大熊貓陰道源乳酸桿菌生物學(xué)特性研究

馬曉平，楊天意，俞 演，張志和，王承東，古 玉

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都611130； 2.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中國保護(hù)大熊貓研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，四川 雅安 625014)

大熊貓陰道源乳酸桿菌生物學(xué)特性研究

馬曉平1，楊天意1，俞 演1，張志和2，*，王承東3，古 玉4，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都611130； 2.成都大熊貓繁育研究基地，四川 成都610000； 3.中國保護(hù)大熊貓研究中心，四川 雅安 625000； 4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)院，四川 雅安 625014)

用大熊貓陰道源的3株乳酸桿菌(LactobacillussalivariusGPV01、LactobacillusplantarumGPV02和LactobacillussaerimneriGPV03)作為試驗組，用人陰道源3株乳酸桿菌(LactobacillusacidophilusWAV01、LactobacilluscrispatusWAV02和LactobacillusplantarumWAV03)作為對照組，進(jìn)行產(chǎn)過氧化氫能力、耐酸性、耐熱性、抗菌活性、藥物敏感性及黏附性研究。結(jié)果表明：在相同的培養(yǎng)條件下，L.salivariusGPV01、L.plantarumGPV02和L.saerimneriGPV03的產(chǎn)H2O2能力和耐熱能力不及L.acidophilusWAV01、L.mcrispatusWAV02和L.plantarumWAV03。L.salivariusGPV01、L.plantarumGPV02和L.plantarumWAV03具有很好的酸耐性，在培養(yǎng)基pH為2～3之間時，3株菌的D值在0.2～0.55之間，其中L.plantarumGPV02的D值最高，達(dá)到0.55。同時，6株乳酸桿菌的培養(yǎng)上清液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌均有不同程度的抑制作用，6株乳酸桿菌對3種致病菌的抑制作用遠(yuǎn)弱于pH 3.5的乳酸。6株乳酸桿菌對多西環(huán)素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、阿莫西林高度敏感，而對四環(huán)素和利福平一般敏感。6株乳酸桿菌對鏈霉素、氧氟沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、磺胺甲基異惡唑表現(xiàn)出耐藥。6株乳酸桿菌均能黏附到Hela細(xì)胞上，GPV01、03，WAV01、03對 Hela細(xì)胞的平均黏附數(shù)為18.8～32.8 ·cell-1。 WAV02黏附能力最強(qiáng)(54.75±2.40)個·cell-1，而GPV02黏附能力最弱(6.83±0.33)·cell-1。

大熊貓；乳酸桿菌；生物學(xué)特性

乳酸桿菌是在人及動物的陰道、胃腸道、口腔等濕潤黏膜表面生長的厭氧菌，陰道乳酸桿菌是婦女陰道的“健康衛(wèi)士”，近年已從陰道內(nèi)分離出的乳酸桿菌有16種[1]。乳酸桿菌是育齡健康婦女陰道內(nèi)正常菌群的優(yōu)勢菌，對陰道微生態(tài)平衡發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。國內(nèi)外均有使用不同乳酸桿菌制劑用于陰道感染治療[3]。本實驗室前期采用454高通量測序研究發(fā)現(xiàn)，部分大熊貓陰道內(nèi)乳酸桿菌屬只占0.01%[4]，表明大熊貓陰道內(nèi)乳酸桿菌不足。這是否與部分成年雌性大熊貓不孕有關(guān)，大熊貓陰道中的乳酸桿菌與人陰道中的乳酸桿菌的生物學(xué)特性又有何差異。為此，本試驗對3株大熊貓陰道源乳酸桿菌和3株人陰道源乳酸桿菌的生長曲線、產(chǎn)H2O2能力、耐酸性、耐熱性、抑菌能力、藥物敏感性以及對Hela細(xì)胞的黏附性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究大熊貓陰道益生菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗乳酸桿菌，細(xì)胞和實驗動物

