCR，在患兒出現(xiàn)臨床癥狀1周后，抽取靜脈血進(jìn)行抗原檢測和抗體檢測。

1.4 觀察指標(biāo) 采用前瞻性實驗性研究，以快速鑒定培養(yǎng)鏡檢為診斷MP感染金標(biāo)準(zhǔn)，通過靈敏度、特異度和Youden指數(shù)來評價抗體檢測、抗原檢測和FQ-PCR三種實驗室方法的診斷價值。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；Youden指數(shù)=靈敏度+特異度-1。

1.5 質(zhì)量控制 以標(biāo)準(zhǔn)株MP129為陽性對照，復(fù)溶后培養(yǎng)基為陰性對照。每批測試均設(shè)陰陽性對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用U檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 200例患兒實驗室檢查結(jié)果 MP快速鑒定培養(yǎng)鏡檢114例（57.0%），F(xiàn)Q-PCR法109例（54.5%），抗原檢測52例（26.0%），抗體檢測106例（53.0%），見表1。

2.2 三種實驗室診斷方法靈敏度、特異度和Youden指數(shù)比較 FQ-PCR法靈敏度、特異度和Youden指數(shù)均高于MP-Ab和MP-Ag法（P<0.05）。MP-Ab法具有適中的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)，而MP-Ag法雖具有較高的特異度，但其靈敏度和Youden指數(shù)在三種方法中最低，見表2。

3 討論

呼吸道感染是兒童時期最為常見的一種疾病，是導(dǎo)致兒童死亡的主要病因[7]。在引起呼吸系統(tǒng)感染的致病菌中，肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是最為常見的一種病原體，流行病學(xué)研究顯示有50%左右的社區(qū)獲得性肺炎（Community-acquired pneumonia，CAP）都是由MP感染引起的[8]。兒童是MP感染的高危人群，多數(shù)臨床研究表明，MP感染不僅可引起急重型的雙側(cè)肺炎及哮喘，還可導(dǎo)致肝功能損傷、免疫性溶血性貧血、腦膜炎、胸膜炎、心肌心包炎、腎炎等多種肺外并發(fā)癥，且兒童免疫力低，語言表達(dá)差，病程發(fā)展有時難以預(yù)料，嚴(yán)重時可引起多臟器功能衰竭，甚至危及生命[9-10]。MP感染很難從臨床表現(xiàn)及癥狀方面與細(xì)菌、衣原體、病毒等其他病原體感染進(jìn)行鑒別，而MP感染在臨床治療上與其他病原感染治療方案又有所不同，因此針對兒童MP感染的早期快速診斷顯得尤為重要。

MP的實驗室診斷還存在診斷標(biāo)準(zhǔn)不一，缺乏敏感且特異的診斷方法等問題。傳統(tǒng)的MP培養(yǎng)被認(rèn)為是診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但MP分離培養(yǎng)營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)時間長，相對不敏感，已不適于臨床對MP的快速診斷要求，近年來出現(xiàn)了改良的MP快速鑒定培養(yǎng)，此方法最快可在24 h得到初步檢測結(jié)果，但需要排除細(xì)菌及真菌引起的假陽性結(jié)果。目前，臨床應(yīng)用較廣的實驗室診斷方法是MP抗體檢測，雖然MP抗原檢測已出現(xiàn)商品化試劑盒，但其還未完全成熟，至今未大量應(yīng)用于臨床。FQ-PCR對MP檢測近年來在國內(nèi)少數(shù)大型醫(yī)院得到應(yīng)用，是診斷MP感染的新技術(shù)之一，具有特異性好，靈敏度高，快速簡便的優(yōu)點[11-15]。

本研究以MP快速鑒定培養(yǎng)結(jié)合鏡檢排除假陽性結(jié)果做為診斷MP感染的金標(biāo)準(zhǔn)，對抗體檢測、抗原檢測和FQ-PCR三種MP診斷方法進(jìn)行方法學(xué)評價。200例呼吸道感染患兒的檢測結(jié)果顯示，針對血清樣本的MP抗原檢測靈敏度和Youden指數(shù)低于抗體檢測和FQ-PCR法，其原因除MP抗原檢測方法本身敏感性低外，還與病原體侵入血流后易被清除，致使最佳抗原檢測時期不易掌握，以及多數(shù)情況下MP感染僅侵犯呼吸道黏膜而未侵入血流有關(guān)。但血樣本MP抗原檢測陽性對MP診斷和治療具有重要意義，是病原體已侵入血流的標(biāo)志，故可以作為衡量疾病發(fā)展嚴(yán)重程度的一個指標(biāo)，故對臨床治療具有一定的指導(dǎo)作用[16-18]。

