基于譜效關系的小兒肺熱咳喘顆粒抑菌作用研究

王執(zhí)一 曾珊 羅勇 謝曉 徐楊 伍利華

摘要：目的 建立小兒肺熱咳喘顆粒高效液相色譜（HPLC）特征圖譜，研究小兒肺熱咳喘顆粒對肺炎鏈球菌的抑菌活性并建立譜效關系模型。方法 以HPLC法測定15批小兒肺熱咳喘顆粒特征圖譜；牛津杯法研究抑菌活性。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）建立15小兒肺熱咳喘顆粒特征圖譜并進行相似度評價和特征峰指認。以相對抑菌活性為抑菌作用指標，進行灰色關聯(lián)度分析，利用SPSS 21.0軟件進行Pearson相關性分析，建立譜效關系模型并驗證。結果 共得到13個特征峰，相似度不低于0.936；指認2、9、11號峰為綠原酸、黃芩苷、木犀草素，13個特征峰均與相對抑菌活性呈正相關，灰色關聯(lián)度值為0.743～0.924，2、9、11、12號峰為抑菌主要活性成分；驗證3批小兒肺熱咳喘顆粒樣品相對抑菌活性的預測值與測量值相對誤差均小于6%。結論 小兒肺熱咳喘顆粒抑制肺炎鏈球菌主要成分包括綠原酸、黃芩苷、木犀草素，且抑菌作用可能由多種成分協(xié)同作用產(chǎn)生，與多味藥材的配伍有關，驗證了中成藥具有多成分協(xié)同作用的特點；初步確定建立的譜效關系模型可用于小兒肺熱咳喘顆粒抗菌作用的預測與評價。

關鍵詞：小兒肺熱咳喘顆粒；特征圖譜；肺炎鏈球菌；抑菌活性；譜效關系

中圖分類號：R285文獻標志碼：A

Study on the antibacterial effect of Xiao'er Feire Kechuan Granules based on spectrum-effect relationship

Wang Zhiyi1， ?Zeng Shan1， ?Luo Yong2， ? Xie Xiao1， ?Xu Yang1， ?and ?Wu Lihua3

（1 School of ?pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106；2 Jiangsu Kangyuan Pharmaceutical Co.， ?Ltd.， Lianyungang 222001；

3 School of Food and Bioengineering， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To establish the high performance liquid chromatography（HPLC） characteristic chromatogram of Xiao'er Feire Kechuan Granules， study the antibacterial activity of Xiao'er Feire Kechuan Granules against Streptococcus pneumoniae and establish the spectrum-effect relationship model. Methods The characteristic chromatograms of 15 batches of Xiao'er Feire Kechuan Granules were determined by HPLC. The antibacterial activity was studied by the Oxford Cup method. The similarity evaluation system of traditional Chinese medicine fingerprints （2012 A edition） was used to establish the characteristic spectrum of 15 Xiao'er Feire Kechuan Granules， and the similarity evaluation and characteristic peak identification were carried out. The relative bacteriostatic activity was used as the bacteriostatic index， ?and the gray correlation analysis was carried out. The Pearson correlation analysis was carried out by SPSS 21.0 software， ?and the spectrum-effect relationship model was established and verified. Results A total of 13 characteristic peaks were obtained， ?and the similarity was not less than 0.936. Peaks 2， ?9 and 11 were identified as chlorogenic acid， ?baicalin and luteolin， ?respectively. These 13 characteristic peaks were positively correlated with the relative antibacterial activity， ?and the gray correlation degree was 0.743～0.924. Peaks 2， ?9， ?11 and 12 were the main antibacterial active components. The relative error between the predicted value and the measured value of the relative antibacterial activity of 3 batches of Xiao'er Feire Kechuan Granules was less than 6 %. Conclusion The main components of Xiao'er Feire Kechuan Granules inhibiting Streptococcus pneumoniae included chlorogenic acid， ?baicalin and luteolin， ?and the antibacterial effect might be produced by the synergistic effect of various components， ?which is related to the compatibility of multiple medicinal materials， ?which verified that Chinese patent medicine had the characteristics of the multi-component synergistic effect. The established spectrum-effect relationship model could be used to predict and evaluate the antibacterial effect of Xiao'er Feire Kechuan Granules.

