陳化糧對雛雞生長性能和免疫指標(biāo)的影響及乳酸桿菌的恢復(fù)作用

冷長友 孫浩 陳樂 舒麗 程依林 曹禮靜 王慶華

摘要 在模擬制備黃曲霉毒素超標(biāo)陳化糧的基礎(chǔ)上，探究陳化糧對雛雞料肉比、免疫器官指數(shù)和血細(xì)胞數(shù)量的影響以及乳酸桿菌的恢復(fù)作用。選用160只白來航雛雞，隨機分為4組，分別為對照組、高劑量黃曲霉毒素組、低劑量黃曲霉毒素組、高劑量黃曲霉毒素+乳酸桿菌組，攻毒時間為28 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，黃曲霉毒素對雛雞日增重有顯著的阻滯作用；與對照組相比，低劑量黃曲霉毒素組和高劑量黃曲霉毒素組料肉比極顯著升高，而添加乳酸桿菌對雛雞料肉比具有顯著的恢復(fù)作用（P<0.05）。與對照組相比，黃曲霉毒素對雞血細(xì)胞生成和免疫器官發(fā)育具有顯著的阻滯作用（P<0.05），導(dǎo)致血細(xì)胞合成受阻和免疫器官發(fā)育滯后，而乳酸桿菌對雞血細(xì)胞生成和免疫器官發(fā)育具有一定的恢復(fù)作用。

關(guān)鍵詞 黃曲霉毒素；料肉比；血細(xì)胞數(shù)量；免疫器官指數(shù)；雞；乳酸桿菌

中圖分類號 S 831? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）12-0084-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.12.017

Effects of the Growth Performance and Immune Indices of Chicks and the Recovery Effect of Lactobacillus sp.

LENG Chang-you1，SUN Hao2，CHEN Le2 et al

（1.Vocational Education Center of Rongchang District in Chongqing，Chongqing? 402460;2.College of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing? 402460）

Abstract Based on simulating the preparation of aged diet with excessive aflatoxin，the effects of aged diet on the feed-meat ratio，immune organ indexes and blood cell count of chicken，and the recovery effect of Lactobacillus sp.were studied.Thirty-six white Laihang Chicken were randomly divided into 4 groups：control group，high-dose aflatoxin group，low-dose aflatoxin group，high-dose aflatoxin+Lactobacillus sp. group，the test period was 28 days.The results showed that compared with the control group，aflatoxin had a significant retardation effect on the daily weight gain of chicken.Compared with the control group，the feed-meat ratio in the low-dose aflatoxin group and high-dose aflatoxin group significantly increased.Adding Lactobacillus sp. had a significant improvement effect on the feed-meat ratio （P<0.05）.Compared with the control group，aflatoxin had a significant retardation effect on the formation of chicken blood cells and the development of immune organs （P<0.05），resulting in the blocked synthesis of blood cells and delayed development of immune organs，while Lactobacillus sp. had some recovery effects on the formation of chicken blood cells and the development of immune organs.

Key words Aflatoxin;Feed-meat ratio;Blood cell count;Immune organ index;Chicken;Lactobacillus sp.

基金項目 中國農(nóng)村專業(yè)技術(shù)協(xié)會重慶榮昌肉兔科技小院項目；重慶市教委重大項目（KJZD-M202200202）。

作者簡介 冷長友（1972—），男，重慶人，高級講師，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。*通信作者，副教授，博士，從事臨床獸醫(yī)學(xué)研究。

收稿日期 2023-07-13

黃曲霉菌（又叫黃曲菌，Aspergillus flavus）是常見腐生霉菌，屬于真菌門半知菌亞門叢梗孢科曲霉屬。黃曲霉菌廣泛分布于世界各地，特別是溫暖濕潤地區(qū)［1］。黃曲霉菌極易在糧食、肉食奶制品、飼料和油料飼料中滋生，常常導(dǎo)致雞出現(xiàn)食欲廢絕、下血痢、皮膚貧血變白或黃疸、料肉比增加的現(xiàn)象，給養(yǎng)殖戶造成極大的經(jīng)濟損失［2］。黃曲霉毒素（aflatoxins）是由黃曲霉或者其他曲霉菌產(chǎn)生的一種雙呋喃環(huán)類毒素，動物因采食這些被黃曲霉毒素污染的食物或其加工副產(chǎn)品，在腸道內(nèi)被吸收或者刺激腸道而發(fā)?。?］。

