類器官技術(shù)在乳腺癌研究中的現(xiàn)狀及應(yīng)用

基金項目：廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金區(qū)域聯(lián)合基金項目（地區(qū)培育項目）（2022A1515140091）；廣東省中醫(yī)藥局中醫(yī)藥科研項目（20231324）

作者單位：1廣東醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（郵編524000）；2佛山市第一人民醫(yī)院

作者簡介：陳芷彥（2000），女，碩士在讀，主要從事乳腺癌的手術(shù)治療方面研究。E-mail：1067492540@qq.com

△通信作者 E-mail：zhoudanms@hotmail.com

摘要：類器官能夠很好地模擬腫瘤的異質(zhì)性，包括腫瘤微環(huán)境、免疫反應(yīng)等，這有助于更準(zhǔn)確地預(yù)測患者對藥物的反應(yīng)和治療效果，且可以在藥物進(jìn)入體內(nèi)前進(jìn)行藥物篩選，從而節(jié)約臨床試驗的時間和成本。然而，類器官的研究仍面臨一些挑戰(zhàn)，如技術(shù)限制、倫理問題等。就乳腺癌類器官的研究進(jìn)展，包括類器官的定義、發(fā)展歷程、優(yōu)勢以及在乳腺癌研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：類器官；乳腺腫瘤；藥物篩選；個性化治療

中圖分類號：R655.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.11958/20231745

Status and application of organoid technology in breast cancer research

CHEN Zhiyan1， 2， WU Qiuyuan1， 2， DENG Yuhua2， ZHOU Dan1， 2△

1 The First Clinical College， Guangdong Medical University， Zhanjiang 524000， China; 2 The First People’s Hospital of Foshan

△Corresponding Author E-mail： zhoudanms@hotmail.com

Abstract： Organoids can well simulate the heterogeneity of tumors， including tumor microenvironment and immune response， which helps to more accurately predict patient responses to drug and treatment effects. Organoids can be used for drug screening before drugs enter body， thus reducing the time and cost of clinical trials. However， research on tissue-organoids still faces some challenges， such as technical limitation and ethical issue. This review mainly introduces the progress in the research of breast cancer organoids， including the definition of organoids， development history， advantages and application in breast cancer research.

Key words： organoids; breast neoplasms; drug screening assays; personalized medicine

乳腺癌是目前導(dǎo)致婦女癌癥死亡的首要惡性腫瘤，且其發(fā)病率和病死率仍在不斷上升［1］。乳腺癌的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍舊是大多數(shù)患者治療失敗的主要原因。根據(jù)組織病理學(xué)和分子評價，乳腺癌目前被分為多個亞型，包括Luminal A型、Luminal B型、人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）過表達(dá)型和三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），這些亞型在遺傳、病理和臨床上都存在差異，針對不同亞型選擇的治療方案決定了乳腺癌患者的預(yù)后［2］。

類器官是具有干細(xì)胞潛力的細(xì)胞在三維（three-dimensional，3D）培養(yǎng)系統(tǒng)下孵育以通過黏附聚集、自組織并分化成具有相應(yīng)器官組織形態(tài)的3D細(xì)胞團，旨在通過體外培養(yǎng)和擴增人體細(xì)胞，構(gòu)建出具有特定功能和結(jié)構(gòu)的器官模型［3］。該方法在過去20年中得到了廣泛的關(guān)注和發(fā)展。2011年，荷蘭哈勃克研究所的Sato團隊［4］成功地從成人干細(xì)胞培養(yǎng)出了腸道類器官，這一突破標(biāo)志著在培養(yǎng)皿中生長3D微型器官的重大進(jìn)展。2015年，該團隊又成功建立了胃和肝臟類器官［5］。此后類器官相關(guān)研究進(jìn)展迅速。研究人員開始使用類器官來模擬疾病發(fā)展，包括癌癥、囊性纖維化和各種遺傳性疾病，這為了解疾病機制提供了更好的模型，并為測試潛在的藥物治療方法提供了更準(zhǔn)確的模擬環(huán)境。近年來，類器官研究已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一個重要研究方向。