MP抗體檢測法靈敏度、特異度和Youden指數(shù)較FQ-PCR法低，但在靈敏度和Youden指數(shù)上高于抗原檢測法，主要原因可能為MP感染多起病緩慢，潛伏期達(dá)2～3周，而且兒童個體間的機體免疫狀態(tài)存在差異，多數(shù)患兒在MP感染1周后，血清抗體效價能達(dá)到陽性水平，且多在15 d達(dá)到高峰，但還有部分患兒抗體效價升高緩慢或不升高，達(dá)不到陽性檢出水平。因此，抗體檢測法對MP感染早期患兒以及免疫系統(tǒng)發(fā)育缺陷和未成熟的嬰幼兒，由于相應(yīng)抗體未產(chǎn)生或產(chǎn)生少而使檢測結(jié)果常呈現(xiàn)陰性，已難以滿足臨床對急重性MP感染患兒早期、快速診斷的需要?？贵w檢測法對臨床實驗室設(shè)備、技術(shù)條件及人員素質(zhì)要求不高，亦可診斷MP既往感染，以其適中的敏感度（76.3%）、特異度（77.9%）和Youden指數(shù)（54.2%），在臨床應(yīng)用中仍然具有很高的診斷價值。且此方法與FQ-PCR法相比試劑成本低，非常適合于MP感染的常規(guī)篩查，其檢測結(jié)果也得到醫(yī)務(wù)人員和患者家屬的接受和認(rèn)可，故現(xiàn)階段還無法在短期內(nèi)被全面取代。目前，在國內(nèi)大中醫(yī)院中，抗體檢測仍是應(yīng)用最為廣泛的診斷MP感染的實驗室方法。endprint

FQ-PCR法的靈敏度、特異度和Youden指數(shù)均高于MP抗原檢測和抗體檢測，分別達(dá)到93.0%、96.5%和89.5%。分析其原因，主要是因為FQ-PCR法與培養(yǎng)法同是直接對呼吸道黏膜表面的病原體進(jìn)行檢測，且所需樣本量少，檢測量可達(dá)到1×103/mL[19]。本研究中FQ-PCR法出現(xiàn)8例假陰性結(jié)果，分析原因可能為：（1）采集患兒咽拭樣本時，由于患兒存在恐懼心理不配合采樣致樣本采集存在量的差異；（2）樣本在運輸及檢測操作過程存在人為誤差造成假陰性結(jié)果。同時本法還出現(xiàn)了3例假陽性結(jié)果，分析原因可能為：（1）樣本采集、運輸及處理過程中的操作誤差所造成的差異性；（2）FQ-PCR法是對MP進(jìn)行核酸檢測，無論病原體死活均可檢出，而培養(yǎng)法僅能對活體進(jìn)行檢測。

相對于傳統(tǒng)的MP培養(yǎng)法以及近年來改良的快速培養(yǎng)法，F(xiàn)Q-PCR法可以對MP進(jìn)行快速、微量檢測，4 h內(nèi)即可發(fā)出檢測報告。相對于抗體檢測、抗原檢測等血清學(xué)方法又具有靈敏度高，特異性好的優(yōu)點，MP感染早期即可進(jìn)行明確而有效的診斷，對MP攜帶和隱性感染者具有較高的檢出率，非常適合兒童急重性MP感染早期的臨床診斷[20]。

正因為FQ-PCR法具有在MP感染早期即可做出快速、及時、準(zhǔn)確診斷的優(yōu)點，大大簡化了診療程序，使MP感染患兒特別是急重性患兒能夠得到及時有效的確診并治療，從而減少了患兒病發(fā)癥的發(fā)生，縮短了病程。目前此方法試劑成本較高，在一定程序上限制了其在臨床中的推廣應(yīng)用，但隨著技術(shù)的成熟及在國內(nèi)醫(yī)療機構(gòu)的普及，其成本會逐漸降低并為患者家屬所接受，并最終替代血清學(xué)方法和培養(yǎng)法作為MP感染更快速、簡便而有效的實驗室診斷方法。

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（收稿日期：2017-05-11） （本文編輯：鄧朝陽）endprint