17β-雌二醇調(diào)控大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移能力的機(jī)制研究

吳　迪，彭召紅，辛俊池，王莉莉

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·論著·

17β-雌二醇調(diào)控大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移能力的機(jī)制研究

吳迪，彭召紅，辛俊池，王莉莉*

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，沈陽 110004

[摘要]目的研究17β-雌二醇對(duì)大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用及機(jī)制。方法L6GNR4細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM高糖增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中添加10 nM雌激素17β雌二醇和/或50 nM雌激素競爭性拮抗劑Tamoxifen。應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)在藥物處理后0、12、24 h觀察17β雌二醇對(duì)成肌細(xì)胞遷移能力的影響。在藥物處理24 h后，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測各組細(xì)胞中雌激素受體α和β的表達(dá)。同時(shí)還檢測了成肌細(xì)胞遷移相關(guān)關(guān)鍵基因(Pax3、Fhl1以及Fhl1相互作用蛋白Actg1、Myh10)在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果與對(duì)照組比較，17β-雌二醇在劃痕24 h時(shí)可以明顯抑制L6GNR4的細(xì)胞遷移。17β-雌二醇能夠明顯抑制ERβ的表達(dá)，而雌激素競爭性拮抗劑Tamoxifen能夠部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)ERβ的抑制作用。17β-雌二醇能夠明顯抑制成肌細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵因子Pax3、Fhl1以及Fhl1相互作用蛋白Myh10的表達(dá)，而雌激素競爭性拮抗劑Tamoxifen能夠逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)Pax3、Fhl1和Myh10的轉(zhuǎn)錄抑制作用。相同濃度的雌激素對(duì)L6GNR4細(xì)胞中Actg1的表達(dá)改變不明顯。結(jié)論雌激素17β-雌二醇通過ERβ轉(zhuǎn)錄抑制Pax3、Fhl1以及Fhl1的相互作用蛋白Myh10的表達(dá)，發(fā)揮其抑制大鼠成肌細(xì)胞遷移的作用。

[關(guān)鍵詞]17β-雌二醇；L6GNR4成肌細(xì)胞；細(xì)胞遷移

0　引言

骨骼肌組織是人體含量最多的肌肉組織，其構(gòu)成和大小存在著明顯的性別差異。雌激素(17β-estradiol，E2)與雌激素受體(Estrogen receptor，ER)的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域-雌激素受體反應(yīng)元件結(jié)合后，發(fā)揮其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的作用[1]。骨骼肌表達(dá)雌激素受體ERα和ERβ[2]。因此，雌激素可能在胚胎期肌肉發(fā)生、出生后骨骼肌發(fā)育以及骨骼肌損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。肌肉發(fā)生指在胚胎發(fā)育過程中，體節(jié)細(xì)胞經(jīng)過一系列增殖、遷移和分化，最終形成肌肉組織的過程[3]。①由胚胎的體節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞決定(分化方向)，并分化為成肌細(xì)胞。②成肌細(xì)胞向胚胎肢芽遷移并保持增殖能力。③成肌細(xì)胞停止分裂，彼此融合成多核體細(xì)胞，并表達(dá)肌纖維特異性的肌球蛋白，使其分化為成熟的骨骼肌細(xì)胞。肌肉發(fā)生還包括了成體肌肉干細(xì)胞-骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、分化、融合和成熟等過程。機(jī)體遇到肌肉損傷等刺激時(shí)，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，增殖并分化為成肌細(xì)胞。這些細(xì)胞再分化并融合進(jìn)已存在的骨骼肌纖維中，或者彼此融合，形成新的肌纖維。L6GNR4細(xì)胞是來自大鼠骨骼肌的成肌細(xì)胞，其作為研究胚胎期肌肉發(fā)生和骨骼肌損傷修復(fù)的工具細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。目前，有關(guān)雌激素對(duì)成肌細(xì)胞遷移功能的影響的相關(guān)研究很少。因此，本研究應(yīng)用17β-雌二醇處理大鼠L6GNR4成肌細(xì)胞，觀察其對(duì)成肌細(xì)胞遷移能力的影響及可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料L6GNR4大鼠成肌細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，17β雌二醇和雌激素競爭性拮抗劑Tamoxifen購自Sigma公司，定量PCR相關(guān)試劑購自TAKARA公司，細(xì)胞培養(yǎng)用血清和培養(yǎng)基等購自Gibco公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)L6GNR4細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM高糖增殖培養(yǎng)基中，后者添加雌激素17β雌二醇和/或雌激素競爭性拮抗劑Tamoxifen。每組細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。根據(jù)Ogawa等[4]報(bào)道，本研究在成肌細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10 nM 17β雌二醇和50 nM Tamoxifen。