大熊貓陰道源乳酸桿菌3株由本實驗室分離鑒定并提供，分別是：LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02和LactobacillussaerimneriGPV03。從育齡婦女陰道分泌物樣本分離鑒定到的3株乳酸桿菌，即LactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02和LactobacillusplantarumWAV03。后文以菌株編號代表相應(yīng)的菌株。大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌(SAU)[CMCC(B)26003]購于中國藥品生物制品檢定所，溶血性鏈球菌(SS)由本實驗室鑒定收藏，Hela細(xì)胞株(ATCC)購自上海雷蒂生物科技發(fā)展有限公司。35只SPF級小鼠體重18～22 g(3～4周齡)作為試驗動物，小鼠以5只為一籠飼養(yǎng)(小鼠購于成都實驗動物中心)。

1.2 試驗儀器設(shè)備和試劑

Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱；CKX41奧林巴斯倒置顯微鏡；UV756CRT紫外分光光度儀(元析科技有限公司，上海)；PE-2400型PCR擴(kuò)增儀(Perkin Applied Biosystems，美國)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，德國)；GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)；DP70數(shù)碼照相裝置(Olympus公司，日本)；JY600C電泳儀(君意東方電泳設(shè)備有限公司，北京)，320 pH計(Mettler Toledo Delta)。

DMEM(高糖型，4 500 mg·L-1，默克密理博)、胎牛血清(FBS)(Gibco?)、2-巰基乙醇(Sigma-Aldrich)、LAPTg肉湯培養(yǎng)基(Broth)。青霉素和鏈霉素(哈爾濱制藥集團(tuán))購自成都康迪生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏紙片和胰蛋白胨等試劑購自杭州微生物試劑有限公司；過氧化氫測試盒購自南京建成生物有限公司。

1.3 生長曲線及菌液pH曲線的測定

取0.5 mL活化的乳酸桿菌菌液接種于10 mL LAPTg肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)20 h后，置于漩渦混合器上搖勻，然后取0.5 mL接種于裝50 mL LAPTg肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)管中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，每l h取出1 mL菌懸液測定其活菌數(shù)、D600和pH。活菌數(shù)的測定采用常規(guī)梯度稀釋法，將MRS瓊脂培養(yǎng)板分為9格，分別取10-5、10-6、10-7稀釋度的菌液10 μL滴到MRS平板培養(yǎng)基的格上，吹干后放置于厭氧培養(yǎng)箱中，37 ℃，24 h后，進(jìn)行菌落計數(shù)，每個梯度的測定設(shè)立3個重復(fù)。用MRS肉湯培養(yǎng)基為空白對照，調(diào)零分光光度儀，測定菌懸液的D值，在波長600 nm處測定其吸光值，記錄D值。pH采用Mettler Toledo Delta 320pH計測定。使用OriginProPorable9.0軟件繪制生長曲線和發(fā)酵過程pH變化曲線。

1.4 乳酸桿菌產(chǎn)過氧化氫量的測定

將乳酸桿菌接種于10 mL MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物以1%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后取培養(yǎng)物，3 354g，4 ℃離心15 min，收集上清液。按照下列公式計算過氧化氫產(chǎn)量并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

菌液中H2O2量(mmol·L-1)=

1.5 乳酸桿菌耐酸性試驗

菌液培養(yǎng)好后，按10%體積比分別接種在pH 6.0、5.0、4.0、3.0和2.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h后，置于漩渦混合器上振蕩15 s，吸取2 mL混合液于比色皿中，測定其D值，試驗重復(fù)5次，以平均D值為縱坐標(biāo)，以pH為橫坐標(biāo)繪制耐酸性曲線圖。

1.6 乳酸桿菌耐熱性試驗

將2種不同來源的乳酸桿菌菌種連續(xù)活化3次，挑取單個菌落于 10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，調(diào)整1×109cfu·mL-1，分別置于40、50、60、70、80 ℃水浴中處理20、40、60 min后取樣100 μL，進(jìn)行梯度稀釋，涂布MRS平板，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，計數(shù)，統(tǒng)計細(xì)菌的菌落數(shù)并計算出存活率[(菌落數(shù)×10)/(1×109)]，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.7 乳酸桿菌的抑菌性試驗