Key words Xiao'er Feire Kechuan Granules; Feature map; Streptococcus pneumoniae; Antibacterial activity; Spectral efficiency relationship

肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）是引起急性呼吸道感染性疾病的主要致病菌之一，主要引起肺炎，繼發(fā)氣管炎或腦膜炎等疾病[1]。有研究表明小兒肺熱咳喘顆粒對肺炎鏈球菌有一定抑菌作用[2]。小兒肺熱咳喘顆粒是由經(jīng)典名方“麻杏石甘湯”[3]改良而成的現(xiàn)代中藥制劑，由麻黃、苦杏仁、石膏、知母、黃芩、板藍根、金銀花、連翹、魚腥草、麥冬和甘草等11味藥組成。主要功效有清熱解毒、宣肺平喘、止咳化痰等，臨床常用于治療兒童肺炎類疾病[4-5]。倪文琳等[6]通過多成分含量測定對小兒肺熱咳喘顆粒進行質量評價，但并未聯(lián)系藥效?；谏鲜觯菊n題組將采用HPLC法建立小兒肺熱咳喘顆粒特征圖譜，采用牛津杯法研究小兒肺熱咳喘顆粒對肺炎鏈球菌的抑菌作用，將特征峰與抑菌作用進行相關性分析和灰色關聯(lián)度分析，建立譜效關系。

1 主要儀器與材料

1.1 儀器

LC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司）、JJ-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州市金凈凈化設備科技有限公司）、SQP型萬分之一電子分析天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）、TG20G型離心機（天津廣豐科技有限公司）、DH3006A型電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司）、電子數(shù)顯卡尺（成都成量工具集團有限公司，量程規(guī)格 0～150 mm 精度：0.01 mm）、XFS-280型手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 供試藥品

小兒肺熱咳喘顆粒（四川光大制藥有限公司），黃芩苷對照品、綠原酸對照品、木犀草素對照品（四川維克奇生物科技有限公司，批號 wkq21010608、wkq20042702、wkq21040905，純度≥98%），色譜級乙腈（西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），分析級甲醇、磷酸（成都科隆化學品有限公司，批號 2022080102、2018110501），血瓊脂培養(yǎng)基（常德比克曼生物科技有限公司），阿莫西林膠囊（葵花藥業(yè) 批號：22063111），0.5MCF比濁管（溫州市康泰生物科技有限公司，批號：UL25130），純凈水。

1.3 菌種

肺炎鏈球菌（BNCC北納生物科技有限公司，批號：22031117）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Supersil AQ-C18（4.6 mm×250 mm，

5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.8 mL/min；檢測波長為294 nm，梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

2.2 供試品的制備

精密稱定3.0 g小兒肺熱咳喘顆粒于錐形瓶內，加25 mL 50%甲醇，超聲（40 kHz，240 W）20 min溶解，濾過，取續(xù)濾液適量，離心（8000 r/min）20 min，取上清液，經(jīng)0.45 ?m微孔濾膜濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

稱取“1.2”項下小兒肺熱咳喘顆粒（批號：2101005）3.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，以峰面積大且穩(wěn)定、分離度較好的黃芩苷色譜峰作為S峰，取其峰面積和保留時間計算RSD。結果表明峰面積和保留時間的RSD均小于1.3%，即儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

稱取“1.2”項下小兒肺熱咳喘顆粒（批號：2101005）3.0g，按“2.2”項下方法制備供試品，平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積大且穩(wěn)定，分離度較好的黃芩苷色譜峰作為S峰，取其單位取樣量下的峰面積和保留時間計算RSD。結果，峰面積和保留時間的RSD均小于1.2%，表明本方法重復性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

