• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    錨蛋白重復序列22(ANKRD22)對人肝癌細胞的影響及其機制

    2024-06-06 10:09:28蔡浚哲劉松柏費曉斌劉鵬朱昌毫王興潘耀振
    臨床肝膽病雜志 2024年5期
    關鍵詞:細胞增殖肝細胞

    蔡浚哲 劉松柏 費曉斌 劉鵬 朱昌毫 王興 潘耀振

    摘要: 目的 探討錨蛋白重復序列22(ANKRD22)對人肝癌細胞增殖、 侵襲和遷移的影響及其分子機制。方法 通過TCGA數(shù)據(jù)庫分析正常肝組織及肝細胞癌組織中ANKRD22的表達水平及其與預后的關系。通過qRT-PCR和Western Blot檢測人正常肝細胞 (L-02) 和人肝癌細胞系 (Huh7、 Hep G2、 MHCC-97H、 SK-HEP-1、 SMMC-7721) 中ANKRD22的表達情況。通過CCK-8、 EdU、 劃痕實驗及Transwell檢測ANKRD22對肝癌細胞增殖、 侵襲和遷移能力的影響。通過Western Blot檢測ANKRD22與細胞周期蛋白、 EMT相關蛋白之間的關系。通過KEGG、 ssGSEA分析進一步探究ANKRD22在肝癌細胞中的作用機制, 并進行實驗驗證。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析, 進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果 TCGA數(shù)據(jù)庫中ANKRD22在肝細胞癌組織中較正常肝組織高表達 (t=5. 083, P<0. 05), 且ANKRD22高表達患者的總生存期及疾病相關生存期均顯著低于ANKRD22低表達的患者 (P值均<0. 05)。肝癌細胞系中ANKRD22的表達量均高于正常肝細胞 (P值均<0. 05)。增殖實驗結果提示, ANKRD22過表達組的EdU陽性率、 增殖速度均高于空載對照 (Vector) 組 (t值分別為19. 60、 6. 72, P值均<0. 001); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的EdU陽性率、 增殖速度較si-NC組均降低 (P值均<0. 001)。Cyclin E1、 Cyclin D1、 CDK7、 CDK4在過表達組中表達高于Vector組 (t值分別為3. 54、 4. 95、6. 34、 5. 19, P值均<0. 01); 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均低于si-NC組 (P值均<0. 001)。P27在過表達組中表達低于 Vector 組(t=6. 12, P<0. 001), 在 si-ANKRD22#2 組及 si-ANKRD22#3 組中表達均高于 si-NC 組(P 值均<0. 001)。侵襲、 遷移實驗結果提示, ANKRD22過表達組的遷移速度、 穿膜數(shù)量 (遷移組和侵襲組) 均高于Vector組 (t值分別為5. 01、 25. 60、 3. 67, P值均<0. 05); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的遷移速度、 穿膜數(shù)量 (遷移組和侵襲組) 較si-NC組均降低 (P值均<0. 01)。N-cadherin、 Vimentin、 Snail在過表達組中表達高于Vector組 (t值分別為12. 13、 8. 85、 13. 97,P值均<0. 001), 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均低于si-NC組 (P值均<0. 001); E-cadherin在過表達組中表達低于Vector組 (t=4. 98, P<0. 01), 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均高于si-NC組 (P值均<0. 001)。KEGG富集分析及ssGSEA分析提示, ANKRD22在肝細胞癌中與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關, 在過表達組中, p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、 p-mTOR/mTOR 均較 Vector 組升高(t 值分別為 12. 21、 3. 43、 9. 75, P 值均<0. 01); 在 si-ANKRD22#2 組及si-ANKRD22#3組中表達均低于si-NC組 (P值均<0. 001)。結論 ANKRD22在肝癌細胞中高表達, 能促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力, 并且能促進PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活。

    關鍵詞: ?癌, ?肝細胞; ?錨蛋白重復; ?細胞增殖; ?細胞運動

    基金項目: ?國家自然科學基金 (81960431, ?81960535); ?貴州省科技計劃項目 (黔科合支撐 〔2021〕 一般444)

    Effect of ankyrin-repeat domain-containing protein 22 on human hepatoma cells and its mechanism

    CAI Junzhe1, LIU Songbai2, FEI Xiaobin1, LIU Peng3, ZHU Changhao4, WANG Xing1, 4, PAN Yaozhen1, 4.(1. College of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China;2. Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Baiyun Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China; 3. Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China; 4. Department of Hepatobiliary Surgery, The Affiliated Cancer Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550000, China)

    Corresponding author: ?PAN Yaozhen, ?panyaozhen@gmc.edu.cn ?(ORCID: ?0000-0002-9300-382X)

    Abstract:

