達(dá)格列凈對糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制研究

[摘要]"目的"探討達(dá)格列凈對糖尿病腎病（diabetic"nephropathy，DN）大鼠的腎臟保護(hù)作用及對AMP活化蛋白激酶（AMP-activated"protein"kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路表達(dá)的影響。方法"SPF級Wistar雄性大鼠40只，隨機(jī)分為正常組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組各10只。成功制備DN模型后，正常組大鼠給予普通飼料+生理鹽水灌胃；模型組大鼠給予高糖高脂飼料+生理鹽水灌胃；低劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達(dá)格列凈1mg/（kg·d）灌胃；高劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達(dá)格列凈10mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠連續(xù)干預(yù)12周。比較各組大鼠的腎功能指標(biāo)、腎臟病理組織變化、p-AMPK和p-mTOR蛋白表達(dá)、Ⅰ型膠原（collagen"type"Ⅰ，COL"Ⅰ）、Ⅳ型膠原（collagen"type"Ⅳ，COL"Ⅳ）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）水平。結(jié)果"模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的血尿素氮（blood"urea"nitrogen，BUN）、血肌酐（serum"creatinine，SCr）、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達(dá)、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著高于正常組，p-AMPK蛋白表達(dá)顯著低于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達(dá)、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于模型組，p-AMPK蛋白表達(dá)顯著高于模型組（Plt;0.05）；高劑量組大鼠的BUN、SCr、24h尿蛋白定量、p-mTOR蛋白表達(dá)、COL"Ⅰ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于低劑量組，p-AMPK蛋白表達(dá)顯著高于低劑量組（Plt;0.05）。結(jié)論"達(dá)格列凈對DN大鼠具有良好的腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]"達(dá)格列凈；糖尿病腎?。荒I臟保護(hù)；AMPK/mTOR信號通路

[中圖分類號]"R587.2""""""[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.10.015

Study"on"the"protective"mechanism"of"dapagliflozin"on"kidney"in"diabetic"nephropathy"rats

YE"Yuyan1，"WANG"Peng2，"FANG"Xia1，"YANG"Jing1

1.Department"of"Nephrology，"Jinhua"People’s"Hospital，"Jinhua"321000，"Zhejiang，"China;"2.Department"of"Pharmacy，"Jinhua"People’s"Hospital，"Jinhua"321000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"protective"effect"of"dapagliflozin"on"kidney"and"the"expression"of"AMP-activated"protein"kinase"（AMPK）/"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"signaling"pathway"in"diabetic"nephropathy"（DN）"rats."Methods"A"total"of"40"SPF"Wistar"male"rats"were"randomly"divided"into"normal"group，"model"group，"low-dose"group"and"high-dose"group，"with"10"rats"in"each"group."After"the"DN"model"was"successfully"prepared，"the"rats"in"normal"group"were"given"normal"diet"+"normal"saline"by"gavage，"the"rats"in"model"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed"+"normal"saline"by"gavage，"the"rats"in"low-dose"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed+1mg/（kg·d）"of"dapagliflozin"by"gavage，"the"rats"in"high-dose"group"was"given"high"sugar"and"high"fat"feed+10mg/（kg·d）"of"dapagliflozin"by"gavage."Rats"in"each"group"were"continuously"gavaged"for"12"weeks."Renal"function"indexes，"renal"pathological"changes，"p-AMPK"and"p-mTOR"protein"expression，"collagen"type"Ⅰ"（COL"Ⅰ），"collagen"type"Ⅳ"（COL"Ⅳ）"and"fibronectin"（FN）"of"all"groups"were"compared."Results"Blood"urea"nitrogen"（BUN），"serum"creatinine"（SCr），"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"of"rats"in"model"group，"low-dose"group"and"high-dose"group"were"significantly"higher"than"those"in"normal"group，"and"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"lower"than"that"of"normal"group"（Plt;0.05）."BUN，"SCr，"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"of"rats"in"low-dose"group"and"high-dose"group"were"significantly"lower"than"those"in"model"group，"while"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"higher"than"that"in"model"group"（Plt;0.05）."BUN，"SCr，"24h"urinary"protein"quantity，"p-mTOR"protein"expression，"COL"Ⅰ，"COL"Ⅳ"and"FN"levels"in"high-dose"group"were"significantly"lower"than"those"in"low-dose"group，"and"p-AMPK"protein"expression"was"significantly"higher"than"that"in"low-dose"group"（Plt;0.05）."Conclusion"Dapagliflozin"has"a"good"kidney"protection"effect"on"DN"rats，"and"its"mechanism"may"be"related"to"the"regulation"of"AMPK/mTOR"signaling"pathway.