1 類器官的發(fā)展及優(yōu)勢

傳統(tǒng)的體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)模型有細(xì)胞系模型（cell lines，CLs）和人源性腫瘤異種移植模型（patient-derived xenografts，PDXs），但2D培養(yǎng)的細(xì)胞難以重現(xiàn)體內(nèi)組織細(xì)胞的空間關(guān)系，且在2D系統(tǒng)中培養(yǎng)的分離組織細(xì)胞逐漸失去其形態(tài)并變得扁平，異常分裂，同時影響細(xì)胞分化表型［6］。再者，細(xì)胞信號傳送會因培養(yǎng)環(huán)境的不同而發(fā)生改變，這解釋了2D培養(yǎng)細(xì)胞實驗的藥物篩選結(jié)果無法在小鼠模型或臨床試驗中重現(xiàn)的原因［7］。人源性免疫小鼠模型在研究免疫療法方面具有一定的優(yōu)勢，例如能夠模擬患者體內(nèi)自體腫瘤抗原T細(xì)胞的情況，同時也存在一些弊端，如實驗成本高，且無法完全模擬人類免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性。此外，PDXs中來自同一患者的腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞的信息可能無法完全反映腫瘤的實際情況，而不同患者之間的生物學(xué)差異可能會影響治療效果，因此，在使用該模型進(jìn)行研究時需要謹(jǐn)慎考慮其局限性［8-9］。

相比上述傳統(tǒng)腫瘤模型的培養(yǎng)需要大量時間和樣本，患者源性腫瘤類器官（patient-derived tumor organoids，PDOs）可以從切除腫瘤和活檢獲得的小量樣本中快速培育而成，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的臨床前腫瘤建模中有成功率高和時間成本低的優(yōu)點，且患者源性腫瘤類器官可以模擬個體患者原生腫瘤的細(xì)胞和分子特征，故類器官是目前最適合作為精確癌癥治療的腫瘤模型［10］。

2 乳腺癌類器官的設(shè)計

找到合適的乳腺/乳腺癌類器官模型可助研究團隊更好地理解乳腺癌的發(fā)展和治療，利用模型可以研究乳腺癌細(xì)胞的生長、擴散方式及其遺傳特征，同時評估不同藥物對乳腺癌細(xì)胞的療效。Sachs等［11］在通用類器官模型培養(yǎng)的方案基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)液中添加與乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuregulin 1，NRG1），并通過添加一種名為Y-27632的Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）抑制劑來調(diào)控培養(yǎng)液中ROCK的含量，以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中表皮細(xì)胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、類器官構(gòu)建最常用的培養(yǎng)因子之一Wnt-3A（Wnt family member 3A）和p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）抑制劑SB202190的濃度，成功建立了具有g(shù)t;100個原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌類器官系的活體生物庫。通過分析建立的類器官模型的組織學(xué)及基因組特征，該研究證實實驗中培育出的乳腺癌類器官能很好地保留了組織學(xué)和遺傳異質(zhì)性，有利于進(jìn)行體外藥物篩選，為乳腺癌的治療提供更準(zhǔn)確和個體化的方法，同時為開發(fā)新的治療策略和藥物提供基礎(chǔ)。Prince等［12］設(shè)計出了一種名為EKGel的納米纖維水凝膠來替代基底膜提取物（basement-membrane extract，BME），用于乳腺癌類器官的起始、生長和維持，從而避免了患者來源的腫瘤類器官嚴(yán)重依賴小鼠腫瘤BME的弊端。在EKGel中培養(yǎng)的PDOs表現(xiàn)出與原始腫瘤和乳腺癌類器官在標(biāo)準(zhǔn)BME中的相似的增殖、形態(tài)學(xué)特征、基因表達(dá)和藥物反應(yīng)；此外，EKGel在機械性能和穩(wěn)定性方面表現(xiàn)優(yōu)異，可適用于微流控類器官芯片。Hogstrom等［13］為探究基質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)分泌治療耐藥中的作用，重新優(yōu)化了類器官模型的培養(yǎng)條件，該優(yōu)化方案可長期培養(yǎng)對激素治療有反應(yīng)的激素受體陽性的PDOs。而不同于上述研究團隊針對類器官的培養(yǎng)液進(jìn)行優(yōu)化，Dekkers等［14］利用患者來源的乳腺組織培養(yǎng)類器官，通過成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9，RISPR/Cas9）系統(tǒng)敲除了腫瘤蛋白P53、磷酸酶及張力蛋白同源物基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten，PTEN）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma gene，RB1）和神經(jīng)纖維瘤病1型基因（neurofibromatosis Type 1，NF1）這4個乳腺癌相關(guān)的抑癌基因，成功培養(yǎng)出可多次傳代且對內(nèi)分泌治療或化療敏感的乳腺癌類器官。