    ObjectiveTo investigate the effect of ankyrin-repeat domain-containing protein 22 (ANKRD22) on the proliferation, invasion, and migration of human hepatoma cells and its molecular mechanism. Methods The TCGA database was used to analyze the expression level of ANKRD22 in normal liver tissue and hepatocellular carcinoma tissue and its association with prognosis. Western Blot and qRT-PCR were used to measure the expression of ANKRD22 in human normal liver cells (L-02) and human hepatoma cells (Huh7, HepG2, MHCC-97H, SK-HEP-1, and SMMC-7721); CCK-8 assay, EdU, wound healing assay, and Transwell assay were used to observe the effect of ANKRD22 on the proliferation, invasion, and migration of hepatoma cells; Western Blot was used to investigate the association of ANKRD22 with cyclins and EMT-related proteins; KEGG and ssGSEA analyses were performed to investigate the mechanism of action of ANKRD22 in hepatoma cells, and related experiments were conducted for validation. The independent-samples t-test was used for comparison of continuous data between two groups; a one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups, and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results In the TCGA database, the expression level of ANKRD22 in hepatoma tissue was significantly higher than that in normal liver tissue (t=5.083, P<0.05), and the patients with a high expression level of ANKRD22 had longer overall survival and disease-related survival than those with a low expression level of ANKRD22 (P<0.05) . The expression level of ANKRD22 in various human hepatoma cell lines was higher than that in human normal liver cells (all P<0.05) . Cell proliferation assay showed that the ANKRD22 overexpression group had significantly higher EdU positive rate and proliferation rate than the Vector group (t=19.60 and 6.72, both P<0.001), and compared with the si-NC group, the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had significantly lower EdU positive rate and proliferation rate (all P<0.001) . Compared with the Vector group, the overexpression group had significantly higher expression levels of Cyclin E1, Cyclin D1, CDK7, and CDK4 (t=3.54, 4.95, 6.34, and 5.19, all P<0.01), and the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had significantly lower expression levels than the si-NC group (all P<0.001) . The overexpression group had a significantly lower expression level of P27 than the Vector group (t=6.12, P<0.001), and the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had a significantly higher expression level than the si-NC group (both P<0.001) . Invasion and migration experiments showed that compared with the Vector group, the ANKRD22 overexpression group had significantly higher migration rate and number of crossings through the membrane (migration group and invasion group) (t=5.01,25.60, and 3.67, all P<0.05), and compared with the si-NC group, thesi-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had significantly lower migration rate and number of crossings through the membrane (migration group and invasion group)(all P<0.01) . The overexpression group had significantly higher expression levels of N-cadherin, Vimentin, and Snail than the Vector group (t=12.13, 8.85, and 13.97, all P<0.001), and the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had significantly lower expression levels than the si-NC group (all P<0.001); the overexpression group had a significantly lower expression level of E-cadherin than the Vector group (t=4.98, P<0.01), and the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had a significantly higher expression level than the si-NC group (both P<0.001) . The KEGG enrichment analysis and the ssGSEA analysis showed that ANKRD22 was associated with the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in hepatocellular carcinoma, and the overexpression group had significantly higher expression levels of p-AKT/AKT, p-PI3K/PI3K, and p-mTOR/mTOR than the Vector group (t=12.21, 3.43, and 9.75, all P<0.01), and the si-ANKRD22#2 group and the si-ANKRD22#3 group had significantly lower expression levels than the si-NC group (all P<0.001) . Conclusion ANKRD22 is highly expressed in hepatoma cells and can promote the proliferation, invasion, and migration of hepatoma cells and the activation of the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway.

    Key words: ?Carcinoma, ?Hepatocellular; ?Ankyrin Repeat; ?Cell Proliferation; ?Cell Movement

    Research funding: ? National Natural Science Foundation of China (81960431, ? 81960535); ?Science and Technology Fund of?Guizhou Province ?(QKHZC [2021] YB444)

    肝細胞癌 (HCC) 是世界上第六常見的惡性腫瘤, 并且是全球癌癥死亡第四大相關因素[1] , 并逐漸呈現(xiàn)上升趨勢[2] 。HCC在早期可無癥狀, 確診時常已發(fā)展至中晚期[3] , 而晚期HCC患者可選擇的治療方案十分有限[4] 。尤其在我國, 相關藥物仍未能滿足臨床上的諸多需求[5] 。因此, 繼續(xù)尋找HCC相關的生物標志物具有重要價值。

    錨蛋白重復序列22 (ankyrin-repeat domain-containing protein 22, ANKRD22)屬于錨蛋白(ANK)重復序列家族[6] , 是一種人N-肉豆蔻?;鞍祝?] , 含有4個重復的錨蛋白基序, 共有191個氨基酸, 并且在氨基酸87和109之間具有假定的單通道跨膜區(qū)域[8] 。ANKRD22在多種惡性腫瘤中高表達, 但其在HCC中的作用尚不明確。本研究通過對ANKRD22進行過表達或者敲低, 來分析其對人HCC細胞增殖、 侵襲和遷移的影響及其分子機制。

    1 材料與方法

    1. 1 實驗材料 人正常肝細胞株L-02及肝癌細胞株Huh7、 Hep G2、 MHCC-97H、 SK-HEP-1和SMMC-7721均購于中國科學院上海分院細胞庫; DMEM培養(yǎng)基、 0. 25%胰蛋白酶、 10%胎牛血清等均購于美國Gibco公司; 過表達慢病毒購于中國上海吉凱基因公司; siRNA購于中國廣州銳博生物科技有限公司; Lipo3000 購于美國invitrogen公司; ANKRD22及相關抗體均購于中國武漢三鷹公司。

    1. 2 生物信息學分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫 (https: //portal.gdc. cancer. gov/) 中下載ANKRD22在正常肝組織及肝細胞癌組織中的相關數(shù)據(jù), 運用R4. 2. 1軟件, 以 “l(fā)imma” 和“edgR” R包進行差異表達分析, 以 “survival” 和 “survminer” R包進行預后分析。然后將TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出的在HCC中與ANKRD22相關的基因進行KEGG富集分析尋找較多富集的通路, 并通過ssGSEA進行進一步分析。