乳酸桿菌作為革蘭氏陽性菌（G+），呈現(xiàn)單個、成雙或短鏈排列，喜歡厭氧環(huán)境，因此容易寄生在各種動物的口腔、腸道及陰道中［4］。乳酸桿菌具有將碳水化合物合成葡聚糖和雜多糖并產(chǎn)酸的特征，是動物機體中的常見微生物菌群之一，對于在厭氧發(fā)酵環(huán)境下給動物提供營養(yǎng)和維持動物健康具有重要作用［5］。乳酸桿菌對雞生長性能、免疫功能和抗氧化功能以及腸道菌群的維護具有重要作用。宋丹等［6］研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌和屎腸球菌具有促進肉雞生長、提高免疫力的作用。王雪瑩等［7］研究發(fā)現(xiàn)飼喂乳酸桿菌后胃黏膜定殖大量的乳酸桿菌，可以拮抗病原微生物（幽門螺桿菌、霍亂沙門氏菌）對機體的危害。

陳化糧是指長期儲存（存儲3年及以上）的食物或飼料，因此陳化糧中黃曲霉菌及黃曲霉毒素往往會超標(biāo)［8］，此外陳化糧變質(zhì)腐爛，糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分流失，已不能直接作為人類或動物的食物或飼料［9］。為了解決“三農(nóng)”問題，各地糧倉敞開收購，導(dǎo)致糧倉爆倉，但因糧倉周轉(zhuǎn)不靈導(dǎo)致糧食儲存過久，從而導(dǎo)致出現(xiàn)大量的“陳化糧”［8］。筆者探討添加乳酸桿菌后部分替代動物日糧，以降低養(yǎng)殖成本和提高經(jīng)濟效益，將陳化糧有限度地在部分肉雞和蛋雞養(yǎng)殖場使用。

筆者從市場購買的陳化糧中分離提取黃曲霉菌株，培養(yǎng)其產(chǎn)生的黃曲霉毒素后給試驗雞飼喂，研究其對試驗雞生長性能和免疫指標(biāo)的影響，探討不同添加量的乳酸桿菌對飼喂黃曲霉毒素污染飼料雞料肉比、血細(xì)胞數(shù)量和免疫器官指數(shù)的影響，旨在為陳化糧的合理開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，也為乳酸桿菌在飼料中的合理添加提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物及其分組。選取160只5日齡白來航雞，隨機分為4組，分別為高劑量黃曲霉毒素組、低劑量黃曲霉毒素組、高劑量黃曲霉毒素+乳酸桿菌組、對照組，每組5個重復(fù)。每天定時對雛雞進行飼喂并記錄試驗數(shù)據(jù)。試驗雞飼養(yǎng)于西南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院動物飼養(yǎng)室。各組試驗雞隔離正常飼養(yǎng)，采食和飲水自由。試驗結(jié)束后，白來航雞被麻醉致死。該研究通過了西南大學(xué)實驗動物福利倫理審查（倫理審查號為IACUC-20200701-01）。

1.1.2 菌種。乳酸桿菌由陜西科技大學(xué)錢衛(wèi)東博士贈送，每天給雞灌飼的乳酸桿菌量為7×1010 CFU/只。

1.1.3 黃曲霉毒素的來源。將市場購買陳化糧中的黃色或黃綠色菌落置于顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)霉菌菌絲呈分隔狀，霉菌分生孢子梗表面粗糙，且小梗上分生孢子呈鏈狀生長。將陳化糧中的黃色菌落接種于察氏培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)3～5 d。待霉菌長出后，使用劃線法分離黃曲霉菌，將黃曲霉菌純化后培養(yǎng)黃曲霉毒素。

1.1.4 黃曲霉毒素含量的測定。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10］測定基礎(chǔ)日糧與試驗陳化糧中黃曲霉毒素B1的含量。試驗飼料使用84%乙腈水溶液提取，經(jīng)過純化稀釋后上機測定。

1.1.5 不同黃曲霉毒素含量的陳化糧制備。首先，參考NRC（1994年）肉雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，配制基礎(chǔ)日糧（飼料配方：玉米55.10%、豆粕37.20%、大豆油3.68%、碳酸氫鈣1.71%、石粉1.32%、氯化鈉0.30%、氯化膽堿0.15%、預(yù)混料0.25%、DL-蛋氨酸0.25%、L-賴氨酸鹽酸鹽0.03%、L-蘇氨酸0.01%）。黃曲霉毒素超標(biāo)的陳化糧和基礎(chǔ)日糧按不同比例混合后，制備低劑量黃曲霉毒素組陳化糧（AFB1含量100 μg/kg）、高劑量黃曲霉毒素組陳化糧（AFB1含量200 μg/kg），飼喂試驗雞。在飼喂上述高劑量黃曲霉毒素組陳化糧的雞只每日灌服乳酸桿菌7×1010 CFU/只，用于探討乳酸桿菌的恢復(fù)作用。

