MTMR14基因缺失促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞增殖和分化

于孟飛，楊　瀟，沈金花

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

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MTMR14基因缺失促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞增殖和分化

于孟飛，楊瀟，沈金花*

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，醫(yī)學(xué)生物研究所&武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

摘要為研究磷酸肌醇磷酸酶肌管相關(guān)蛋白14(MTMR14)在骨骼肌發(fā)生中的作用，通過(guò)組織切片和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究了MTMR14敲除對(duì)骨骼肌的組織結(jié)構(gòu)、成肌細(xì)胞分化和增殖的影響.結(jié)果表明：MTMR14敲除小鼠的腓腸肌和比目魚(yú)肌的結(jié)構(gòu)較同窩野生型小鼠產(chǎn)生了明顯變化，MTMR14敲除小鼠的成肌細(xì)胞的分化和增殖成肌小管過(guò)程較野生型顯著加快. MTMR14基因敲除后小鼠肌管細(xì)胞中平均細(xì)胞核數(shù)顯著增加.故MTMR14基因缺失/敲除導(dǎo)致骨骼肌組織結(jié)構(gòu)異常，干擾了骨骼肌肌肉發(fā)生過(guò)程中的成肌細(xì)胞的增殖和分化.

關(guān)鍵詞成肌細(xì)胞；肌管相關(guān)蛋白14；增殖；分化；骨骼肌發(fā)生

Deficiency ofMTMR14 Promoted the Proliferation and Differentiation of Mouse Myoblasts

YuMengfei,YangXiao,ShenJinhua*

(Institute for Medical Biology & Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China, College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan, 430074, China)

AbstractTo investigate the role of myotubularin related protein 14 (MTMR14), a novel phosphoinositide phosphatase, in regulating myogenesis, the effects ofMTMR14 depletion on the structure, myoblast differentiation and proliferation were evaluated using tissue biopsy and cell culture techniques. The results demonstrated that the structures of both gastrocnemius and soleus muscles inMTMR14-depleted mice were different from their wild type (WT) littermates. Compared to the WT control, the myoblast ofMTMR14-depleted mice showed accelerated proliferation and differentiation into myotubes in culture. The depletion ofMTMR14 also induced an increase of the number of nuclei in myotubes. In conclusion, the deficiency/depletion ofMTMR14 led to the abnormal structure of skeletal muscles, and disrupted the proliferation and differentiation of myoblasts during skeletal myogenesis.

Keywordsmyoblast; MTMR14; differentiation; proliferation; skeletal myogenesis

骨骼肌在許多生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，如運(yùn)動(dòng)的發(fā)起、能量動(dòng)態(tài)平衡和全身的代謝.機(jī)體衰老和疾病也與骨骼肌組織結(jié)構(gòu)和/或功能異常相關(guān)[1, 2].骨骼肌肌肉的正確形成(也稱(chēng)肌肉發(fā)生)是一個(gè)受到精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，如成肌細(xì)胞周期的退出、肌肉細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)、細(xì)胞變形和融合成肌管細(xì)胞等多個(gè)環(huán)節(jié)[3, 4].肌管相關(guān)蛋白14(MTMR14)是一種肌肉特異性肌醇磷酸酶，MTMR14基因突變?cè)诙鄠€(gè)物種中會(huì)引起肌肉疾病，如人、小鼠和斑馬魚(yú)等[5].本課題前期發(fā)現(xiàn)MTMR14基因敲除小鼠骨骼肌更易疲勞[6].最近研究發(fā)現(xiàn)MTMR14表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)而下降，MTMR14蛋白的流失通過(guò)影響Ca2+平衡而加速骨骼肌的衰老進(jìn)程[7]. 所以MTMR14在骨骼肌肌肉形成過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用.