    1. 3 細胞培養(yǎng) 所有細胞株均使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基來進行培養(yǎng), 細胞培養(yǎng)的環(huán)境為恒溫37 ℃、含5% CO2的無菌培養(yǎng)箱, 待細胞培養(yǎng)至對數(shù)期生長時提取以進行后續(xù)進一步實驗。

    1. 4 細胞siRNA轉染 將對數(shù)期生長的細胞Huh7取2×105個接種于六孔板, 在細胞密度增至30%~40%時以Lipo3000為介質開始siRNA轉染。先以無血清培養(yǎng)基將Lipo3000及siRNA分別孵育5 min, 然后進行混合孵育15 min, 孵育結束后緩慢滴入六孔板中并搖勻, 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后更換培養(yǎng)基, 24~48 h后可提取RNA并通過qRT-PCR驗證siRNA轉染效率, 48~72 h后可提取蛋白并通過Western Blot驗證siRNA轉染效率。

    1. 5 細胞慢病毒感染 將對數(shù)期生長的細胞MHCC-97H取1×105個接種于培養(yǎng)瓶內, 約24 h后開始病毒感染, 依照病毒的MOI值將病毒吸入培養(yǎng)瓶內并搖勻, 放入培養(yǎng)箱24 h后更換培養(yǎng)基, 約48 h后可提取RNA并通過qRT-PCR驗證病毒轉染效率, 約72 h后可提取蛋白并通過Western Blot驗證病毒轉染效率。

    1. 6 qRT-PCR實驗 收集待處理的細胞, 使用Trizol試劑以提取細胞的總RNA, 使用PrimeScriptTM RT Reagent試劑盒進行逆轉錄以得到cDNA, 使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行qRT-PCR分析, 每組分別設置5個復孔,反應條件為95 ℃、 30 s, 95 ℃、 5 s, 60 ℃、 30 s, 擴增40個循環(huán), 得到的結果使用Bio-Rad CFX Manager進行分析, 以GAPDH基因作為內參, 使用公式2?ΔΔCt計算得到目的基因相對于GAPDH的表達量。

    1. 7 Western Blot實驗 收集待處理的細胞, 加入裂解液以提取細胞的總蛋白, 使用SDS-PAGE凝膠進行電泳以分離蛋白, 在300 mA下轉膜至PVDF膜上, 用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h, 放入一抗4 ℃孵育過夜, 第二天放入二抗中室溫孵育2 h, 滴加顯影液后在化學發(fā)光儀中顯影。

    1. 8 劃痕實驗 將對數(shù)期生長的細胞取5×105個接種于六孔板內, 待細胞覆蓋大于90%孔徑時, 以200 ?L規(guī)格槍頭垂直劃線, 并用PBS清洗后置于顯微鏡下拍照,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后再次拍照。

    1. 9 CCK-8實驗 將對數(shù)期生長的細胞取3×103個接種于96孔板內, 待細胞貼壁后加入CCK-8試劑, 計為0 h,并用酶標儀檢測于450 nm處各孔吸光度值, 后分別于培養(yǎng)24 h、 48 h、 72 h、 96 h后重復檢測。

    1. 10 EdU增殖實驗 將對數(shù)期生長的細胞取3×104個細胞接種于24孔板內, 待細胞貼壁后加入EdU工作液于培養(yǎng)箱內孵育2 h, 然后棄去培養(yǎng)基、 固定細胞, 用TritonX-100透膜后加入熒光染料進行染色, 待染色結束后用熒光顯微鏡進行觀察計數(shù)并計算陽性率。

    1. 11 Transwell試驗 將對數(shù)期生長的細胞懸浮于無血清培養(yǎng)基中, 將含3×104個細胞的細胞懸液滴加于含或不含基質膠的上室內, 并將含20%胎牛血清的培養(yǎng)基滴加于下室內, 置于培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24~48 h后吸去培養(yǎng)基, 用PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定, 固定完成后用PBS清洗, 再加入0. 3%結晶紫固定, 染色結束后用PBS清洗, 待烘干后置于顯微鏡下觀察細胞數(shù)量。

    1. 12 統(tǒng)計學分析 使用SPSS 25. 0統(tǒng)計軟件進行分析, 計量資料兩組間比較采用成組t檢驗, 多組間比較采用單因素方差分析, 進一步兩兩比較使用LSD-t檢驗, P<0. 05為差異具有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2. 1 ANKRD22在HCC中的表達 通過對TCGA數(shù)據(jù)庫進行分析, 結果提示ANKRD22在HCC組織中較正常肝組織高表達 (t=5. 083, P<0. 001)(圖1a), 且ANKRD22高表達患者的總生存期及疾病相關生存期均顯著低于低表達的患者 (P值均<0. 05)(圖1b、 c)。進一步以qRT-PCR及Western Blot對肝癌細胞系中ANKRD22表達情況進行檢測, 結果提示肝癌細胞系中ANKRD22的表達量均高于正常肝細胞 (P值均<0. 05)(圖1d、 e); 其中Huh7的表達量最高, MHCC-97H的表達量次之, 故以此2種細胞進行后續(xù)實驗。