3 乳腺癌類器官的應(yīng)用

3.1 乳腺癌發(fā)病影響因素及機制研究 雖然傳統(tǒng)的細(xì)胞系模型具有容易處理、培養(yǎng)和維護的特點，且有豐富的歷史數(shù)據(jù)為研究提供參考，但PDXs和類器官因其具備維持遺傳和表型異質(zhì)性、3D結(jié)構(gòu)以及PDXs的腫瘤-基質(zhì)相互作用的特性，在研究疾病發(fā)展因素中更顯優(yōu)勢，它能更準(zhǔn)確地再現(xiàn)體內(nèi)生長條件，這對于理解癌癥發(fā)展的復(fù)雜性至關(guān)重要。Chew等［15］通過整合基因測序、RNA分析和人類乳腺癌類器官模型試驗，確定了異常成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）信號作為特定乳腺癌亞型的潛在治療靶點，且FGFR2-SKI融合基因?qū)GFR1-3抑制劑AZD4547具有顯著的敏感性，提示其很可能是一個新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。這些研究為開發(fā)個性化的乳腺癌治療提供了有價值的見解，同時為未來的臨床試驗提供了理論基礎(chǔ)。Vandervorst等［16］利用類器官模型探究平面細(xì)胞極性（Wnt/planar cell polarity，WNT/PCP）通路中作為關(guān)鍵分子的VANGL平面細(xì)胞極性蛋白2（VANGL planar cell polarity protein 2，VANGL2）對乳腺癌細(xì)胞運動、細(xì)胞侵襲和乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，驗證了VANGL2在不同分子亞型的乳腺癌細(xì)胞中對細(xì)胞遷移發(fā)揮著重要作用，其中的類器官侵襲試驗在評估腫瘤細(xì)胞的侵襲能力和轉(zhuǎn)移潛力中相當(dāng)關(guān)鍵，這種實驗方法可以模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，通過觀察和計量腫瘤細(xì)胞在3D環(huán)境中的侵襲能力，能更好地理解腫瘤的侵襲過程，并為開發(fā)抗侵襲和轉(zhuǎn)移治療策略提供了重要線索，該研究還提示VANGL似乎是通過調(diào)節(jié)Ras同源蛋白A（ras homolog family member A，RhoA）來介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生遷移活動的，為乳腺癌的治療提供了新的思路。

3.2 藥物篩選和個體化治療 來自乳腺癌患者腫瘤組織的類器官模型因保留了原始腫瘤的組織學(xué)和遺傳特征，非常適合藥物測試，這個培育過程包括從患者的腫瘤組織中提取癌細(xì)胞，同時在模擬腫瘤環(huán)境的3D基質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)［17］。Guillen等［18］探討了患者來源的異種移植物、器官模型在藥物篩選和精準(zhǔn)腫瘤學(xué)中的應(yīng)用，不同于Sachs等［11］主要收集原發(fā)的、未經(jīng)治療的乳腺癌建立類器官模型，Guillen團隊重點關(guān)注內(nèi)分泌抵抗、難治性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌，他們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定的基于PDXs的藥物篩選是可行且更具效益的，并且可以在匹配的PDXs模型中驗證結(jié)果。Jiang等［19］使用患者來源的組織器官模型研究長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物4的反義RNA1（DNA damage inducible transcript 4，DDIT4-AS1）在TNBC化療敏感性中的作用，發(fā)現(xiàn)lncRNA DDIT4-AS1介導(dǎo)的自噬活化促進(jìn)了TNBC的發(fā)展和化療耐藥性，提示針對DDIT4-AS1的治療策略具有增強化療對TNBC療效的潛力，這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)針對TNBC的新型治療方法提供了新的思路和方向。Soosainathan等［20］在研究中使用了多種內(nèi)分泌治療耐藥的乳腺癌細(xì)胞系模型，這些模型顯示，轉(zhuǎn)錄相關(guān)的周期依賴性激酶9（Cyclin-dependent kinase 9，CDK9）在對內(nèi)分泌治療和CDK4/6抑制劑帕博西尼的耐藥性中起著重要作用；當(dāng)CDK9抑制劑AZD4573與帕博西尼和氟維司群聯(lián)合治療可使PDXs中的腫瘤消退，這種聯(lián)合治療策略展示了克服內(nèi)分泌治療和CDK4/6抑制劑在雌激素受體陽性乳腺癌中的耐藥性的潛力，為針對耐藥性疾病的藥物療效機制研究提供了新的方向。