稱取“1.2”項下小兒肺熱咳喘顆粒（批號：2101005）3.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品，分別于室溫下放置0、1、2.5、4、7和15 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積大且穩(wěn)定，分離度較好的黃芩苷色譜峰作為S峰，取其峰面積和保留時間計算RSD。結果，峰面積和保留時間的RSD均小于1.2%，表明供試品溶液在室溫下放置15 h穩(wěn)定性良好。

2.4 小兒肺熱咳喘顆粒HPLC特征圖譜研究

2.4.1 小兒肺熱咳喘顆粒HPLC特征圖譜生成

取15批小兒肺熱咳喘顆粒分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定。將15批小兒肺熱咳喘顆粒樣品的特征圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）進行分析，得到小兒肺熱咳喘顆粒樣品HPLC疊加指紋譜圖和對照特征圖譜，詳見圖1～2。

2.4.2 相似度評價

選取每批小兒肺熱咳喘顆粒特征圖譜中峰形較好的13個色譜峰，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）評價相似度，并繪制動態(tài)熱圖。結果表明15批小兒肺熱咳喘顆粒樣品的相似度均不低于 0.936，詳見表2。

2.4.3 特征峰指認

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）軟件，設置時間窗口為0.1 min，選擇15批小兒肺熱咳喘顆粒HPLC特征圖譜中峰形較好的色譜峰進行多點校正，以中位數(shù)法生成HPLC對照圖譜，指認出13個特征峰；向“2.2”項下方法制備的供試品中加入少量對照品，指認出2號峰為綠原酸、9號峰為黃芩苷、11號峰為木犀草素。以9號峰峰面積為參照，計算特征峰的相對保留時間和相對峰面積，結果詳見表3～4。

3 小兒肺熱咳喘顆粒抑菌作用研究

3.1 細菌培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取少量BNCC北納生物科技生產(chǎn)的肺炎鏈球菌，溶于少量無菌水中，搖勻。用接種環(huán)蘸取少量菌液，采用平板劃線法接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，出現(xiàn)明顯菌落后，挑取少量細菌溶于無菌水中，采用上述同樣方法進行傳代，即得。

3.2 藥液濃度篩選

采用牛津杯法[7]，用接種環(huán)挑取適量“3.1”項下傳代得到的肺炎鏈球菌，以無菌水調制1.5×

108 CFU/mL菌液，倒平板于血瓊脂培養(yǎng)基中，分別配置0.02、0.04、0.06、0.12和0.24 g/mL 濃度的小兒肺熱咳喘顆粒溶液，分別吸取各濃度溶液80 μL注入牛津杯中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌圈辨識度，結果表明藥液濃度為0.06 g/mL時抑菌效果最佳。

3.3 菌液濃度篩選

采用牛津杯法，用接種環(huán)挑取“3.1”項下傳代得到的肺炎鏈球菌，加入適量無菌水，用比濁管比對制成3.75×107、7.5×107、1.5×108 、3×108 和6×

108 CFU/mL的菌液，分別倒平板于5個血瓊脂培養(yǎng)基中，每個平板放入1個牛津杯，取配置好的供試品溶液（0.06 mg/mL），分別吸取80 μL注入牛津杯中，

37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌圈辨識度，結果表明菌液濃度為1.5×108 ?CFU/mL時抑菌效果最佳。

3.4 供試品、陽性對照的制備

稱取3.0 g小兒肺熱咳喘顆粒，精密稱定，精密量取50 mL水溶解制成0.06 g/mL溶液，即得；對照品為6.16 μg/mL濃度的阿莫西林溶液。

3.5 方法學考察

精密度試驗按“3.4”項下方法制備供試品，采用牛津杯法分別吸取80 μL供試品于同一培養(yǎng)基6個牛津杯中，結果顯示菌圈大小RSD為0.7%，表明該方法精密度良好。

