基于GC-MS的保留指數(shù)分析黑胡椒精油揮發(fā)性成分

尹團(tuán)章 邵佩 吳昭 程書(shū)鋒

摘要：為分析海南產(chǎn)黑胡椒精油中的揮發(fā)性成分，為公眾進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用黑胡椒提供科學(xué)依據(jù)，采用水蒸氣蒸餾法制備了黑胡椒精油，并基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)對(duì)精油成分進(jìn)行了定性分析。從黑胡椒精油中鑒定出了27種主要的揮發(fā)性成分，含量較高的組分為β-石竹烯（23.91%）、檸檬烯（17.23%）、3-蒈烯（19.30%）、β-蒎烯（7.83%）和石竹烯氧化物（3.01%）。對(duì)δ-杜松烯、檸檬烯、順式香檜醇（cis-sabinol）、cyclohexene， 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、對(duì)傘花烴（P-cymene）進(jìn)行鑒定，使精油的定性結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠。

關(guān)鍵詞：黑胡椒精油；保留指數(shù)；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；水蒸氣蒸餾法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS264.3 ?????文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ????文章編號(hào)：1000-9973（2024）04-0178-04

Analysis of Volatile Components in Black Pepper Essential Oil

Based on GC-MS Retention Index

YIN Tuan-zhang1， SHAO Pei1， WU Zhao2， CHENG Shu-feng2

（1.Wuhan Huanghelou New Materials Technology Development Co.， Ltd.， Wuhan 430040， China;

2.Wuhan Huanghelou Flavors & Fragrances Co.， Ltd.， Wuhan 430040， China）

Abstract： In order to analyze the volatile components in essential oil from black pepper produced in Hainan and provide scientific basis for the public to further develop and utilize black pepper， the black pepper essential oil is prepared by steam distillation method， and then essential oil components are analyzed qualitatively by gas chromatography-mass spectroscopy （GC-MS） combined with retention index. A total of 27 kinds of main volatile components are identified from black pepper essential oil. The components with higher content are β-caryophyllene （23.91%）， limonene （17.23%）， 3-carene （19.30%）， β-pinene （7.83%） and caryophyllene oxide （3.01%）. The identification of δ-cadinene， limonene， cis-sabinol， cyclohexene， 3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（terpinolene）， cyclohexene， 1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（terpinolene） and P-cymene makes the qualitative results more accurate and reliable.

Key words： black pepper essential oil; retention index; volatile components; gas chromatography-mass spectroscopy （GC-MS）; steam distillation method

收稿日期：2023-09-23

基金項(xiàng)目：湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（2021JSXL3XL2B021）

作者簡(jiǎn)介：尹團(tuán)章（1972—），男，高級(jí)農(nóng)藝師，博士，研究方向：香精香料技術(shù)。

胡椒科藤本植物黑胡椒（black pepper）學(xué)名Piper nigrun L.，為多年生熱帶和亞熱帶香辛料作物，素有“香料之王”的美譽(yù)，在巴西、印度、東南亞等地廣泛種植，在我國(guó)廣東、海南、福建等沿海地區(qū)也有種植[1-2] 。

黑胡椒精油是黑胡椒籽的主要深加工產(chǎn)品，具有強(qiáng)烈的芳香味和較強(qiáng)的抗氧化、防腐功能[3-4]，是食品行業(yè)一種重要的香料。國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了一系列黑胡椒精油提取方法和揮發(fā)性成分分析的研究。徐可文等[5]采用水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒精油后，通過(guò)GC-MS和 FTIR（傅里葉變換紅外光譜法）分析出丁香烯、1R-α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、D-檸檬烯為精油的主要特殊成分。王玨等[6]采用了3種精油提取方法，包括兩種溶劑萃取法（分別以1∶1比例的戊烷與乙醚混合液、甲基叔丁基醚為溶劑）和頂空固相微萃取法，制得黑胡椒精油，通過(guò)主成分分析得出，具有較大香氣風(fēng)味貢獻(xiàn)率的揮發(fā)性成分為β-石竹烯、檸檬烯、3-蒈烯、β-蒎烯。段夢(mèng)雅等[7]采用水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒油、白胡椒油、青胡椒油和胡椒鮮果精油，成分分析得出萜烯類(lèi)的β-石竹烯、D-檸檬烯、3-蒈烯等為4種精油的主要揮發(fā)性成分。侯冬巖等[8]采用蒸餾萃取法萃取了黑胡椒油并進(jìn)行了成分分析，得出主要揮發(fā)性成分為石竹烯、檸檬烯、3-蒈烯和可巴烯等萜烯類(lèi)化合物。Al-Sayed等[9]用水蒸氣蒸餾法提取黑胡椒、白胡椒、長(zhǎng)胡椒的揮發(fā)油，由分析結(jié)果可知黑胡椒、白胡椒的揮發(fā)油主要成分為單萜烯類(lèi)的β-蒎烯、α-蒎烯、β-石竹烯、3-蒈烯、檸檬烯等。Dosoky等[10]用水蒸氣蒸餾法提取了6種馬達(dá)加斯加黑胡椒精油和5種巴西黑胡椒精油，通過(guò)GC-MS分析出β-石竹烯、3-蒈烯、檸檬烯、β-蒎烯、α-蒎烯、檜烯為主要成分。