1.1.6 主要儀器。恒溫培養(yǎng)箱（型號GNP-9050）購自上海精宏設(shè)備有限公司；PCR儀（型號Mastercycler nexus X2 PCR）購自德國Eppendorf公司；電子天平（型號EL3 002型）購自梅特勒-托利多有限公司；血液分析儀（型號PE-6 800VET）購自武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號GEL DOC XR）購自北京賽百奧科技有限公司；電泳儀（型號JY-300C）購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Acquity TQ-XS超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀購自美國Waters公司。

1.1.7 主要試劑。標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素B1（98%），購自成都格利普生物科技有限公司；真菌DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；察氏培養(yǎng)基，由筆者所在實驗室配制；乳酸棉酚藍染液，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)鑒定。采用透明膠帶鏡檢法［11］進行菌株形態(tài)學(xué)鑒定，將乳酸酚棉藍染液滴加于載玻片上，用食指和拇指將透明膠帶彎折成“U”形，膠面朝下，輕輕蘸取部分菌落表面，浸入載玻片的乳酸酚棉藍染液中并開始鏡檢，同時與《真菌醫(yī)學(xué)：檢驗與圖解》［12］進行對比，從形態(tài)學(xué)上進行初步鑒定。

1.2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定。挑取菌落純培養(yǎng)物，用真菌DNA提取試劑盒提取察氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的霉菌DNA。根據(jù)真菌5.8S rDNA 間隔序列ITS引物（ITS-600-F為TCCGTAGGTGAACCTGCG，ITS-600-R為TCCTCCGCTTATTGATATGC），進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（25.0 μL）如下：2.0 μL DNA模板，10 μmol/L正、反向引物各2.0 μL，12.5 μL Taq PCR Master Mix，加入6.5 μL ddH2O補足25.0 μL。擴增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶大小，并送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。使用BLAST程序，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的基因序列進行同源性比對，進行分離菌株鑒定。

1.2.3 試驗設(shè)計。試驗期共28 d。在飼喂第0和28天給試驗雞稱重，每組稱量體重，取其平均值，計算日增重；試驗結(jié)束后，稱取所喂飼料重量，計算料肉比；翅下采血約1 mL/只，進行血液學(xué)分析。上述采樣結(jié)束后將雞麻醉并解剖，摘取免疫器官并稱重，分析黃曲霉毒素及乳酸桿菌對雛雞部分免疫器官的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對不同日齡雛雞日增重、料肉比、血細(xì)胞數(shù)量、免疫器官指數(shù)進行差異顯著性檢驗，比較各組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉菌分離與鑒定

2.1.1 黃曲霉菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

將分離到的疑似黃曲霉菌菌株制片后置于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)40倍顯微鏡下疑似黃曲霉菌菌株頂囊呈燒瓶形或近球形，分生孢子頭呈現(xiàn)疏松放射狀，繼而呈疏松柱狀（圖1A）。將培養(yǎng)基上霉菌菌落置于紫外燈下觀察，可見菌落周圍出現(xiàn)藍色熒光。

2.1.2 黃曲霉菌的分子生物學(xué)鑒定。

以菌落純培養(yǎng)物提取的真菌DNA為模板，進行真菌5.8S rDNA基因的PCR擴增，其擴增產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)1條約500 bp大小清晰目的條帶（圖1B），表明擴增的條帶與預(yù)期擴增結(jié)果相一致。將真菌5.8S rDNA基因序列的測序結(jié)果通過BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的序列進行同源性比對，比對結(jié)果表明該菌與黃曲霉菌的同源性在99%以上，進一步說明分離培養(yǎng)菌株為黃曲霉菌。

2.2 飼料中添加黃曲霉毒素和乳酸桿菌對雛雞日增重和料肉比的影響

由表1可知，4個處理組平均始重為62.80～66.40 g，無顯著差異。隨著日齡的增加，其體重呈增長趨勢。對照組平均末重最大，高劑量黃曲霉毒素組平均末重最小。試驗結(jié)束后，對照組平均日增重為38.40 g/d，料肉比為2.40；高劑量黃曲霉毒素組和低劑量黃曲霉毒素添加組平均日增重分別為23.50和26.10 g/d，料肉比分別為3.90和3.50，表明黃曲霉毒素對雞增重具有阻滯作用，且其增重消耗了大量飼料。添加乳酸桿菌后，高劑量黃曲霉毒素+乳酸桿菌組雛雞的平均日增重從高劑量黃曲霉毒素組的23.50 g/d提高到27.20 g/d，料肉比降至3.20，說明乳酸桿菌拮抗了黃曲霉毒素的毒害作用。