Saeki等［21］通過實驗證實了乳腺癌PDOs中存在轉(zhuǎn)錄組腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，通過繪制這些器官模型的轉(zhuǎn)錄組圖譜，可以更深入地了解不同個體的腫瘤生物學(xué)特征。由于這些類器官模型與患者的腫瘤非常相似，它們可以為特定患者提供個性化的方案，以確定哪些藥物最有可能有效［22］。隨著PDOs越來越多地用于藥物敏感性測定，癌癥治療的準(zhǔn)確性也在逐步提高，它們除了被用于藥物篩選、探索治療候選藥物的細(xì)胞毒性和實現(xiàn)個性化治療外，還被用于預(yù)測患者對免疫療法，如程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PD-L1）抑制劑的反應(yīng)，同時，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中評估免疫抑制功能，突顯了PDOs在指導(dǎo)臨床治療和改善癌癥治療預(yù)后方面的潛力［23］。Shu等［24］將類器官藥物敏感性數(shù)據(jù)與患者的臨床結(jié)果相匹配，同時概述了TNBC患者的臨床反應(yīng)與組織源性類器官對新輔助化療（多西紫杉醇、表柔比星）反應(yīng)的一致性。Dong等［25］從美國國家癌癥研究所多樣性集Ⅳ化合物庫中篩選出了一種小分子NSC260594，通過小鼠模型和類器官模型驗證，該研究團隊發(fā)現(xiàn)其在多種TNBC細(xì)胞中均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性，通過下調(diào)Wnt信號通路蛋白髓細(xì)胞白血病因子1（Myeloid cell leukemia 1，Mcl-1）的表達(dá)來抑制腫瘤生長，為TNBC的治療提供了新的途徑。因腫瘤異質(zhì)性可能會顯著影響治療效果，故能提供患者特異性模型的個體化治療方案在癌癥研究中尤為重要，如利用患者來源的組織樣本培養(yǎng)類器官研究疾病和測試治療方法。相比細(xì)胞系模型，類器官可以保持較長時間培養(yǎng)，使研究人員能夠研究較為長期的過程，包括疾病進(jìn)展和慢性治療的影響。類器官系統(tǒng)的開發(fā)使得在體外研究不同器官之間的復(fù)雜相互作用成為可能，為系統(tǒng)效應(yīng)提供了更全面的理解。并不是所有的乳腺癌都可作為PDXs移植，故利用類器官模型進(jìn)行精準(zhǔn)醫(yī)療并不是在任何情況下都可行，而那些已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，更需要更精準(zhǔn)的個體化治療。Yang等［26］證實了間皮素（mesoothelin，MSLN）介導(dǎo)自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞在體外、體內(nèi)和離體中對TNBC細(xì)胞具有高效殺傷作用，MSLN-NK可能是TNBC患者的一種很有前途的治療選擇。Song等［27］在探究編碼蛋白質(zhì)的circRNA在TNBC的病因和致癌原理中的作用時，發(fā)現(xiàn)circCAPG的敲除能顯著抑制TNBC類器官的生長。Narayan等［28］研究發(fā)現(xiàn)，在177例接受腫瘤組織檢測的患者中有56%在血漿樣本中發(fā)現(xiàn)了磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（Phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PI3KCA）突變，該研究團隊利用ER陽性乳腺癌類器官和具有PIK3CA突變的鼠源性異位乳腺腫瘤模型，證明磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）抑制劑Alpelisib與fulvestrant聯(lián)合使用在絕經(jīng)后女性和HR陽性、HER2陰性、PIK3CA突變型或進(jìn)展性/轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中均具有療效。Campaner等［17］報道了機械信號和Yes相關(guān)蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP）激活抑制劑可以恢復(fù)耐藥腫瘤類器官的化學(xué)敏感性。Yang等［29］系統(tǒng)分析了TNBC中RNA剪接的變化，利用患者來源的類器官驗證了具有膠原結(jié)構(gòu)的腫瘤特異性剪接變體——巨噬細(xì)胞受體與膠原結(jié)構(gòu)（macrophage receptor with collagenous structure，MARCO-TST）與不良預(yù)后相關(guān)，從而影響腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的理論。