[Key"words]"Dapagliflozin;"Diabetic"nephropathy;"Kidney"protection;"AMPK/mTOR"signaling"pathway

糖尿病是常見的內(nèi)分泌疾病，其患病率逐年增加，已成為引起全球慢性腎臟疾病的主要原因[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，約40%的糖尿病患者會發(fā)生糖尿病腎病（diabetic"nephropathy，DN），且伴DN患者的死亡率較單純糖尿病患者高3倍以上，嚴(yán)重威脅人們的生命安全[3]。因此，尋找延緩DN的治療方法是當(dāng)前研究的熱點[4]。達(dá)格列凈具有多種藥理作用，可發(fā)揮良好的腎臟保護(hù)作用[5]。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated"protein"kinase，AMPK）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）信號通路在調(diào)控細(xì)胞自噬和衰老中發(fā)揮重要作用，且與終末期腎病發(fā)病機(jī)制有一定的相關(guān)性[6]?；诖耍狙芯刻接戇_(dá)格列凈對DN大鼠腎臟保護(hù)作用及對AMPK/mTOR信號通路表達(dá)的影響，以期為臨床治療DN及其機(jī)制研究提供參考。

1""材料與方法

1.1""實驗材料

1.1.1""實驗動物""SPF級Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（190±10）g，購自浙江鷹旸醫(yī)藥研發(fā)有限公司，許可證號：SYXK（浙）2021-0033。適應(yīng)性飼養(yǎng)5d，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，光照每12h明暗交替。

1.1.2""實驗藥物""達(dá)格列凈片（阿斯利康制藥有限公司）。

1.2""主要試劑

p-AMPK一抗（英國Abcam公司），p-mTOR（英國Abcam公司），大鼠Ⅰ型膠原（collagen"type"Ⅰ，COL"Ⅰ）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司），大鼠Ⅳ型膠原（collagen"type"Ⅳ，COL"Ⅳ）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司），大鼠纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）試劑盒（上海佰利萊生物科技有限公司）。

1.3""方法

1.3.1""實驗分組""40只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、低劑量組和高劑量組，每組各10只。

1.3.2""模型準(zhǔn)備""正常組大鼠給予自由飲水和普通飼料，其余各組大鼠給予高糖高脂飼料。高糖高脂飼料配方：65%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+1.5%混調(diào)劑+1%膽酸鈉。連續(xù)喂養(yǎng)4周后。2型糖尿病模型構(gòu)建：過夜禁食12h后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素100mg/kg，當(dāng)血糖（白天）空腹6h維持在11.2～16.7mmol/L時即模型構(gòu)建成功。成功構(gòu)建的2型糖尿病大鼠模型在鏈脲佐菌素處理后4周測定24h尿蛋白，若大鼠24h尿蛋白≥30mg，提示DN模型大鼠構(gòu)建成功。

1.3.3""給藥方法nbsp;"正常組大鼠給予普通飼料+生理鹽水灌胃；模型組大鼠給予高糖高脂飼料+生理鹽水灌胃；低劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達(dá)格列凈1mg/（kg·d）灌胃；高劑量組大鼠給予高糖高脂飼料+達(dá)格列凈10mg/（kg·d）灌胃。各組大鼠均灌胃12周。

1.4""觀察指標(biāo)

1.4.1""樣本收集處理""①尿液和血清標(biāo)本收集：干預(yù)12周后留取大鼠24h尿液檢測24h尿蛋白定量，腹主動脈取血，測定大鼠血尿素氮（blood"urea"nitrogen，BUN）、血肌酐（serum"creatinine，SCr）；②腎臟標(biāo)本：干預(yù)12周后處死大鼠，腹部向上固定于解剖臺上，剪開腹部皮層，充分暴露腹腔，分離腎臟，于腎門處離斷腎蒂，將腎臟取出置于冰盒上，使用組織鑷仔細(xì)剝離腎臟包膜，將去除包膜的腎臟置于標(biāo)本盒中，–80℃保存。

1.4.2""腎臟組織染色及免疫組織化學(xué)""①蘇木精-伊紅染色（hematoxylin"and"eosin"staining，HE染色）：4%多聚甲醛固定大鼠腎臟組織，酒精梯度脫水；分別置于二甲苯和乙醇等比例混合溶液中2h，再將其置于二甲苯（Ⅰ）溶液10min和二甲苯（Ⅱ）溶液10min；包埋石蠟組織；固定于切片機(jī)上，切片4μm，載玻片上晾干，60℃烤箱中烘干備用，萊卡熒光顯微鏡觀察拍照。②Masson染色：將大鼠腎臟組織切片脫蠟，依次用自來水和蒸餾水洗；再以Weigert蘇木精液或Regaud蘇木精染液染核5～10min，充分水洗；再給予Masson麗春紅酸性復(fù)紅液5～10min；2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；1%磷鉬酸水溶液分化3～5min；不經(jīng)水洗，直接采用光綠液或苯胺藍(lán)染5min；0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻；95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固，使用萊卡熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4.3""蛋白質(zhì)印跡檢測""取大鼠腎臟組織用冷磷酸鹽緩沖液（phosphate"buffer"saline，PBS）清洗，切至約1mm3，液氮下研磨，提取蛋白樣品。蛋白濃度應(yīng)用BCA試劑盒檢測，30μg蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳凝膠100V電泳2h，400mA聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂牛奶封閉2h，一抗[p-AMPK"1∶1000、p-mTOR"1∶1000、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（recombinant"glyceraldehyde-3-phosphate"dehydrogenase，GAPDH）1∶2000]4℃孵育過夜，Tris緩沖鹽溶液清洗3次，每次10min，二抗[山羊抗兔（鼠）免疫球蛋白G"HRP"1∶3000]室溫孵育2h，ECL發(fā)光液曝光成像，Image"J軟件分析條帶灰度值。