重復性試驗按“3.4”項下方法平行制備6份供試品，采用牛津杯法吸取每份供試品80 μL于同一培養(yǎng)基6個牛津杯中，結果顯示單位取樣量抑菌圈大小RSD為0.37%，表明該方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗按“3.4”項下方法制備供試品，采用牛津杯法在6個血瓊脂培養(yǎng)基上隔0、 0.5、1、2、4和6 h進行加樣操作，結果顯示抑菌圈大小RSD為0.7%，表明該方法在6 h內穩(wěn)定性良好。

線性關系試驗分別吸取80 μL濃度分別為1.54、2.31、3.08、4.62和6.16 μg/mL的阿莫西林溶液于同一血瓊脂培養(yǎng)基5個牛津杯中，以濃度為自變量，菌圈面積為因變量進行線性回歸，結果顯示r2=0.999，回歸方程Y=51.1218X＋192.007。

3.6 相對抑菌活性研究

按“3.4”項下方法制備供試品，用接種環(huán)挑取“3.1”項下傳代得到的肺炎鏈球菌，以無菌水調制1.5×108 CFU/mL菌液，倒平板于血瓊脂培養(yǎng)基中，采用牛津杯法，分別吸取供試品溶液、對照品溶液、水各80 μL點樣于同一血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈橫豎直徑，計算菌圈面積和相對抑菌活性，結果見表5，抑菌圖見圖3。

4 小兒肺熱咳喘顆粒抑菌譜效關系分析

4.1 相關性、灰色關聯(lián)度分析

以15批小兒肺熱咳喘顆粒HPLC特征圖譜特征峰峰面積為自變量，相對抑菌活性為因變量，采用SPSS 21.0軟件進行Pearson相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)13個特征峰峰面積與相對抑菌活性均呈正相關，相關系數(shù)較大的（≥0.85）依次為9、12、11、2號峰，且除13號峰外相關系數(shù)均不小于0.39，提示小兒肺熱咳喘顆粒抑制肺炎鏈球菌的作用可能與其處方中多味藥材配伍使用有關，符合中成藥多成分協(xié)同作用的特點，詳見表5。以15批小兒肺熱咳喘顆粒HPLC特征圖譜13個特征峰峰面積為特征序列變量，相對抑菌活性為母序列變量，導入SPSSPRO數(shù)據(jù)處理網(wǎng)站（https：//www.spsspro.com/）進行灰色關聯(lián)度分析，針對數(shù)據(jù)進行無量綱化處理（均值化），設置分辨系數(shù)為0.5，計算灰色關聯(lián)度值，結果發(fā)現(xiàn)各特征峰與相對抑菌活性的關聯(lián)度為0.743～0.924，關聯(lián)度值較高的（≥0.85）依次為12、11、9、2號峰，對抑制肺炎鏈球菌有較大貢獻，詳見表5。結合相關性分析結果，發(fā)現(xiàn)相關性分析結果與灰色關聯(lián)度分析結果大致吻合，二者前四位排名有所差異但均為2、9、11、12號峰且數(shù)值均大于0.85，對抑制肺炎鏈球菌有較大貢獻，提示小兒肺熱咳喘顆粒抑制肺炎鏈球菌的主要成分為2、9、11、12號峰所代表的化學成分，其中2、9、11號峰分別代表綠原酸、黃芩苷、木犀草素。

4.2 譜效關系模型建立

采用SPSS 21.0軟件，以小兒肺熱咳喘顆粒特征峰峰面積為X，相對抑菌活性為Y，采用多重線性回歸建立譜效關系模型。結果，回歸方程為Y=－（2.47E-07）X峰1－（3.57E-07）X峰2＋（1.20E-07）X峰3＋（3.81E-07）X峰4－（8.25E-08）X峰5＋（1.11E-07）X峰6－（2.58E-07）X峰7＋（3.90E-07）X峰8＋（4.62E-07）X峰9－（4.82E-07）X峰10－（7.99E-07）X峰11＋（1.71E-07）X峰12－（8.64E-08）X峰13－3.947。