3.3 與高通量篩選結(jié)合 高通量篩選是一種用于藥物篩選的方法，可以快速評估大量化學(xué)物質(zhì)或生物物質(zhì)作為候選藥物的潛力，這個過程涉及自動化、微型化試驗和大規(guī)模數(shù)據(jù)的分析，在識別諸如可調(diào)節(jié)特定生物分子途徑的活性化合物、抗體或基因方面起到至關(guān)重要的作用。Tsai等［30］對來自接受化療治療的乳腺癌患者培養(yǎng)的類器官進(jìn)行功能蛋白質(zhì)組學(xué)篩選，識別了關(guān)鍵分子靶點，確定核受體輔因子2（nuclear receptor co-repressor 2，NCOR2）組蛋白脫乙酰酶是細(xì)胞毒性應(yīng)激反應(yīng)和抗腫瘤免疫的抑制劑。利用類器官對真實組織結(jié)構(gòu)和功能的高度模擬，將高通量篩選與類器官技術(shù)相結(jié)合體現(xiàn)了藥物篩選和個性化治療的重要進(jìn)展?；蚪M測試已成為個性化癌癥治療的主流，但由于像乳腺癌這樣的癌癥的分子異質(zhì)性，其效果往往有限。Guillen等［18］研究表明，使用PDOs進(jìn)行功能測試可能比單獨使用基因組學(xué)具有明顯優(yōu)勢，高通量篩選和類器官的結(jié)合加速了藥物研發(fā)過程，與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，其有可能縮短將新藥推向市場的時間。

4 小結(jié)與展望

幾十年來，臨床前的乳腺癌研究一直依賴細(xì)胞系模型和人源性腫瘤異種移植模型，雖然乳腺癌細(xì)胞系可以進(jìn)行高通量篩查，但并不能完全捕獲乳腺癌譜，并且缺少與個別患者的臨床相關(guān)性，而PDXs又存在不能很好地模擬人類免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性的問題。相比之下，類器官模型的建立能很好地模擬腫瘤的異質(zhì)性，包括腫瘤微環(huán)境、免疫反應(yīng)等，這有助于更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的響應(yīng)和治療效果，且可以在藥物進(jìn)入體內(nèi)前進(jìn)行藥物篩選，從而減少臨床試驗的時間和成本?？杀M管如此，類器官的局限之處仍然存在，對比常規(guī)細(xì)胞2D培養(yǎng)，乳腺癌類器官模型建立復(fù)雜度高，需要大量的細(xì)胞和材料，建立過程相對耗時。類器官無法完全模擬所有生理過程，如腫瘤的生長、擴散等。類器官模型是基于已有的腫瘤數(shù)據(jù)建立的，因此可能存在一定的偏差，這不單是乳腺癌類器官模型的培養(yǎng)問題，更是各種腫瘤類器官培養(yǎng)都存在的局限性?？偟膩碚f，類器官的研究是一個不斷探索和進(jìn)步的過程，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和研究的深入，期待類器官研究在未來能夠為人類健康保障帶來更多的突破和貢獻(xiàn)。

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（2023-11-14收稿 2023-12-07修回）

（本文編輯 胡小寧）