多個(gè)單核成肌細(xì)胞融合成為多核的肌管細(xì)胞是骨骼肌肌肉發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8].成肌細(xì)胞的融合不僅發(fā)生在動(dòng)物機(jī)體發(fā)育過(guò)程中，也發(fā)生在成年個(gè)體中.因?yàn)榧」芗?xì)胞中細(xì)胞核的積累對(duì)骨骼肌的生長(zhǎng)和再生過(guò)程是一個(gè)必要條件.延時(shí)成像和電鏡觀察體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：成肌細(xì)胞的融合是一個(gè)高度有序的連續(xù)過(guò)程，它涉及細(xì)胞之間的相互識(shí)別、粘附、對(duì)齊、細(xì)胞膜融合和形態(tài)變化等一系列細(xì)胞特異性事件[9]. 成肌細(xì)胞早期分化受到干擾或增強(qiáng)均能影響骨骼肌肌管細(xì)胞的形成和生長(zhǎng).故肌管細(xì)胞形成或生長(zhǎng)發(fā)生改變是由于成肌細(xì)胞早期分化或融合過(guò)程改變所致.

本課題最新研究發(fā)現(xiàn)：小鼠MTMR14基因缺失能引起胚胎成纖維細(xì)胞自噬和增殖增強(qiáng)[10]. 故MTMR14基因的缺失或敲除對(duì)成肌細(xì)胞的增殖/融合和/或它們?cè)缙诜只^(guò)程的影響成為本研究的關(guān)注焦點(diǎn).本研究分別建立了源于野生型和MTMR14基因敲除小鼠的胚胎成肌細(xì)胞系，并分別比較了這兩株細(xì)胞系的增殖速度、融合比率和單個(gè)肌管細(xì)胞中細(xì)胞核的平均數(shù)，結(jié)果表明：MTMR14缺失小鼠來(lái)源的胚胎成肌細(xì)胞較野生型生長(zhǎng)速度更快，MTMR14基因缺失還加速了成肌細(xì)胞的分化.

1材料與方法

1.1材料和儀器

MTMR14雜合小鼠由美國(guó)凱斯西儲(chǔ)大學(xué)瞿成奎教授提供.MTMR14基因敲除小鼠的繁殖、飼喂和基因型鑒定均參照文獻(xiàn)[6].所有動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于控溫、控濕的動(dòng)物房中，采用12 h間隔性光照制度(8:00 AM～8:00 PM光照)，自由采食、飲水，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合中南民族大學(xué)動(dòng)物福利和使用委員會(huì)的相關(guān)要求和規(guī)定.蘇木精-伊紅(北京索萊寶)，多聚甲醛、Abam(Sigma,美國(guó))，Han′s F10培養(yǎng)液(Biowest,法國(guó))，DMEM、二抗、胰酶、胎牛血清(Gibco,美國(guó))，eMyHC抗體(DSHB,美國(guó))，成纖維生長(zhǎng)因子(Peprotech,美國(guó)).

切片機(jī)(RM2235,德國(guó)Leica)，顯微鏡(LSM710,德國(guó)蔡氏)，CO2培養(yǎng)箱(INC108,德國(guó)Memmert)，生物安全柜(HR40-IIA2,中國(guó)海爾).

1.2病理分析

野生型和MTMR14敲除小鼠的腓腸肌和比目魚(yú)肌分別以橫向和縱向作10 μm切片，并用蘇木精-伊紅染色[11].染色后的切片經(jīng)封片后，用數(shù)碼相機(jī)拍照并用NIS-Elements Ar 3.0軟件進(jìn)行分析.通過(guò)分析骨骼肌中部區(qū)域的3個(gè)不同部位面積來(lái)確定骨骼肌橫截面積(CSAs)，并以150根肌纖維的CSAs平均值來(lái)代表腓腸肌/比目魚(yú)肌的數(shù)值.

1.3小鼠胚胎成肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

采用酶消化法培養(yǎng)小鼠胚胎成肌細(xì)胞[12].將發(fā)育至5～7 d的小鼠胚胎的四肢骨骼肌用剪刀分離，在37℃含有1.5 IU /mL膠原蛋白酶、2.4 IU /mL中性蛋白酶和2.5 mM CaCl2的酶消化液中消化30 min，1000 r/min離心5 min后，用含有20%胎牛血清，2.5 ng/mL基礎(chǔ)成纖維生長(zhǎng)因子和1% ABAM的Han′s F-10培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再放入37.5℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.4成肌細(xì)胞增殖