將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌菌液分別取150 μL涂布TSA固體培養(yǎng)基。待其自然風(fēng)干后，在固體培養(yǎng)基上放置牛津杯。取80 μL乳酸桿菌培養(yǎng)物上清液、未接種乳酸桿菌的MRS、pH3.5的乳酸、滅菌水分別加入牛津杯中。培養(yǎng)24 h，在平皿上測出抑菌圈的大小，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 乳酸桿菌藥物敏感性試驗

將MRS固體培養(yǎng)基傾斜，然后用移液器取150 μL菌液于培養(yǎng)基邊緣緩慢滴下，使其自然流淌開，再用玻璃推棒輕輕地來回涂布幾次，使其分散均勻，待其自然風(fēng)干后，用滅菌后的無齒鑷夾取藥敏紙片，輕壓緊貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃，厭氧培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，根據(jù)測量結(jié)果，依照WS/T125—1999標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。

1.9 乳酸桿菌致病性分析

選取SPF級小鼠35只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分為7個試驗組，每個試驗組5只小鼠，并對每只小鼠編號，注射前稱量、記錄，飼喂觀察一周。分別用1 mL注射器抽取各菌株37 ℃，24 h厭氧培養(yǎng)物并調(diào)整菌液濃度為1×109cfu·mL-1，取菌懸液0.5 mL腹腔內(nèi)注射。觀察小鼠的精神狀態(tài)及食欲情況并作記錄，第7天后稱取小鼠質(zhì)量，并記錄結(jié)果。

1.10 乳酸桿菌黏附性試驗

在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔中分別加入無菌的細(xì)胞爬片、1 mL不含雙抗和胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和乳酸桿菌懸液，并輕輕晃動，使乳酸桿菌分散均勻。用封口膠將培養(yǎng)板兩端封住后置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。輕輕吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，用pH=7.4的PBS緩沖液洗滌3次，置于無菌操作臺中，待其自然干燥后，加入適量甲醇溶液浸沒玻片，固定10 min，采用革蘭氏染色法對其進(jìn)行染色，待其晾干后，在油鏡下觀察乳酸桿菌在Hela細(xì)胞上的黏附情況。

將200 μL細(xì)胞懸浮液接種于96孔板的孔中，待細(xì)胞長滿單層時，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入200 μL乳酸桿菌懸浮液(無雙抗和胎牛血清的DMEM)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2.5 h。吸出培養(yǎng)液并用DMEM-PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，然后加入125 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37 ℃靜置30 min。取100 μL細(xì)胞裂解溶液于900 μL生理鹽水中進(jìn)行梯度稀釋至10-7，然后取10 μL點滴到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，細(xì)菌計數(shù)，試驗重復(fù)3次，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差表示結(jié)果，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 20.0軟件對實驗中獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析法中的q-檢驗進(jìn)行95%水平上的多重比較，以分析差異顯著性；并對部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主體間效應(yīng)的檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸桿菌的生長曲線

采用菌落計數(shù)和測定D值的方法測定了6株乳酸桿菌的生長曲線，并對其不同時期培養(yǎng)液的pH進(jìn)行測定，結(jié)果分別如圖1、2、3所示。6株乳酸桿菌的生長周期為24 h，對數(shù)生長期為2～11 h。

從圖1可知，6株乳酸桿菌的生長曲線呈“S”型，在11 h處各株乳酸桿菌菌落數(shù)目達(dá)到最大值，且WAV02>WAV01>GPV03>GPV02>WAV03>GPV01。12 h開始，菌落數(shù)開始呈緩慢下降趨勢。

由圖2可知，整個培養(yǎng)過程D值均呈上升趨勢，在4～15 h之間曲線上升趨勢最明顯。WAV01的D值在4～9 h之間上升速度高于其他5株菌，從10 h開始WAV01的D值均低于GPV01、GPV02、GPV03、WAV03，而高于WAV02。WAV02的D值及上升趨勢均低于其他株。