1.4.4""酶聯(lián)免疫吸附測定""采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測COLⅠ、COL"Ⅳ、FN水平。

1.5""統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS"26.0軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2""結(jié)果

2.1""各組大鼠的腎組織病理情況

正常組大鼠的腎小管排列整齊，腎間質(zhì)無異常，腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；模型組大鼠的腎間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球體積增大、系膜區(qū)增生，腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空間泡變性，小動脈管壁增厚；低劑量組和高劑量組大鼠的腎間質(zhì)、腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)排列較整齊，且大鼠的腎小球系膜區(qū)增生改善，腎小球體積縮小，腎小管損傷明顯減少，見圖1、圖2。

2.2""各組大鼠的腎功能指標(biāo)比較

模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr和24h尿蛋白定量均顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的BUN、SCr和24h尿蛋白定量水平均顯著低于模型組，且高劑量組低于低劑量組（Plt;0.05），見表1。

2.3""各組大鼠的p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)比較

模型組、低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達(dá)顯著低于正常組，而p-mTOR蛋白表達(dá)顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達(dá)顯著高于模型組，而p-mTOR蛋白表達(dá)顯著低于模型組（Plt;0.05）；高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達(dá)顯著高于低劑量組，而p-mTOR蛋白表達(dá)顯著低于低劑量組（Plt;0.05），見表2、圖3。

2.4""各組大鼠的COLⅠ、COL"Ⅳ和FN水平比較

COL"Ⅳ和FN水平均顯著高于正常組（Plt;0.05）；低劑量組和高劑量組大鼠的COLⅠ、COL"Ⅳ和FN水平均顯著低于模型組，且高劑量組低于低劑量組（Plt;0.05），見表3。

3""討論

DN常見癥狀主要為持續(xù)性蛋白尿、腎功能損傷、水腫等，最終可發(fā)展為終末期腎病[7-11]。因此，采取科學(xué)有效的方法治療DN尤為關(guān)鍵。

近年來，鈉-葡萄糖耦聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)體2（sodium-glucose"linked"transporter"2，SGLT-2）抑制劑已被證實具有較好的腎臟保護(hù)作用[12-13]。SGLT-2抑制劑主要通過阻斷近端小管對葡萄糖的重吸收從而促進(jìn)尿糖排泄，發(fā)揮降糖作用。SGLT-2抑制劑除降低血糖外，還可減少心血管事件發(fā)生[14-15]。達(dá)格列凈是SGLT-2抑制劑代表藥物，主要通過抑制腎近曲小管對葡萄糖的重吸收，從而使過量的葡萄糖從尿中排出，以此降低血糖[16-17]。本研究表明，達(dá)格列凈可顯著減輕腎臟病理損傷，降低BUN、SCr和24h尿蛋白定量，顯著改善DN大鼠的腎臟功能。

研究表明，DN的發(fā)病過程與腎臟細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積和腎臟細(xì)胞自噬功能受抑制等關(guān)系緊密[18]。腎臟細(xì)胞在糖尿病狀態(tài)下，其自噬功能受抑制，無法及時有效地清除毒性物質(zhì)，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)大量堆積，損害細(xì)胞、加速衰老，導(dǎo)致腎臟損傷。自噬參與多種腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展，自噬障礙使細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive"oxygen"species，ROS）增加，加重炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。AMPK是一種在能量耗竭條件下激活的營養(yǎng)素敏感激酶，mTOR是自噬過程中的關(guān)鍵調(diào)控分子，mTOR的激活在生理條件下可阻斷自噬。AMPK的激活對mTOR有抑制作用，此為自噬信號激活的經(jīng)典通路之一。AMPK/mTOR信號通路在調(diào)控細(xì)胞自噬和衰老中發(fā)揮重要作用[19]。AMPK和mTOR經(jīng)蛋白磷酸化可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝與自噬水平，抑制mTOR激酶信號通路、激活A(yù)MPK信號通路均可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬以延緩衰老，延長生物體壽命[20]。本研究表明，低劑量組和高劑量組大鼠的p-AMPK蛋白表達(dá)顯著高于模型組，而p-mTOR蛋白表達(dá)顯著低于模型組，由此可見達(dá)格列凈可通過上調(diào)p-AMPK蛋白表達(dá)及下調(diào)p-mTOR蛋白表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，達(dá)格列凈對DN大鼠具有良好的腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AMPK/mTOR信號通路表達(dá)有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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