成肌細(xì)胞在體外培養(yǎng)24，48 h后，采用MTT法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)[13]. 先將成肌細(xì)胞以3×104/mL接種到96孔板中，每孔100 μL，在完全培養(yǎng)基下培養(yǎng)5 d. 24 , 48 h后，用含有10 μL重組MTT的DMEM代替完全培養(yǎng)基.培養(yǎng)2 h后，用含有100 μL MTT溶解液的DMEM換液.在570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞吸光度.用連接24，48 h細(xì)胞吸光度直線的斜率來(lái)表示成肌細(xì)胞增殖率.為確保成肌細(xì)胞的純度，野生型和MTMR14敲除小鼠來(lái)源的成肌細(xì)胞MTMR14基因mRNA表達(dá)經(jīng)PCR檢測(cè)合格后，再進(jìn)行MTT檢測(cè).

1.5免疫熒光

胚胎肌球蛋白重鏈蛋白基因簇(eMyHC+)是人和小鼠非常保守的骨骼肌發(fā)育分化的標(biāo)記分子[14].表達(dá)通過(guò)改良的免疫熒光法進(jìn)行eMyHC+的分化的成肌細(xì)胞計(jì)數(shù)[15].培養(yǎng)的成肌細(xì)胞經(jīng)含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液室溫固定后，用含有0.25% Triton X-100室溫通透細(xì)胞膜10 min.再用含有1%牛血清白蛋白和0.1% Tween-20的磷酸緩沖液進(jìn)行封閉再用1︰200抗eMyHC抗體在4℃下過(guò)夜雜交，用1︰1000的抗兔的FITC標(biāo)記的二抗37℃雜交2 h，用DAPI染細(xì)胞核，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度.

1.6成肌細(xì)胞分化

為了誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化，在細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成含2%馬血清和1% ABAM的DMEM.為了使肌管和細(xì)胞核可視，先用4%多聚甲醛固定正在分化的成肌細(xì)胞10 min，再在室溫條件下用吉姆薩染色.由NIH ImageJ軟件分析統(tǒng)計(jì)細(xì)胞核總數(shù)和肌管內(nèi)細(xì)胞核總數(shù).分化指數(shù)=采用胚胎肌球蛋白重鏈蛋白基因陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/全部成肌細(xì)胞核數(shù)量×100%.當(dāng)成肌細(xì)胞內(nèi)具有2個(gè)以上的細(xì)胞核時(shí)，則為肌管細(xì)胞.融合指數(shù)=肌管細(xì)胞中細(xì)胞核數(shù)/全部成肌細(xì)胞核數(shù).每個(gè)肌管細(xì)胞平均細(xì)胞核數(shù)=所有肌管細(xì)胞核數(shù)/肌管細(xì)胞數(shù).

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2結(jié)果

2.1MTMR14基因缺失導(dǎo)致腓腸肌細(xì)胞核數(shù)增加

前期研究發(fā)現(xiàn)MTMR14缺失能破壞肌肉細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡引起重癥肌無(wú)力.為檢驗(yàn)MTMR14基因缺失能否引起骨骼肌結(jié)構(gòu)改變，分別對(duì)野生型和MTMR14敲除小鼠腓腸肌進(jìn)行縱橫切片.如圖1所示，MTMR14敲除小鼠腓腸肌纖維橫截面積同野生型小鼠之間無(wú)顯著差異.但MTMR14敲除小鼠腓腸肌細(xì)胞核數(shù)較野生型小鼠顯著性增加(p<0.05)，說(shuō)明MTMR14基因在骨骼肌形成中發(fā)揮調(diào)控作用.

WT:野生型; KO:敲除型;a) 野生型橫切; b) 敲除型橫切; c) 野生型縱切;d) 敲除型縱切;e) 腓腸肌橫切截面積(n=5); f) 每個(gè)腓腸肌肌管細(xì)胞平均細(xì)胞核數(shù)(n=10);*p< 0.05圖1　MTMR14敲除對(duì)小鼠腓腸肌的影響Fig.1　Effects of MTMR14 deletion on mouse extensor digitorum longus muscles