X代表培養(yǎng)液中cfu·mL-1數(shù)值X represents the cfu·mL-1 value in medium圖1 6株乳酸桿菌的菌落計數(shù)曲線Fig.1 Colony counts in culture media of 6 Lactobacillus strains

由圖3可知，培養(yǎng)基的初始pH在6.25左右；2～15 h培養(yǎng)基的pH逐漸降低，15 h時各培養(yǎng)基pH趨于穩(wěn)定，此時各培養(yǎng)液pH在3.3～4.1之間。15～30 h各培養(yǎng)液pH略有降低。

2.2 乳酸桿菌產(chǎn)過氧化氫量的測定

試驗結(jié)果和統(tǒng)計分析結(jié)果表明，大熊貓源乳酸桿菌產(chǎn)過氧化氫的能力略低，大熊貓源各菌株GPV01、02、03菌株產(chǎn)H2O2的能力分別為8.99、8.91和10.25 mmol·L-1，而WAV01、02、03菌株產(chǎn)H2O2的能力分別為10.74、11.67和10.46 mmol·L-1，但各菌株產(chǎn)過氧化氫的能力無顯著差異。

2.3 乳酸桿菌的耐酸性

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基的pH在5～6時，對乳酸桿菌的生長影響不大。隨著培養(yǎng)基pH逐漸下降，乳酸桿菌存活率明顯下降。各菌株接種在pH為2的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，D值均比較小，生長均較差。當(dāng)培養(yǎng)基pH為2～3時，GPV01、GPV02、WAV03的D值在0.2～0.4之間，特別是GPV02具有很好的酸耐受力。pH為3～4，各菌株的D值都明顯上升，其中WAV03上升趨勢最為明顯。pH為 4～5，各菌株的D值上升趨勢相對比較緩和。在5～6之間已經(jīng)趨于穩(wěn)定并達(dá)到最高值，由此可見，GPV01、GPV02、WAV03具有較好的耐酸性。

圖3 6株乳酸桿菌培養(yǎng)液pH變化曲線圖Fig.3 Broth pH curve of 6 Lactobacillus strains

圖4 不同pH條件下6株乳酸桿菌菌株24 h增殖結(jié)果Fig.4 Acid tolerance test results of 6 Lactobacillus strains

2.4 乳酸桿菌的耐熱性

由表1可知，大熊貓陰道源乳酸桿菌GPV01對溫度的耐受性不超過50 ℃，而GPV02和GPV03對50 ℃的耐受性也很弱。人陰道源乳酸桿菌WAV01和WAV02對溫度的耐受性高達(dá)70 ℃。WAV03對高溫的耐受性在37～50 ℃，對60 ℃的耐受性很弱。方差分析結(jié)果顯示，各菌株和溫度的共同作用對存活率的影響差異顯著(P=

0.000)。各菌株的耐熱能力不同，WAV01和WAV02的耐熱能力顯著強(qiáng)于其他4株菌株，大熊貓源的3株乳酸桿菌的耐熱能力顯著低于人陰道源乳酸桿菌，但大熊貓源的3株乳酸桿菌的耐熱能力沒有顯著差異。溫度對6株乳酸桿菌的存活率有顯著影響，40 ℃至80 ℃間，隨著溫度上升，6株菌的存活率顯著降低，溫度從40 ℃上升到50 ℃時，6株菌的存活率出現(xiàn)跳躍式下降。

2.5 乳酸桿菌抑菌性

通過對TSA培養(yǎng)基上乳酸桿菌上清液抑菌圈直徑的測量和統(tǒng)計，其結(jié)果如表3所示。

多重比較結(jié)果顯示，在抑菌能力方面，GPV01、GPV02、GPV03、WAV01、WAV02和WAV03之間無統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異，雖然對不同致病菌的抑制程度有所不同，但也未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。這6株乳酸桿菌對3種致病菌的抑制作用顯著低于pH 3.5的乳酸。