1.3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)接種前用marker筆在6孔板背面畫橫線標(biāo)記，拍照時(shí)定位同一個(gè)視野。每組細(xì)胞消化后接入6孔板，細(xì)胞長滿板底后，用20 μL槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，不同時(shí)間點(diǎn)拍照記錄。

1.4定量PCR用TRIZOL試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。用反轉(zhuǎn)錄酶和Olingo (dT) 20引物合成cDNA。定量PCR的引物序列見表1。在定量PCR過程中，每個(gè)基因重復(fù)擴(kuò)增3次，基因的相對(duì)表達(dá)水平應(yīng)用2-△△ct方法計(jì)算。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠分離并拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 10.0軟件統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞間基因表達(dá)水平是否存在差異。

2　結(jié)果

2.117β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)觀察24 h 17β-雌二醇對(duì)大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4遷移能力的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，17β-雌二醇在劃痕24 h時(shí)，可以明顯抑制L6GNR4的細(xì)胞遷移(見圖1)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。2.217β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中ERβ的表達(dá)大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中，有雌激素受體ERα和ERβ的表達(dá)，并且以ERβ為主(ERα相對(duì)表達(dá)水平為1時(shí)，ERβ的相對(duì)表達(dá)水平為3.05±0.55)。各組細(xì)胞ERα的相對(duì)表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未顯示)。對(duì)照組、E2組、Tam組、E2+Tam組細(xì)胞ERβ的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.99±0.005、0.17±0.09、0.78±0.02、0.38±0.01。結(jié)果顯示，17β-雌二醇能夠明顯抑制ERβ的表達(dá)(對(duì)照組 vs.E2組，P=0.0020)，而Tamoxifen能夠部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)ERβ的抑制作用(E2組 vs.E2+Tam組，P=0.0199)。

圖1　17β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移

2.317β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因的表達(dá)為了探索17β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4細(xì)胞遷移的機(jī)制，對(duì)成肌細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵因子Pax3和Fhl1以及Fhl1相互作用蛋白Actg1、Myh10在各組細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平[4]。Pax3相對(duì)表達(dá)水平：對(duì)照組1.00±0.09，E2組0.51±0.05，Tam組1.20±0.06，E2+Tam組1.21±0.03(對(duì)照組 vs.E2組，P=0.000 1；E2組 vs.E2+Tam組，P=0.002 7)。Fhl1的相對(duì)表達(dá)水平：對(duì)照組1.00±0.12，E2組0.37±0.12，Tam組0.97±0.00，E2+Tam組1.00±0.05(對(duì)照組 vs.E2組，P=0.0305；E2組 vs.E2+Tam組，P=0.029 4)。Actg1的相對(duì)表達(dá)水平：對(duì)照組1.00±0.03，E2組0.81±0.12，Tam組0.99±0.03，E2+Tam組1.02±0.08(對(duì)照組 vs.E2組，P=0.050 8；E2組 vs.E2+Tam組，P=0.059 7)。Myh10的相對(duì)表達(dá)水平：對(duì)照組1.00±0.03，E2組0.03±0.01，Tam組0.98±0.11，E2+Tam組0.56±0.01(對(duì)照組 vs.E2組，P=0.0003；E2組 vs.E2+Tam組，P=0.0046)。結(jié)果顯示，17β-雌二醇能夠明顯抑制成肌細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵因子Pax3、Fhl1及Myh10的表達(dá)(P<0.05)，而Tamoxifen能夠逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)Pax3、Fhl1的轉(zhuǎn)錄抑制作用。同時(shí)Tamoxifen能夠部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)Myh10的轉(zhuǎn)錄抑制作用。相同濃度的雌激素對(duì)L6GNR4細(xì)胞中Actg1的表達(dá)改變不明顯，見圖2、圖3。

圖2　17β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4ERβ的表達(dá)

圖3　17β-雌二醇抑制大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中關(guān)鍵細(xì)胞遷移相關(guān)因子的表達(dá)

基因引物序列長度(bp)復(fù)性溫度(℃)ActinGGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG13956ERαCGATGGTGCATTGGTTTGTGAGACTCGCTACTGTGCTGTG14160ERβGCCCTTGTTACTGATGTGCCATGCCCTGGTCTGGGTGATT11260Pax3CTGCTCTGCGGTGAAGGTGGAGGAGGAGGCGGATTTAG19160Fhl1CGTGCCAGTAGCGATTCTTATGCTGCCTGAAGTGCTTTGAC10756Actg1AATGCCGTGCTCAATAGGGTCGCAATGGAAGAAGAAATCG22960Myh10ACTTGCCAAAGCGAGATGAGACAAAGGAAGAAAGGACCAC12960