    2. 2 ANKRD22轉染后的表達情況 使用過表達慢病毒轉染 MHCC-97H, 使用 siRNA 轉染 Huh7, 并以 qRT-PCR 及 Western Blot 進行驗證。結果提示, 過表達組MHCC-97H的ANKRD22 mRNA (t=85. 21, P<0. 001) 及蛋白(t=35. 27, P<0. 001) 表達量均明顯高于空載對照組 (Vector組)(圖2a、 b); 3個敲低組Huh7的mRNA及蛋白表達量均較陰性對照組 (si-NC組) 降低 (P值均<0. 01), 其中si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的敲低效果較為顯著(圖2c、 d), 故繼續(xù)以si-ANKRD22#2及si-ANKRD22#3完成后續(xù)實驗。以上結果提示過表達組和敲低組均構建成功。

    2. 3 ANKRD22對肝癌細胞增殖能力的影響 EdU增殖實驗結果提示, 過表達組的陽性率高于 Vector 組(t=19. 60, P<0. 001); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的陽性率較si-NC組均降低 (P值均<0. 001)(圖3a、 b)。CCK-8實驗結果提示, 過表達組的增殖速度高于Vector組 (t=6. 72, P<0. 01); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的增殖速度均較si-NC組降低 (P值均<0. 05)(圖3c)。Western Blot結果提示, Cyclin E1、 Cyclin D1、 CDK7、 CDK4在過表達組中表達高于Vector組 (t值分別為3. 54、 4. 95、 6. 34、5. 19, P值均<0. 01); 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均低于si-NC組 (P值均<0. 001)。P27在過表達組中表達低于Vector組 (t=6. 12, P<0. 001), 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均高于si-NC組 (P值均<0. 001)(圖3d)。

    2. 4 ANKRD22對肝癌細胞侵襲、 遷移能力的影響 劃痕實驗結果提示, 過表達組MHCC-97H的遷移速度高于Vector組 (t=5. 01, P<0. 01); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的遷移速度均較si-NC組降低 (P值均<0. 01)(圖4a、b) 。Transwell實驗結果提示, 過表達組的穿膜數(shù)量高于Vector組 (遷移組: t=25. 60, P<0. 001; 侵襲組: t=3. 67, P<0. 05); si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組的穿膜數(shù)量均較si-NC組降低 (P值均<0. 01)(圖4c~e)。進一步通過Western Blot分別對Vector組、 過表達組、 si-NC組、 si-ANKRD22#2組、 si-ANKRD22#3組與EMT相關蛋白之間的關系進行驗證, 結果提示N-cadherin、 Vimentin、 Snail在過表達組中表達高于Vector組 (t值分別為12. 13、 8. 85、13. 97, P值均<0. 001), 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均低于si-NC組 (P值均<0. 001); E-cadherin在過表達組中表達低于Vector組 (t=4. 98, P<0. 01), 在si-ANKRD22#2組及si-ANKRD22#3組中表達均高于si-NC組 (P值均<0. 001)(圖4f)。

    2. 5 ANKRD22在肝癌細胞中的作用機制 KEGG富集分析結果提示, ANKRD22在HCC組織中富集于PI3K/AKT/mTOR、 JAK/STAT、 NF-κB等多條信號通路, 其中在PI3K/AKT/mTOR信號通路上的富集最為顯著 (圖5a)。ssGSEA富集分析結果提示, ANKRD22在HCC組織中正向顯著富集于PI3K/AKT/mTOR信號通路 (圖5b)。通過Western Blot對ANKRD22在肝癌細胞中對AKT、 PI3K、mTOR的磷酸化水平進行驗證, 結果提示在過表達組中,p-AKT/AKT、 p-PI3K/PI3K、 p-mTOR/mTOR均較Vector組升高 (t值分別為12. 21、 3. 43、 9. 75, P值均<0. 01); 在si-ANKRD22#2 組及 si-ANKRD22#3 組中, p-AKT/AKT、 p-PI3K/PI3K、 p-mTOR/mTOR 均較 si-NC組降低(P值均<0. 001)(圖5c)。

    3 討論

    2021年統(tǒng)計數(shù)據(jù)[9] 顯示, 我國肝癌患者數(shù)量占全球近50%, 肝癌作為在我國惡性腫瘤中發(fā)病率第4位、 致死率第2位的疾?。?0] , 仍需繼續(xù)高度關注。

    ANK是自然界中最常見的蛋白質基序之一, 廣泛參與多種細胞過程[11]。ANKRD22作為ANK家族中的一員, 可能與人體內的多種生物學功能有關。當前相關研究表明ANKRD22與多種惡性腫瘤相關, 其中Liu等[12] 發(fā)現(xiàn)ANKRD22可以通過上調E2F1介導的MELK表達促進膠質瘤增殖、 遷移、 侵襲和上皮-間充質轉化; Wu等[13] 發(fā)現(xiàn)ANKRD22可以通過調節(jié)NuSAP1表達激活Wnt/β-連環(huán)蛋白通路來促進乳腺癌; Yin等[14] 發(fā)現(xiàn)ANKRD22可以通過上調E2F1的轉錄來促進非小細胞肺癌的進展; Wu等[15] 發(fā)現(xiàn)ANKRD22可以通過調節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路從而影響甲狀腺癌細胞的生長和遷移。因此筆者假設ANKRD22在肝癌細胞中也能起到促癌作用, 并且通過相關驗證發(fā)現(xiàn)ANKRD22的確對肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移起促進作用。但是, Pan等[16] 發(fā)現(xiàn)ANKRD22通過與E-syt1合作從而促進結直腸癌的代謝重編程;Chen等[17]發(fā)現(xiàn)ANKRD22可以通過逆轉PMN-MDSC的免疫抑制作用從而成為卵巢癌治療的新靶點; Qiu等[18]發(fā)現(xiàn)ANKRD22可能在前列腺癌的進程中起負向作用。說明ANKRD22在人體中有著復雜的生物學功能, 在肝癌細胞中也有可能有著更多的生物學功能, 本研究發(fā)現(xiàn)ANKRD22與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關, 但具體作用方式尚不明確。