2.6 乳酸桿菌藥物敏感性

本次藥敏試驗選用了7類共13種抗生素對乳酸桿菌進(jìn)行藥物敏感性試驗，結(jié)果顯示，GPV01、GPV02、GPV03、WAV01、WAV02和WAV03均對多西環(huán)素、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、阿莫西林敏感，對鏈霉素、氧氟沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、磺胺甲基異惡唑耐藥。GPV01、GPV03、WAV01、WAV02對四環(huán)素敏感，GPV02對四環(huán)素敏感性處于中等，WAV03對四環(huán)素耐藥。GPV02對利福平敏感，GPV01、WAV03對利福平耐藥， GPV03、WAV01、WAV02對利福平的敏感性處于中等。

表1 6株乳酸桿菌經(jīng)不同溫度處理不同時間的存活率

Table 1 Survival rates of 6Lactobacillusat different temperature%

表2 菌株和溫度對存活率的影響

Table 2 Effects of strain and temperature on survival rate

菌株Strain平均存活率Averagesurvivalrate/%溫度Temperature/℃平均存活率Averagesurvivalrate/%WAV024523a409075aWAV014435a502711bWAV032265b601558cGPV03200bc70601dGPV021923bc80000eGPV011588c

同一列無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

In the same column， the values with no same lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.

2.7 乳酸桿菌對小鼠的致病性試驗

6組健康小鼠分別腹腔注射0.5 mL菌懸液，對照組小鼠注射等量生理鹽水，飼喂1周后，實驗組和對照組小鼠精神食欲正常，均沒有出現(xiàn)其他臨床癥狀，根據(jù)《中華人民共和國藥典》，該6株乳酸桿菌對小鼠無致病性。

表3 6株乳酸桿菌上清液抑菌活性比較

Table 3 Bacteriostasis activity comparison of sixLactobacillussupernatants

mm

同一行無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

In the same row， the values with no same lowercase letters indicated significant differences atP<0.05 level.SAU，Staphylococcusaureus;E.coli，Escherichiacoli; SS，Streptococcus.

表4 乳酸桿菌對7類13種抗生素的耐藥性

Table 4 Drug resistance ofLactobacillus with 7 category， 13 kinds of antibiotics

mm

R，耐藥；I，中等；S，敏感。

R， Resistance; I， Intermediate; S， Sensitive.

2.8 乳酸桿菌對Hela細(xì)胞的黏附性

根據(jù)圖5和表5可知，同種來源的不同乳酸桿菌的黏附能力不同，不同來源的同種乳酸桿菌的黏附能力也相差較大。人陰道源乳酸桿菌對Hela細(xì)胞的黏附能力顯著高于大熊貓源乳酸桿菌。

革蘭氏染色Gram staining圖5 乳酸桿菌黏附Hela細(xì)胞的顯微圖(1000×)Fig.5 Adherence effect of 6 Lactobacillus strains to Hela cell (1000×)

表5 乳酸桿菌對Hela細(xì)胞的黏附

Table 5 Adherence effect of 6Lactobacillusto Hela cells

菌株Strain實驗1Test1?實驗2Test2?實驗3Test3?每個細(xì)胞黏附細(xì)菌數(shù)AdherenceLactobacillusnumberperHelacellWAV02415×105437×105462×1055475±240aWAV03248×105236×105304×1053283±370bGPV01224×105251×105219×1052892±176bWAV01195×105192×105179×1052358±087cGPV03151×105167×105133×1051879±174dGPV02056×105051×105057×105683±033e