3　討論

雌激素和ERα的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域-雌激素受體反應(yīng)元件結(jié)合后發(fā)揮其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的作用。而ERβ不僅能和雌激素受體反應(yīng)元件結(jié)合發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用，還能夠以不依賴配體結(jié)合的方式發(fā)揮其作用[2]。ERα和ERβ競爭性地結(jié)合同一個(gè)雌激素受體反應(yīng)元件，或者特異地結(jié)合在不同雌激素受體反應(yīng)元件上，因此其在調(diào)控基因表達(dá)的功能上也不相同[5-6]。大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中有雌激素受體ERα和ERβ的表達(dá)，并且以ERβ為主。研究表明，17β-雌二醇可以抑制成肌細(xì)胞中骨骼肌分化標(biāo)記物(Myosin heavy chain，MHC)、Tropomyosin和Myogenin的表達(dá)水平，并且可以抑制成肌細(xì)胞融合形成肌管的過程[7]。但Galluzzo等[8]研究結(jié)果表明，17β-雌二醇可以提高大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4中Myogenin和MHC的表達(dá)。17β-雌二醇還可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制成肌細(xì)胞的凋亡[9]。目前，關(guān)于雌激素對(duì)成肌細(xì)胞遷移功能影響的相關(guān)研究很少。因此，本研究應(yīng)用17β-雌二醇處理大鼠成肌細(xì)胞，觀察其對(duì)成肌細(xì)胞遷移能力的影響及可能的機(jī)制。

在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，筆者連續(xù)觀察24 h 17β-雌二醇對(duì)大鼠成肌細(xì)胞L6GNR4遷移能力的影響，結(jié)果顯示，17β-雌二醇在劃痕24 h時(shí)，可以明顯抑制L6GNR4的細(xì)胞遷移。同時(shí)，檢測17β-雌二醇對(duì)成肌細(xì)胞中不同雌激素受體亞型和調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因(Pax3、Fhl1等)表達(dá)的影響。結(jié)果表明，17β-雌二醇能夠明顯抑制ERβ的表達(dá)，而Tamoxifen能夠部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)ERβ的抑制作用。17β-雌二醇能夠明顯抑制成肌細(xì)胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵因子Pax3、Fhl1及Myh10的表達(dá)，而Tamoxifen能夠逆轉(zhuǎn)或部分逆轉(zhuǎn)17β-雌二醇對(duì)Pax3、Fhl1及Myh10的轉(zhuǎn)錄抑制作用。

Pax3、Fhl1及Myh10在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮重要作用。在胚胎期，肌肉前體細(xì)胞從軸旁體節(jié)遷移至其他形成肌肉組織的部位，如：肢體。肌肉前體細(xì)胞的遷移在肌肉發(fā)生中發(fā)揮重要作用，而Pax3通過調(diào)節(jié)c-Met參與調(diào)節(jié)肌肉前體細(xì)胞的遷移過程[10-11]。在小鼠骨骼肌So18細(xì)胞中，重組表達(dá)的Fhl1可以調(diào)節(jié)integrin介導(dǎo)的細(xì)胞骨架的重排。細(xì)胞表面integrin激活直接導(dǎo)致細(xì)胞骨架actin重組，同時(shí)伴有粘著斑復(fù)合物和彈力纖維的形成。在成肌細(xì)胞中GFP-Fhl1的過表達(dá)可以通過-5-1-integrin特異地抑制成肌細(xì)胞粘附力,并提高細(xì)胞的擴(kuò)散和遷移能力[12]。Non-muscle myosin 2B(Myh10)和actin細(xì)胞骨架的結(jié)合在細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、黏附和細(xì)胞形態(tài)的維持中發(fā)揮重要作用[13-14]。有關(guān)Non-muscle myosin在骨骼肌發(fā)育中的作用的相關(guān)研究很少。有研究表明，在成肌細(xì)胞中，non-muscle myosins 2A/2B和actin的相互作用能夠改變成肌細(xì)胞的形態(tài)、黏附和運(yùn)動(dòng)能力。此外，non-muscle myosin 2B敲除后，可以明顯抑制成肌細(xì)胞的尾部收縮，增加細(xì)胞長度，干擾肌管形成過程中細(xì)胞核的重分布[15]。

綜上所述，雌激素17β-雌二醇通過ERβ轉(zhuǎn)錄抑制Pax3、Fhl1及Myh10的表達(dá)，以發(fā)揮抑制大鼠成肌細(xì)胞遷移的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]Vivar OI,Zhao X,Saunier EF,et al.Estrogen receptor beta binds to and regulates three distinct classes of target genes[J].J Biol Chem,2010,285(29):22059-22066.