2.3 飼料中添加黃曲霉毒素及乳酸桿菌對雛雞免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，與高劑量黃曲霉毒素組相比，其他組法氏囊指數(shù)差異極顯著（P＜0.01）；對照組的脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)、胸腺指數(shù)均最高，均極顯著高于低劑量黃曲霉毒素組和高劑量黃曲霉毒素組（P<0.01）。

2.4 飼料中添加黃曲霉毒素及乳酸桿菌對雛雞部分血細(xì)胞數(shù)量的影響

由表3可知，高劑量黃曲霉毒素組雛雞的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目、粒細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞總數(shù)均極顯著低于對照組（P＜0.01），而高劑量黃曲霉毒素+乳酸桿菌組白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)目、中間細(xì)胞數(shù)目、粒細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞總數(shù)較高劑量黃曲霉毒素組均有所升高，表明乳酸桿菌對黃曲霉毒素具有一定的解毒作用。另外，與低劑量黃曲霉毒素組相比，高劑量黃曲霉毒素組雛雞紅細(xì)胞總數(shù)有所降低，說明黃曲霉毒素對雞骨髓中的血細(xì)胞生成具有一定的抑制作用［12］。

3 討論

黃曲霉毒素是由黃曲霉等真菌產(chǎn)生的致癌物質(zhì)，導(dǎo)致雞生長受阻、產(chǎn)蛋量下降和免疫功能降低，從而造成巨大的經(jīng)濟損失，是家禽養(yǎng)殖業(yè)面臨的第二大威脅性問題［13-14］。乳酸桿菌是一種常見的有益菌，常用于制作奶酪、酸菜、酸奶、青貯飼料等食品或飼料，通過增強非特異性免疫作用（組織屏障［15］、固有免疫細(xì)胞［16］、固有免疫分子［17］）和特異性免疫作用（細(xì)胞免疫［18］、體液免疫［19］），從而達到對機體的保護效果。

機體免疫應(yīng)答水平以及抵抗外來微生物感染和侵入的能力受到免疫器官發(fā)育狀況的直接影響，其免疫器官指數(shù)的變化表明機體

細(xì)胞免疫和體液免疫功能在一定程度上有所增強［20］。法氏囊、胸腺、脾臟是家禽免疫系統(tǒng)重要的免疫器官［21］。其中，脾臟屬于外周免疫器官，而法氏囊和胸腺是機體的中樞免疫器官，二者均為淋巴樣上皮結(jié)構(gòu)。法氏囊可分化成各種特異性的B細(xì)胞和大量的漿細(xì)胞，參與體液免疫反應(yīng)。胸腺主要是產(chǎn)生參與細(xì)胞免疫活動的T細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到脾臟、扁桃體、盲腸和其他淋巴組織中，在機體一定區(qū)域內(nèi)定殖并開始參與細(xì)胞免疫活動。Rivas等［22］研究表明胸腺、法氏囊及脾臟等免疫器官指數(shù)可用于評價雛雞的免疫狀態(tài)，該試驗結(jié)果也驗證了此觀點，在飼料中添加黃曲霉毒素導(dǎo)致胸腺、法氏囊、脾臟指數(shù)出現(xiàn)不同程度的下降，說明機體細(xì)胞免疫和體液免疫機能受損，而添加乳酸桿菌可以減弱黃曲霉毒素對免疫器官發(fā)育的阻滯作用。

霉菌毒素會引起骨髓造血功能的衰退、動物貧血、生產(chǎn)性能下降［23-24］。白細(xì)胞是血液中的一種小吞噬細(xì)胞，主要對進入體內(nèi)的病原微生物進行吞噬和消化，是機體非特異性免疫的重要組成部分。白細(xì)胞數(shù)量在一定程度上反映機體的非特異性免疫狀態(tài)。該研究結(jié)果表明，給雛雞灌服乳酸桿菌對白細(xì)胞總數(shù)有一定的恢復(fù)作用。淋巴細(xì)胞也是細(xì)胞免疫的一部分，其數(shù)量在一定程度上反映機體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)。該試驗結(jié)果表明，黃曲霉菌毒素?fù)p害了細(xì)胞免疫功能，而乳酸桿菌對細(xì)胞免疫功能有恢復(fù)作用，這與喬春雨等［25］的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

陳化糧中的黃曲霉毒素會顯著增加雛雞料肉比，造成飼料的極大浪費，而乳酸桿菌具有一定的恢復(fù)作用。通過檢測雛雞免疫器官指數(shù)和部分血細(xì)胞數(shù)量發(fā)現(xiàn)，陳化糧中的黃曲霉毒素對雛雞免疫性能有一定的阻滯作用，而乳酸桿菌對其具有一定的恢復(fù)作用。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加乳酸桿菌后陳化糧可以部分替代動物飼料，降低養(yǎng)殖成本，提高經(jīng)濟效益。

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