2.2MTMR14基因缺失導(dǎo)致比目魚(yú)肌細(xì)胞核數(shù)增加

為了進(jìn)一步確認(rèn)MTMR14基因在骨骼肌形成過(guò)程中的調(diào)控作用，檢測(cè)了MTMR14基因敲除對(duì)另一種骨骼肌，比目魚(yú)肌的影響.如圖2中比目魚(yú)肌橫切所示，MTMR14缺失小鼠比目魚(yú)肌較同窩野生型小鼠之間顯著增加(p<0.05).同時(shí)，MTMR14基因缺失小鼠比目魚(yú)肌細(xì)胞核數(shù)較野生型小鼠也顯著增加(p<0.05).這些結(jié)果同上面提到的腓腸肌中的結(jié)果相類(lèi)似.這些結(jié)果進(jìn)一步證明MTMR14在肌肉發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.

WT: 野生型; KO: 敲除型a) 野生型橫切; b) 敲除型橫切; c) 野生型縱切; d) 敲除型縱切;e) 腓腸肌橫切截面積(n=5); f) 每個(gè)腓腸肌肌管細(xì)胞平均細(xì)胞核數(shù)(n=10);*p< 0.05 圖2　MTMR14敲除對(duì)小鼠比目魚(yú)肌的影響Fig.2　Effects of MTMR14 deletion on mouse soleus muscles

2.3MTMR14基因缺失促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖

為進(jìn)一步闡明MTMR14基因調(diào)控肌肉的機(jī)制，采用MTT法檢測(cè)了MTMR14基因?qū)Τ杉〖?xì)胞增殖的影響，成肌細(xì)胞分別來(lái)源于野生型和MTMR14敲除小鼠胎鼠的骨骼肌(腓腸肌).如圖3a所示，在MTMR14敲除小鼠中，MTMR14基因mRNA表達(dá)水平顯著下降(p<0.05)，證明MTMR14基因被成功敲除.如圖3b所示，成肌細(xì)胞體外培養(yǎng)24, 48 h后，MTMR14基因缺失均顯著加快了成肌細(xì)胞的增殖速度.說(shuō)明MTMR14在骨骼肌增殖中發(fā)揮重要調(diào)控作用.

WT:野生型; KO: 敲除型; n=4, *p< 0.05 圖3　MTMR14敲除對(duì)小鼠成肌細(xì)胞中MTMR14 mRNA表達(dá)(a)和成肌細(xì)胞增殖(b)的影響Fig.3　Effects of MTMR14 deficiency on the expression of MTMR14 mRNA(a) and proliferation of mouse myoblasts (b)

2.4MTMR14基因缺失加快成肌細(xì)胞分化并破壞成肌細(xì)胞融合

由于成肌細(xì)胞能分化成肌管細(xì)胞，為深入探究MTMR14基因在肌肉發(fā)生過(guò)程中的作用，檢測(cè)了MTMR14基因缺失對(duì)成肌細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞的影響.如圖4a所示，體外培養(yǎng)的成肌細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成肌管細(xì)胞，肌管細(xì)胞在其胞質(zhì)中表達(dá)綠色eMyHC蛋白.成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，MTMR14基因敲除組中分化的成肌細(xì)胞所占總細(xì)胞數(shù)的百分比顯著高于野生型小鼠組(圖4b,p<0.01).但成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后，MTMR14基因敲除組和野生型組之間分化的肌管細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)百分比之間無(wú)顯著差異(p> 0.05).說(shuō)明MTMR14基因缺失能加快成肌細(xì)胞分化成為肌管細(xì)胞.

成肌細(xì)胞融合是骨骼肌形成過(guò)程中的一個(gè)重要過(guò)程，MTMR14基因敲除對(duì)成肌細(xì)胞融合過(guò)程的影響如圖4c所示.成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化24 h后，MTMR14缺失組中成肌細(xì)胞的融合率顯著高于野生型組(p<0.01).但成肌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化48 h后，敲除組與對(duì)照組之間的成肌細(xì)胞融合率無(wú)顯著差異(p>0.05).與此相似，MTMR14基因缺失亦導(dǎo)致肌管細(xì)胞中細(xì)胞核平均數(shù)顯著高于野生型(圖4d，p<0.05)，說(shuō)明MTMR14基因缺失能引起肌管細(xì)胞中細(xì)胞核平均數(shù)異常和融合過(guò)程加快.