    本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)ANKRD22在人HCC組織中高表達且與患者的生存時間呈負相關。隨后通過細胞實驗發(fā)現(xiàn), 在肝癌細胞中, ANKRD22較正常肝細胞中高表達且ANKRD22的表達水平與肝癌細胞的增殖、 侵襲和遷移能力呈正相關。為進一步探究ANKRD22在肝癌細胞中的作用機制, 通過富集分析發(fā)現(xiàn)其與PI3K/AKT/mTOR信號通路相關, 并通過實驗證明ANKRD22的表達量與AKT、 PI3K、 mTOR的磷酸化水平呈正相關, 筆者推測ANKRD22通過影響PI3K/AKT/mTOR信號通路從而促進肝癌的進展。此外, PI3K/AKT/mTOR信號通路在肝癌中與代謝重編程[19] 、 上皮-間充質轉化[20] 、 脂質合成[21]等多種生物學功能相關, ANKRD22具體如何作用于PI3K/AKT/mTOR信號通路影響肝癌細胞的增殖、 侵襲和遷移,ANKRD22是否通過其他機制調控肝癌細胞生長等方面尚不明確, 仍需繼續(xù)進行后續(xù)研究進一步探索。

    利益沖突聲明: 本文不存在任何利益沖突。

    作者貢獻聲明: 蔡浚哲、 劉松柏、 費曉斌負責實驗操作;劉鵬、 朱昌毫負責資料收集與數(shù)據(jù)分析; 王興負責課題設計; 潘耀振指導撰寫論文并最后定稿。

    參考文獻:

    [1] LLOVET JM, KELLEY RK, VILLANUEVA A, et al. Hepatocellular carci?noma[J]. Nat Rev Dis Primers, 2021, 7(1): 6. DOI: 10.1038/s41572-020-00240-3.

    [2] FOGLIA B, TURATO C, CANNITO S. Hepatocellular carcinoma: Lat?est research in pathogenesis, detection and treatment[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(15): 12224. DOI: 10.3390/ijms241512224.

    [3] DING CM, HOU JF, TAO GW, et al. Early diagnosis and screening of hepatocellular carcinoma[J/OL]. Chin J Hepatic Surg Electron Ed, 2023, 12(1): 22-28. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2023.01.005.

    丁成明, 侯嘉豐, 陶光偉, 等. 肝細胞癌早期診斷和篩查[J/OL]. 中華肝臟外科手術學電子雜志, 2023, 12(1): 22-28. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2023.01.005.

    [4] KIM E, VIATOUR P. Hepatocellular carcinoma: Old friends and new tricks[J]. Exp Mol Med, 2020, 52(12): 1898-1907. DOI: 10.1038/s12276-020-00527-1.

    [5] LIU XF, ZHANG J, YAO L, et al. Advances in targeted therapy com?bined with immunotherapy for advanced hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2022, 38(5): 992-997. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.05.004.

    劉秀峰, 張玨, 姚琳, 等. 中晚期肝細胞癌靶向聯(lián)合免疫治療進展[J]. 臨床肝膽病雜志, 2022, 38(5): 992-997. DOI: 10.3969/j.issn.1001-5256.2022.05.004.

    [6] YANG SS. Evaluation of Clinical Significance of ANKRD22 in Colorec?tal Cancer[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2019. DOI: 10.27461/d.cnki.gzjdx.2019.001668.

    楊賽賽. ANKRD22在結直腸癌細胞中表達意義的研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2019.

    [7] UTSUMI T, HOSOKAWA T, SHICHITA M, et al. ANKRD22 is an N-myristoylated hairpin-like monotopic membrane protein specifically local?ized to lipid droplets[J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 19233. DOI: 10.1038/s41598-021-98486-8.

    [8] WANG R, WU YH, ZHU Y, et al. ANKRD22 is a novel therapeutic tar?get for gastric mucosal injury[J]. Biomed Pharmacother, 2022, 147: 112649. DOI: 10.1016/j.biopha.2022.112649.

    [9] ZHOU HN, LI YM. Conversion therapy for hepatocellular carcinoma[J/OL]. Chin J Hepatic Surg Electron Ed, 2022, 11(6): 542-547. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2022.06.002.

    周輝年, 李玉民. 肝癌轉化治療[J/OL]. 中華肝臟外科手術學電子雜志, 2022, 11(6): 542-547. DOI: 10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2022.06.002.

    [10] LU SL, YAO JN, YUAN GD, et al. Current status and prospect of clinical and basic research on conversion therapy for hepatocellular carcinoma[J]. Chin J Exp Surg, 2022, 39(10): 1837-1843. DOI: 10.3760/cma.j.cn421213-20220210-01043.

    陸世鎏, 姚建妮, 袁觀斗, 等. 肝癌轉化治療臨床與基礎研究現(xiàn)狀與展望[J]. 中華實驗外科雜志, 2022, 39(10): 1837-1843. DOI: 10.3760/cma.j.cn421213-20220210-01043.

    [11] PARRA RG, ESPADA R, VERSTRAETE N, et al. Structural and en?ergetic characterization of the ankyrin repeat protein family[J]. PLoS Comput Biol, 2015, 11(12): e1004659. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1004659.