*, Hela細(xì)胞數(shù)為8×103cells·孔-1。

*, The unmber of Hela Cells is 8×103cell·hole-1

3 討論

3.1 乳酸桿菌產(chǎn)過氧化氫的作用

本試驗結(jié)果表明，人陰道源乳酸桿菌WAV02產(chǎn)過氧化氫能力是6株乳酸桿菌中最強(qiáng)的。其中GPV02和WAV03均是植物乳酸桿菌，但二者產(chǎn)過氧化氫能力存在較大差異。這也證明了同種不同株乳酸桿菌產(chǎn)H2O2的能力不同[5]。目前對于乳酸桿菌產(chǎn)H2O2與其抑菌能力的關(guān)系研究結(jié)果不一。有研究認(rèn)為乳酸桿菌產(chǎn)生的H2O2通過直接殺菌或憑借過氧化物酶的作用來發(fā)揮其抑制、殺傷其他細(xì)菌的功能，陰道分泌物中過氧化物酶，在鹵素離子存在的情況下能使H2O2的殺菌能力明顯增強(qiáng)[6]。周曉梅等[7]發(fā)現(xiàn)陰道中產(chǎn)高水平過氧化氫乳酸桿菌的存在與孕婦細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)及后來的羊膜炎和早產(chǎn)的風(fēng)險有負(fù)相關(guān)性。謝菲等[8]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)H2O2的乳酸桿菌在防御孕婦陰道感染、降低不良妊娠結(jié)局發(fā)生率中起重要作用。Voltan等[9]研究發(fā)現(xiàn)卷曲乳酸桿菌M247分泌H2O2作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)PPAR-γ激活I(lǐng)EC，直接調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞對炎癥刺激的反應(yīng)。Otero等[10]發(fā)現(xiàn)加氏乳酸桿菌CRL1421和CRL1412均能夠通過產(chǎn)生H2O2來抑制奶牛陰道金黃色葡萄球菌的感染。但也有研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌產(chǎn)生H2O2的能力與其抑菌作用的關(guān)系并不明顯[11]，即該研究中的乳酸桿菌發(fā)揮其抑菌作用并不是因為其產(chǎn)H2O2的作用。本研究中大熊貓源乳酸桿菌產(chǎn)H2O2的能力不及人源乳酸桿菌，這是否影響大熊貓陰道環(huán)境及生育有待進(jìn)一步研究。

3.2 乳酸桿菌的耐酸性

目前商品化的乳酸桿菌制劑主要是口服劑型和外用劑型。乳酸桿菌能否正常發(fā)揮其益生性作用，很大程度上取決于菌落是否能順利通過胃的強(qiáng)酸性環(huán)境，到達(dá)相應(yīng)的部位，從而發(fā)揮微生態(tài)調(diào)節(jié)功能[12]。Reid等[13]研究發(fā)現(xiàn)口服乳酸桿菌能夠明顯改善陰道內(nèi)環(huán)境，乳酸桿菌數(shù)量明顯增加。Millette等[14]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的抗菌作用是由于產(chǎn)有機(jī)酸和在酸性條件下具有活性的蛋白質(zhì)物質(zhì)。另有報道證實從健康人的糞便中分離到的乳酸桿菌在pH為3～5時具有顯著的抑菌活性，對多數(shù)細(xì)菌具有抑制作用，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌[15]。Lin等[16]報道了嗜酸乳酸桿菌在MRS肉湯中培養(yǎng)20 h，其培養(yǎng)液的pH下降到3.78，當(dāng)培養(yǎng)液的pH被調(diào)到7.2時，其抗菌活性幾乎可忽略不計。根據(jù)以上研究可知，不管是通過胃的酸性環(huán)境，還是發(fā)揮其抑菌功能均要求乳酸桿菌具有良好的耐酸性。綜上可知，酸性環(huán)境是乳酸桿菌發(fā)揮抑菌活性的前提，同時強(qiáng)酸性環(huán)境對乳酸桿菌的生長也有抑制作用。本試驗中的GPV01、GPV02、WAV03具有良好的耐酸性。