[2]Wiik A,Ekman M,Johansson O,et al.Expression of both oestrogen receptor alpha and beta in human skeletal muscle tissue[J].Histochem Cell Biol,2009,131(2):181-189.

[3]Wang LL,Peng ZH,Fan Y,et al.Dynamic expression of molecules that control limb muscle development including Fhl1 in hind limbs of different gestational age[J].APMIS,2014,122(9):766-771.

[4]Wang L,Miao J,Li L,et al.Identification of an FHL1 protein complex containing gamma-actin and non-muscle myosin IIB by analysis of protein-protein interactions[J].PLoS One,2013,8(11):e79551.

[5]Hayashi SI,Eguchi H,Tanimoto K,et al.The expression and function of estrogen receptor alpha and beta in human breast cancer and its clinical application[J].EndocrRelat Cancer,2003,10(2):193-202.

[6]Lazennec G,Bresson D,Lucas A,et al.ER beta inhibits proliferation and invasion of breast cancer cells[J].Endocrinology,2001,142(9):4120-4130.

[7]Ogawa M,Yamaji R,Higashimura Y,et al.17β-estradiol represses myogenic differentiation by increasing ubiquitin-specific peptidase 19 through estrogen receptor α[J].J Biol Chem,2011,286(48):41455-41465.

[8]Galluzzo P,Rastelli C,Bulzomi P,et al.17beta-Estradiol regulates the first steps of skeletal muscle cell differentiation via ER-alpha-mediated signals[J].Am J Physiol Cell Physiol,2009,297(5):1249-1262.

[9]La Colla A.Vasconsuelo AA.Boland R.Estradiol exerts antiapoptotic effects in skeletal myoblasts via mitochondrial PTP and MnSOD[J].J Endocrinol,2013,216(3):331-341.

[10]Birchmeier C,Brohmann H.Genes that control the development of migrating muscle precursor cells[J].Curr Opin Cell Biol,2000,12(6):725-730.

[11]Buckingham M,Relaix F.PAX3 and PAX7 as upstream regulators of myogenesis[J].Semin Cell Dev Biol,2015,44:115-125.

[12]Robinson PA,Brown S,Mc Grath MJ,et al.Skeletal muscle LIM protein 1 regulates integrin-mediated myoblast adhesion,spreading,and migration[J].Am J Physiol Cell Physiol,2003,284(3):681-695.

[13]CramerLP.Organization and polarity of actin filament networks in cells:implications for the mechanism of myosin-based cell motility[J].BiochemSoc Symp,1999,65:173-205.

[14]Conti MA,Adelstein RS.Nonmuscle myosin II moves in new directions[J].J Cell Sci,2008,121(Pt 1):11-18.

[15]Swailes NT,Colegrave M,Knight PJ,et al.Non-muscle myosins 2A and 2B drive changes in cell morphology that occur as myoblasts align and fuse[J].J Cell Sci,2006,119(Pt 17):3561-3570.

收稿日期：2016-03-22

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(81100434，81471466)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607001

Mechanism of 17β-estradiol regulating the migration of L6GNR4 myoblast

WU Di,PENG Zhao-hong,XIN Jun-chi,WANG Li-li*

(Medical Research Center,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effect of 17β-estradiol on the migration of L6GNR4 myoblast and discuss the molecular mechanism.MethodsL6GNR4 cells were cultured in high-glucose DMEM containing 10 nM 17β-estradiol and/or 50 nM tamoxifen.The effect of 17β-estradiol on the migration of L6GNR4 myoblasts was detected by Wound-healing assays at 0 h,12 h and 24 h after medication.The expression levels of ER and key genes involved in myoblast migration (Pax3,Fhl1,Fhl1 interactor-Actg1 and Myh10) were examined by real-time RT-PCR in each group.Results17β-estradiol inhibited the migration of myoblast after 24 h and down-regulated the expression of ERβ,Pax3,Fhl1 and Myh10 which could be totally or partly reversed by tamoxifen,while the same dose of estrogen has no obvious effect on Actg1 expression in L6GNR4.Conclusion17β-estradiol can inhibit the expression of Pax3,Fhl1 and Myh10 by ERβ-mediated transcription,thus restraining the L6GNR4 myoblast migration

Key words：17β-estradiol;L6GNR4 myoblast;Migration