    [12] LIU X, ZHAO JL, WU Q, et al. ANKRD22 promotes glioma prolifera?tion, migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition by upregulating E2F1-mediated MELK expression[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2023, 82(7): 631-640. DOI: 10.1093/jnen/nlad034.

    [13] WU YG, LIU HX, GONG YF, et al. ANKRD22 enhances breast can?cer cell malignancy by activating the Wnt/β -catenin pathway via modulating NuSAP1 expression[J]. Bosn J Basic Med Sci, 2021, 21(3): 294-304. DOI: 10.17305/bjbms.2020.4701.

    [14] YIN J, FU WF, DAI L, et al. ANKRD22 promotes progression of non-small cell lung cancer through transcriptional up-regulation of E2F1[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 4430. DOI: 10.1038/s41598-017-04818-y.

    [15] WU YG, CHEN WX, ZHANG B, et al. ANKRD22 knockdown sup?presses papillary thyroid cell carcinoma growth and migration and modulates the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Tissue Cell, 2023, 84: 102193. DOI: 10.1016/j.tice.2023.102193.

    [16] PAN TH, LIU JW, XU S, et al. ANKRD22, a novel tumor microenvironment-induced mitochondrial protein promotes metabolic reprogramming of colorectal cancer cells[J]. Theranostics, 2020, 10(2): 516-536. DOI: 10.7150/thno.37472.

    [17] CHEN HH, YANG KQ, PANG LX, et al. ANKRD22 is a potential novel target for reversing the immunosuppressive effects of PMN-MDSCs in ovarian cancer[J]. J Immunother Cancer, 2023, 11(2): e005527. DOI: 10.1136/jitc-2022-005527.

    [18] QIU YQ, YANG SS, PAN TH, et al. ANKRD22 is involved in the pro?gression of prostate cancer[J]. Oncol Lett, 2019, 18(4): 4106-4113. DOI: 10.3892/ol.2019.10738.

    [19] TIAN LY, SMIT DJ, J?CKER M. The role of PI3K/AKT/mTOR signal?ing in hepatocellular carcinoma metabolism[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(3): 2652. DOI: 10.3390/ijms24032652.

    [20] LI YH, YIN YL, HE Y, et al. SOS1 regulates HCC cell epithelial-mes?enchymal transition via the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2022, 637: 161-169. DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.11.015.

    [21] CHEN JX, CHEN JD, HUANG JX, et al. HIF-2α upregulation medi?ated by hypoxia promotes NAFLD-HCC progression by activating lipid synthesis via the PI3K-AKT-mTOR pathway[J]. Aging (Albany NY), 2019, 11(23): 10839-10860. DOI: 10.18632/aging.102488.