3.3 乳酸桿菌的耐熱性

3株人陰道源乳酸桿菌耐熱性強(qiáng)于3株大熊貓陰道源乳酸桿菌。不同來源的同種乳酸桿菌在相同培養(yǎng)條件下耐熱性不一樣。在乳酸菌使用過程中，不同的處理方式對乳酸菌的破壞程度不同。研究表明，在進(jìn)行水浴的濕熱條件下，乳酸菌受到的破壞程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于在飼料中的情況[17]。王旭明等[18]從厭氧發(fā)酵的食物垃圾中分離到一株耐熱乳酸菌，其生長的最高環(huán)境溫度為52 ℃。乳酸菌能夠耐受一定程度的高溫，但是其耐熱性是由菌株本身特性及處理工藝決定的[19]。干酪乳酸桿菌在45 ℃時生長無明顯抑制作用，當(dāng)溫度升高到60 ℃時菌株呈現(xiàn)出熱敏感性，不能生長[20]。大熊貓正常體溫大約在35～36 ℃，因此3株大熊貓陰道乳酸桿菌在健康大熊貓體內(nèi)能夠較好地生長。

3.4 乳酸桿菌的抑菌活性

乳酸桿菌能夠產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，如有機(jī)酸、過氧化氫、蛋白質(zhì)物質(zhì)(如細(xì)菌素、類細(xì)菌素)等物[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌的抗菌活性是因為產(chǎn)酸造成環(huán)境pH下降所致[22]。Millette等[14]也發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌的抗菌作用是因為產(chǎn)有機(jī)酸和在酸性條件下具有活性的蛋白質(zhì)物質(zhì)。調(diào)節(jié)乳酸桿菌培養(yǎng)液上清液的pH至中性會使其抗菌活性下降甚至消失[23]。Lin等[16]研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳酸桿菌在MRS肉湯中培養(yǎng)20 h，其培養(yǎng)液的pH下降到3.78，當(dāng)培養(yǎng)液的pH被調(diào)到7.2時，其抗菌活性幾乎可忽略不計。Juarez Tomas等[24]發(fā)現(xiàn)從女性陰道分離到的嗜酸乳桿菌由于產(chǎn)乳酸而能夠抑制大腸埃希菌的生長。另外，Cook等[25]報道了有機(jī)酸不僅對病原菌起屏障作用，同時在維持結(jié)腸健康方面也起到了至關(guān)重要的作用。本實驗所選菌株對不同致病菌的抑制程度有所不同，但也未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。這6株乳酸桿菌對3種致病菌的抑制作用顯著低于pH 3.5的乳酸。可見酸性條件是保證乳酸桿菌發(fā)揮抑菌功能的基礎(chǔ)。

3.5 乳酸桿菌的藥物敏感性

評價乳酸桿菌對藥物敏感性具有非常重要的臨床意義。有研究表明，益生菌與抗生素配伍使用能夠提高動物的生產(chǎn)性能[26]。但抗生素不僅能夠有效地抑制病原微生物，同時也會殺死正常的微生物[27]。本試驗選擇了7類13種較為常規(guī)的抗生素進(jìn)行乳酸桿菌抗生素敏感性測定。結(jié)果表明，不同乳酸桿菌對抗生素的敏感性不同。在臨床治療中，應(yīng)盡量避免選取乳酸桿菌敏感的抗生素。同時有研究表明，有些乳酸桿菌本身對抗生素不敏感，乳酸桿菌的耐藥性除與質(zhì)粒相關(guān)外，還與細(xì)菌的表型、環(huán)境以及來源等有關(guān)[27]。因此，在臨床上使用益生菌與特定抗生素聯(lián)合用藥時，益生菌可能會受到一定的抑制作用，但其益生菌作用并不會完全喪失。故益生菌與抗生素配伍使用時需要恰當(dāng)?shù)呐湮楸壤梢酝ㄟ^增加益生菌的活菌數(shù)量，或者減少抗生素的使用量來達(dá)到二者的協(xié)同作用[28]。