4.3 譜效關系模型驗證

另取3批小兒肺熱咳喘顆粒（批號分別為2104017、2104018和2101005），分別測定各批次樣品的特征峰峰面積和相對抑菌活性，將特征峰峰面積代入“4.2”項下回歸方程中，即得相對抑菌活性預測值，并與已知測量值進行比較。結果表明3批小兒肺熱咳喘顆粒樣品相對抑菌活性的預測值與測量值的相對誤差分別為-1.05%、+3.3%、-5.78%，表明建立的譜效關系模型可用于小兒肺熱咳喘顆?？咕饔玫念A測與評價。

5 討論

據(jù)相關文獻報道，綠原酸可破壞肺炎鏈球菌的細胞膜，導致該類細菌失去細胞膜保護而實現(xiàn)抑菌[8-9]，黃芩苷和木犀草素對肺炎鏈球菌有較好的抑菌效果[10-11] ，楊麗萍等[12]研究結果表明銀黃煎液及其五級膜截留液中黃芩苷、綠原酸具有體外抑制肺炎鏈球菌的作用。本研究發(fā)現(xiàn)綠原酸、黃芩苷、木犀草素為抑菌主要活性成分，與文獻報道相符。

蔣慶佳等[13]認為由于中藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，其抑菌作用可能由多種成分、多種機制協(xié)同發(fā)揮起效。研究表明黃芩、錦燈籠[14-15]

對抑菌活性有較大貢獻的色譜峰均超過10個。竹葉椒揮發(fā)油[16]抗菌主要活性成分有3個，指紋圖譜中各色譜峰與抑菌活性的關聯(lián)度均大于0.78。銀翹散抑菌譜效關系[17]中有14個共有峰與抑菌作用密切相關，7個抑菌主要活性成分，與牛黃上清丸[18]數(shù)量相同。芩蘇膠囊[19]抑制5種致病菌的主要活性成分均超過4個，抑制肺炎鏈球菌主要活性成分10個。小兒肺熱咳喘顆粒各特征峰峰面積與相對抑菌活性均為正相關且除13號峰外不小于0.39，灰色關聯(lián)度值均大于0.74，表明除抑菌主要活性成分其他成分可能對抑菌起協(xié)同作用。

中藥質量控制的根本目的是對藥效的控制[20]，中成藥組分復雜，多數(shù)中成藥物質基礎和作用機制探究仍處于探索階段[21]。特征圖譜是一種對復雜成分中藥進行整體質量控制的方法，比起單一的成分檢測更適合對中藥“多成分-多靶點”的復雜作用機制進行評價，但缺乏與藥效的相關性[22]。譜效關系研究是將中藥指紋圖譜中的化學成分與中藥藥效聯(lián)系起來，通過數(shù)據(jù)分析篩選出與藥效密切相關成分的綜合評價體系，保留了中醫(yī)藥的整體觀念。但受不同研究方法影響，如樣品采集波長、制備方法等，單張化學圖譜無法完整體現(xiàn)中藥的總化學成分，數(shù)據(jù)處理方法不同也會對結果產(chǎn)生一定影響[23]。

本研究建立了小兒肺熱咳喘顆粒抑制肺炎鏈球菌譜效關系模型并驗證，3批樣品預測值與測量值的相對誤差絕對值均不超過6%，說明此模型可用于預測和評價小兒肺熱咳喘顆粒對肺炎鏈球菌的抑制作用。但特征圖譜仍有10個色譜峰未成功指認，需進行結構鑒定，且抑菌作用機制尚不明確，仍需繼續(xù)研究，以便為小兒肺熱咳喘顆粒的臨床使用和中藥抑菌藥物開發(fā)提供一定參考[24]。

參 考 文 獻

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