    收稿日期:2023-10-13; 錄用日期:2023-11-17

    本文編輯:王瑩

    猜你喜歡
    細胞增殖肝細胞
    肝臟脾植入誤診為肝細胞癌1例
    傳染病信息(2022年6期)2023-01-12 08:58:54
    外泌體miRNA在肝細胞癌中的研究進展
    鋅指蛋白與肝細胞癌的研究進展
    三氧化二砷對人大細胞肺癌NCI—H460細胞凋亡影響的研究
    miRAN—9對腫瘤調控機制的研究進展
    人類microRNA—1246慢病毒抑制載體的構建以及鑒定
    有關“細胞增殖”一輪復習的有效教學策略
    肝細胞程序性壞死的研究進展
    肝細胞癌診斷中CT灌注成像的應用探析
    RNA干擾HDACl對人乳腺癌MCF—7細胞生物活性的影響
    国产精品亚洲av一区麻豆| 国模一区二区三区四区视频| 性色avwww在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 久久久久久久久大av| 久久国产精品影院| 国产97色在线日韩免费| av视频在线观看入口| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 高潮久久久久久久久久久不卡| 在线观看免费午夜福利视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久久国产精品麻豆| 国产爱豆传媒在线观看| 9191精品国产免费久久| 国模一区二区三区四区视频| 久久人人精品亚洲av| 婷婷精品国产亚洲av| x7x7x7水蜜桃| 亚洲av熟女| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美乱色亚洲激情| 在线观看日韩欧美| 欧美黄色片欧美黄色片| 岛国在线观看网站| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本 欧美在线| 久久亚洲精品不卡| 女同久久另类99精品国产91| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲国产色片| 一个人免费在线观看电影| 黄片小视频在线播放| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久久九九精品影院| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 综合色av麻豆| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 午夜精品在线福利| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 欧美zozozo另类| 欧美在线一区亚洲| 超碰av人人做人人爽久久 | 色视频www国产| 亚洲人与动物交配视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 天天添夜夜摸| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品女同一区二区软件 | 九九在线视频观看精品| 一本综合久久免费| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日韩欧美国产在线观看| 久久久国产成人精品二区| 日韩亚洲欧美综合| 69av精品久久久久久| 亚洲av一区综合| 制服丝袜大香蕉在线| 久久久国产精品麻豆| 90打野战视频偷拍视频| 午夜福利在线在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 九色国产91popny在线| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 岛国视频午夜一区免费看| 国产老妇女一区| 一个人看视频在线观看www免费 | 九九在线视频观看精品| 久久久久免费精品人妻一区二区| 在线国产一区二区在线| www国产在线视频色| 国产成人影院久久av| 国产乱人视频| 少妇高潮的动态图| 国产色婷婷99| 成年免费大片在线观看| 深爱激情五月婷婷| 亚洲av免费在线观看| 一区二区三区激情视频| 国产精品野战在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 色播亚洲综合网| 欧美性感艳星| 麻豆国产97在线/欧美| 五月玫瑰六月丁香| 色吧在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲无线观看免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 老司机深夜福利视频在线观看| 在线看三级毛片| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久亚洲精品不卡| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产在视频线在精品| 青草久久国产| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 香蕉丝袜av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| avwww免费| 一区二区三区高清视频在线| www日本在线高清视频| 国产精品电影一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女免费视频网站| 国产爱豆传媒在线观看| 免费观看精品视频网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 午夜激情福利司机影院| 99国产精品一区二区蜜桃av| 露出奶头的视频| 黄片小视频在线播放| 国产一区二区在线观看日韩 | 欧美三级亚洲精品| 日韩欧美在线乱码| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久国产成人精品二区| 成年人黄色毛片网站| 亚洲七黄色美女视频| 国产av不卡久久| 99国产极品粉嫩在线观看| ponron亚洲| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美在线黄色| 手机成人av网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费高清视频大片| 美女大奶头视频| 国产av在哪里看| 日本成人三级电影网站| 国产探花极品一区二区| 久久草成人影院| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲成a人片在线一区二区| 99在线视频只有这里精品首页| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲七黄色美女视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲av美国av| 国产野战对白在线观看| 动漫黄色视频在线观看| 99视频精品全部免费 在线| 香蕉久久夜色| 国产精品久久久久久久久免 | 日韩国内少妇激情av| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美中文综合在线视频| 高清在线国产一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 窝窝影院91人妻| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 桃色一区二区三区在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美bdsm另类| 亚洲精品在线观看二区| av天堂中文字幕网| 午夜视频国产福利| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲五月婷婷丁香| 成人特级黄色片久久久久久久| 校园春色视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产亚洲精品av在线| 亚洲欧美日韩东京热| 免费看光身美女| 亚洲美女黄片视频| 在线观看一区二区三区| 我要搜黄色片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 好男人在线观看高清免费视频| 无人区码免费观看不卡| 欧美中文综合在线视频| 高清在线国产一区| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久精品国产综合久久久| 在线a可以看的网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 成人三级黄色视频| 精品国产美女av久久久久小说| 日韩欧美三级三区| 亚洲av美国av| 九色成人免费人妻av| 丝袜美腿在线中文| 亚洲人成电影免费在线| 操出白浆在线播放| tocl精华| 99久久精品国产亚洲精品| 在线看三级毛片| 久久伊人香网站| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产三级黄色录像| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲av第一区精品v没综合| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲无线在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 一个人免费在线观看电影| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久中文看片网| 国产三级黄色录像| 亚洲18禁久久av| 免费观看人在逋| 天美传媒精品一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 黄色视频,在线免费观看| 69av精品久久久久久| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美黄色淫秽网站| 两个人看的免费小视频| 一级毛片高清免费大全| 怎么达到女性高潮| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 丁香欧美五月| 草草在线视频免费看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 午夜亚洲福利在线播放| 欧美黑人巨大hd| 亚洲欧美激情综合另类| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 精品久久久久久成人av| 欧美区成人在线视频| 国产av在哪里看| 午夜免费观看网址| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品国产美女av久久久久小说| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲精品色激情综合| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 麻豆成人午夜福利视频| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品色激情综合| 舔av片在线| 夜夜爽天天搞| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产在视频线在精品| 一本综合久久免费| 在线天堂最新版资源| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美乱色亚洲激情| 日本熟妇午夜| 国产真实伦视频高清在线观看 | 91久久精品国产一区二区成人 | xxxwww97欧美| 国产中年淑女户外野战色| www国产在线视频色| 成人欧美大片| 国产免费男女视频| 日本成人三级电影网站| 男人舔奶头视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品免费久久久久久久清纯| av女优亚洲男人天堂| 女警被强在线播放| 欧美大码av| 国产精品99久久久久久久久| 婷婷亚洲欧美| 亚洲乱码一区二区免费版| 麻豆国产97在线/欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲最大成人手机在线| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 此物有八面人人有两片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 天堂√8在线中文| 欧美zozozo另类| 老司机午夜福利在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产成人av激情在线播放| 国产成人av激情在线播放| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美日本视频| 亚洲欧美日韩东京热| 精品一区二区三区人妻视频| www日本黄色视频网| 哪里可以看免费的av片| 国产精品免费一区二区三区在线| 亚洲黑人精品在线| av片东京热男人的天堂| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 无遮挡黄片免费观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 黄色片一级片一级黄色片| www.