WT: 野生型; KO: 敲除型; n = 4, *p< 0.05, **p< 0.01a) MTMR14缺失對(duì)小鼠成肌細(xì)胞分化的影響; b) MTMR14缺失對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞分化的影響;c) MTMR14缺失對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成肌細(xì)胞融合的影響; d) MTMR14缺失對(duì)小鼠單個(gè)肌管細(xì)胞中細(xì)胞核數(shù)量的影響.圖4　MTMR14缺失對(duì)小鼠成肌細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞的影響Fig.4　Effects of MTMR14 deficiency on the differentiation of mouse myoblasts into myotubes

3討論

本研究結(jié)果證實(shí)：MTMR14基因缺失不僅能引起骨骼肌(腓腸肌和比目魚(yú)肌)結(jié)構(gòu)異常，還能促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖速度.同時(shí)，MTMR14基因缺失能加速成肌細(xì)胞向肌管細(xì)胞分化和肌管細(xì)胞平均細(xì)胞核數(shù)增加.這些結(jié)果表明MTMR14基因?qū)趋兰⌒纬删哂兄匾{(diào)控作用.

MTMR14基因缺失可通過(guò)破壞骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡導(dǎo)致肌肉耐疲勞度下降和恢復(fù)所需時(shí)間延長(zhǎng)[6]. 為闡明其機(jī)制，我們首先采用組織切片對(duì)MTMR14敲除小鼠骨骼肌(腓腸肌和比目魚(yú)肌)進(jìn)行了分析.結(jié)果顯示MTMR14基因敲除對(duì)兩種骨骼肌的平均橫截面積均無(wú)影響.但MTMR14敲除小鼠肌管細(xì)胞平均細(xì)胞核數(shù)較野生型顯著增加.這些改變是導(dǎo)致MTMR14敲除小鼠易疲勞和肌肉耐力恢復(fù)慢的原因.提示MTMR14基因參與了骨骼肌的肌肉發(fā)生過(guò)程.

肌肉發(fā)生是一個(gè)受?chē)?yán)格調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，它包含細(xì)胞周期的退出、生肌蛋白的表達(dá)、細(xì)胞粘附和融合成合胞體肌纖維等多個(gè)過(guò)程[16, 17].MTMR14敲除小鼠肌管形成和/或生長(zhǎng)的改變是由成肌細(xì)胞早期的增殖和/或分化發(fā)生改變而引起的.MTMR14基因的缺失會(huì)加速成肌細(xì)胞的增殖速度，這些改變會(huì)導(dǎo)致成肌細(xì)胞增殖時(shí)間和/或成肌細(xì)胞融合成肌管細(xì)胞所需時(shí)間縮短，使成肌細(xì)胞提早退出細(xì)胞周期和未成熟肌管的形成.因此，加速的成肌細(xì)胞增殖、分化和縮短的融合成肌管等這三個(gè)事件解釋了MTMR14基因缺失小鼠骨骼肌力量下降、肌肉恢復(fù)事件延長(zhǎng)和易疲勞性[6]，以及其對(duì)鍛煉引起的肌肉損傷更敏感的原因[7].

綜上，MTMR14在成肌細(xì)胞分化和融合過(guò)程中發(fā)揮重要作用.MTMR14基因的缺失或敲除會(huì)破壞骨骼肌細(xì)胞的正常形成過(guò)程，并最終導(dǎo)致骨骼肌結(jié)構(gòu)異常. 反之，結(jié)構(gòu)異常的骨骼肌會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體骨骼肌在功能水平上的異常和/或下降. 然而，MTMR14基因缺失引起骨骼肌組織結(jié)構(gòu)和功能異常的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制仍不清楚，亟待深入研究.

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中圖分類(lèi)號(hào)Q253; Q28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1672-4321(2016)01-0034-05

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金面上資助項(xiàng)目(81170227); 湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2012FFA028)

作者簡(jiǎn)介于孟飛(1982-)，男，講師，博士，研究方向：心律不齊，E-mail:65556248@qq.com

收稿日期2015-09-25*通訊作者沈金花(1975-)，女，教授，博士，研究方向：肌肉發(fā)生和相關(guān)疾病的機(jī)制，E-mail：shenjinhua2013@163.com