3.6 乳酸桿菌的黏附性

乳酸桿菌對病原微生物的生物屏障作用，抗癌作用，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，延緩機(jī)體衰老等生理功能都是通過其黏附于相應(yīng)靶器官的上皮細(xì)胞表面，定植形成穩(wěn)定的菌群發(fā)揮其益生作用[29]。黏附是乳酸桿菌發(fā)揮其生物屏障功能的第一步，乳酸桿菌與宿主細(xì)胞的黏附是其發(fā)揮生理作用的基本條件。目前對細(xì)菌黏附能力的評價無具體標(biāo)準(zhǔn)，主要通過計數(shù)法和視覺觀察法來進(jìn)行大致的評價。對于乳酸桿菌黏附能力強(qiáng)弱也并無相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。同種來源不同乳酸桿菌的黏附能力不同，同種不同來源乳酸桿菌的黏附能力也存在較大差異。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Study on biological characteristics ofLactobacillusfrom giant panda vagina

MA Xiaoping1; YANG Tianyi1; YU Yan1; ZHANG Zhihe2，*， WANG Chengdong3, GU Yu4，*

(1.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.ChengduResearchBaseofGiantPandaBreeding，Chengdu610000，China；3.ChinaConservationandResearchCenterfortheGiantPanda，Ya’an625000，China; 4.CollegeofLifeScience，SichuanAgriculturalUniversity，Ya’an625014，China)

In the present study， 3Lactobacillusstrains of giant panda vagina (LactobacillussalivariusGPV01，LactobacillusplantarumGPV02 andLactobacillussaerimneriGPV03) were used as experimental group， and 3Lactobacillusstrains of woman vagina (LactobacillusacidophilusWAV01，LactobacilluscrispatusWAV02 andLactobacillusplantarumWAV03) were used as control group to explore the difference of these strains in hydrogen peroxide production capacity， acid resistance， heat resistance， antibacterial activity， drug sensitivity and adhesiveness. It was shown thatL.acidophilusWAV01，L.crispatusWAV02 andL.plantarumWAV03 possessed higher H2O2-producing ability and heat-resistance thanL.salivariusGPV01，L.plantarumGPV02 andL.saerimneriGPV03 under the same culture condition.L.salivariusGPV01，L.plantarumGPV02 andL.plantarumWAV03 exhibited acid tolerance.Dvalues ofLactobacillussuspensions were all between 0.2 to 0.55 for these strains when the pH was between 2 to 3 in the culture medium， and among these strains，L.plantarumGPV02 showed the highestDvalue (D=0.55) under the above condition. Six culture supernatants of theLactobacillusstrains had different inhibitory effects onEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandHemolyticstreptococcus. SixLactobacillusstrains showed weaker inhibition on three pathogenic bacteria than lactic acid (pH 3.5). SixLactobacillusstrains were highly sensitive to doxycycline， ampicillin， ceftriaxone， cefotaxime， amoxicillin， and were sensitive to tetracycline and rifampicin. SixLactobacillusstrains showed resistance to streptomycin， ofloxacin， gentamycin， selectrin， ciprofloxacin and sulfamethoxazole. SixLactobacillusstrains could stick on Hela， and the average adhesion number of GPV01， GPV03， WAV01 and WAV03 on each Hela cell was 18.8-32.8. WAV02 had the strongest adhesion ability (54.75±2.40)·cell-1， while GPV02 had the worst adhesion ability (6.83±0.33)·cell-1.

giant panda;Lactobacillus; biological characteristics

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.07.06

2016-07-25

國家科技支撐計劃項目(2012BAC01B06)；四川省科技廳基礎(chǔ)研究計劃項目(2013JY0175)；大熊國際資金項目(AD1415)

馬曉平(1976—)，男，土家族，重慶石柱人，博士，副教授，從事臨床獸醫(yī)學(xué)的教學(xué)科研工作。E-mail: mxp886@sina.com.cn

*通信作者，張志和，E-mail: pandaking1888@126.com；古玉，E-mail: guyu632@sicau.edu.cn

S857.2+2；S852.6

A

1004-1524(2017)07-1093-10

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(7): 1093-1102

馬曉平，楊天意，俞演，等. 大熊貓陰道源乳酸桿菌生物學(xué)特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(7): 1093-1102.