熟女人妻精品国产| 丁香六月欧美| 身体一侧抽搐| 亚洲美女黄片视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 黄色丝袜av网址大全| 国产熟女xx| 日韩成人在线观看一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 99热这里只有是精品50| 欧美另类亚洲清纯唯美| 怎么达到女性高潮| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲成人久久性| 精品人妻1区二区| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美激情在线99| 三级毛片av免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产精品999在线| 国产免费av片在线观看野外av| 欧美一区二区国产精品久久精品| 午夜福利在线观看吧| 亚洲七黄色美女视频| 青草久久国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日本一二三区视频观看| 日本在线视频免费播放| 亚洲最大成人中文| 久久久久亚洲av毛片大全| 香蕉av资源在线| 国产一区二区激情短视频| 欧美色视频一区免费| x7x7x7水蜜桃| 国产久久久一区二区三区| 男女那种视频在线观看| 欧美日韩精品网址| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99久久成人亚洲精品观看| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日韩精品青青久久久久久| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 午夜福利免费观看在线| 男女视频在线观看网站免费| 少妇人妻精品综合一区二区 | 日韩欧美在线乱码| 婷婷亚洲欧美| av国产免费在线观看| 色播亚洲综合网| 国产97色在线日韩免费| 午夜视频国产福利| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 长腿黑丝高跟| 十八禁人妻一区二区| 级片在线观看| 国产乱人伦免费视频| 美女大奶头视频| 乱人视频在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久久久大精品| 成年女人毛片免费观看观看9| av专区在线播放| 男女午夜视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 无遮挡黄片免费观看| 欧美性感艳星| 久久伊人香网站| 免费在线观看影片大全网站| 黄片小视频在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲乱码一区二区免费版| 给我免费播放毛片高清在线观看| 在线观看舔阴道视频| 亚洲精品成人久久久久久| 日韩av在线大香蕉| 国产色婷婷99| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久性视频一级片| 无限看片的www在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 麻豆国产av国片精品| 久久精品国产综合久久久| 婷婷六月久久综合丁香| 可以在线观看的亚洲视频| 天天一区二区日本电影三级| www.色视频.com| 99热6这里只有精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色综合站精品国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 激情在线观看视频在线高清| 国产主播在线观看一区二区| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产三级中文精品| 国模一区二区三区四区视频| 少妇的逼水好多| 久久这里只有精品中国| 一级黄片播放器| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av片东京热男人的天堂| 国产老妇女一区| 中文字幕熟女人妻在线| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 少妇高潮的动态图| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品久久久久久久电影 | 美女被艹到高潮喷水动态| 久久精品国产自在天天线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| av福利片在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 51国产日韩欧美| 国产99白浆流出| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲在线观看片| 久久久成人免费电影| 美女 人体艺术 gogo| 免费av不卡在线播放| 天天添夜夜摸| 亚洲av成人精品一区久久| 日本 av在线| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产三级在线视频| 最近在线观看免费完整版| 欧美日韩国产亚洲二区| 88av欧美| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高潮美女av| 日本a在线网址| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产av在哪里看| 欧美乱妇无乱码| 国产黄片美女视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲人成网站在线播| 91久久精品电影网| 最后的刺客免费高清国语| 亚洲午夜理论影院| 99久久精品热视频| 美女 人体艺术 gogo| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 两个人视频免费观看高清| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 又紧又爽又黄一区二区| 露出奶头的视频| 制服人妻中文乱码| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲av二区三区四区| 成年女人永久免费观看视频| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人中文字幕在线播放| 午夜激情欧美在线| 在线a可以看的网站| 亚洲七黄色美女视频| 日日夜夜操网爽| 成人三级黄色视频| 国产麻豆成人av免费视频| 国产视频一区二区在线看| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲欧美日韩东京热| 我要搜黄色片| netflix在线观看网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 内地一区二区视频在线| 久久精品国产自在天天线| 精品久久久久久成人av| 久久人人精品亚洲av| 两人在一起打扑克的视频| 国产高清视频在线播放一区| 久久性视频一级片| 日本熟妇午夜| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲在线自拍视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 婷婷丁香在线五月| 神马国产精品三级电影在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 小说图片视频综合网站| 岛国在线免费视频观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇的逼好多水| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 成人特级黄色片久久久久久久| 久久亚洲真实| 岛国在线观看网站| 国产精品精品国产色婷婷| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美在线黄色| 国内精品久久久久久久电影| 久久国产精品影院| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费看光身美女| 久久久国产精品麻豆| 99热精品在线国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国内精品久久久久精免费| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 观看免费一级毛片| 国产精品久久久久久精品电影| 内地一区二区视频在线| 美女免费视频网站| 狂野欧美激情性xxxx| 国产av在哪里看| 国产视频内射| 国产男靠女视频免费网站| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久久人人人人人| 国产淫片久久久久久久久 | 少妇人妻精品综合一区二区 | 深夜精品福利| 国产午夜精品论理片| 乱人视频在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品电影一区二区三区| 天堂√8在线中文| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美午夜高清在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| av国产免费在线观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩欧美精品v在线| 国内精品久久久久久久电影| 97碰自拍视频| 99久久精品国产亚洲精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| aaaaa片日本免费| av在线蜜桃| 国产淫片久久久久久久久 | 久久久国产成人免费| 欧美三级亚洲精品| 一本一本综合久久| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 好男人电影高清在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美又色又爽又黄视频| 99精品久久久久人妻精品| 日本黄大片高清| 精品欧美国产一区二区三| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲成人久久爱视频| 午夜福利高清视频| 国产成人av教育| 久久精品人妻少妇| av片东京热男人的天堂| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| x7x7x7水蜜桃| 免费看a级黄色片| 国产亚洲欧美98| 色在线成人网| xxxwww97欧美| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品久久久久久久久免 | 精品国内亚洲2022精品成人| 国产黄a三级三级三级人| 中文字幕久久专区| 免费高清视频大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 天堂√8在线中文| 国产欧美日韩精品一区二区| 变态另类丝袜制服| 成人精品一区二区免费| 极品教师在线免费播放| 99国产精品一区二区三区| 国产精品 国内视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩亚洲欧美综合| 中文字幕av成人在线电影| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产69精品久久久久777片| 波多野结衣高清无吗| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产一区二区在线观看日韩 |