近年來(lái)，盡管已有眾多學(xué)者對(duì)黑胡椒精油的化學(xué)成分進(jìn)行研究，但對(duì)一些成分的定性仍然不夠準(zhǔn)確，因?yàn)閷?duì)具有多個(gè)官能團(tuán)的化學(xué)成分而言，質(zhì)譜檢索結(jié)果可能有多個(gè)高匹配度的化合物與之對(duì)應(yīng)，僅依靠質(zhì)譜檢索結(jié)果外加人工輔助解析進(jìn)行準(zhǔn)確定性稍顯不足，因?yàn)镵ovats保留指數(shù)（KI） 一方面在色譜定性中重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度都很好，另一方面在區(qū)分同一化合物的不同同分異構(gòu)體上具有明顯優(yōu)勢(shì)，故本文在黑胡椒精油GC-MS化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上，引入保留指數(shù)開(kāi)展黑胡椒精油的定性分析。采用保留指數(shù)結(jié)合質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)（NIST 17.L）檢索的方式對(duì)水蒸氣蒸餾法提取的海南產(chǎn)黑胡椒精油揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和鑒定，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)黑胡椒精油提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

黑胡椒果：海南產(chǎn)，干燥果實(shí)，含水量＜8%，購(gòu)于武漢市神草中藥飲片有限責(zé)任公司。

1.2 試劑

無(wú)水乙醇、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正構(gòu)烷烴C8～C20混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

8890-5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司；98-1-B型電加熱套 天津市泰斯特儀器有限公司；圓底燒瓶、冷凝管、油水分離器等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)玻璃儀器 四川蜀牛玻璃儀器有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 黑胡椒精油的提取

稱(chēng)取黑胡椒果樣品300 g置于5 000 mL圓底燒瓶中，按照料液比1∶10加入去離子水浸泡3～4 h，用水蒸氣蒸餾6 h，至油水分離器的量柱中精油量基本不再增加時(shí)停止加熱。冷卻后，打開(kāi)量柱下端的閥門(mén)，將下層水分緩慢放出，收集上層精油部分，得到具有濃郁辛香韻的淡黃色澄清液體。然后用無(wú)水硫酸鈉去除水分，得到黑胡椒精油，取 1.0 μL用無(wú)水乙醇稀釋后供GC-MS分析。

1.4.2 GC-MS分析條件[11]

色譜條件：DB-5毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣（He）流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為1 μL；分流比為50∶1；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；升溫程序：60 ℃保持1 min，以4 ℃/min升溫至240 ℃，再以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲時(shí)間3 min；質(zhì)量掃描范圍（m/z）：40～550 amu。

1.4.3 KI值的計(jì)算[12]

根據(jù)上述的GC-MS條件分析正構(gòu)烷烴的混合對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品，記錄其保留時(shí)間；按照線性升溫程序的保留指數(shù)KI的計(jì)算公式，計(jì)算黑胡椒精油各揮發(fā)性成分的KI值，與NIST Chemistry WebBook網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)中的KI*值進(jìn)行比對(duì)，可接受誤差不超過(guò)3%。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑胡椒精油揮發(fā)性成分分析

開(kāi)展GC-MS分析提取得到黑胡椒精油的揮發(fā)性成分，精油總離子流圖見(jiàn)圖1。

采用峰面積歸一化法，通過(guò)黑胡椒精油揮發(fā)性成分總離子流圖來(lái)計(jì)算各成分的相對(duì)含量，對(duì)相對(duì)含量大于0.1%的成分進(jìn)行定性分析。各色譜峰質(zhì)譜匹配度較高的可能物質(zhì)，通過(guò)所得的計(jì)算值KI與檢索其文獻(xiàn)值KI*二者接近度最高為準(zhǔn)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

由圖1和表1可知，通過(guò)GC-MS分析黑胡椒精油，再在此基礎(chǔ)上對(duì)保留指數(shù)KI進(jìn)行定性分析，從黑胡椒精油揮發(fā)性成分中共鑒定出主要成分27種，占精油總揮發(fā)性成分的99.18%，以烯烴類(lèi)為主。其中，烯烴類(lèi)19種，占比88.95%；醇類(lèi)6種，占比7.04%；酮類(lèi)1種，占比0.18%；其他類(lèi)1種，占比3.01%。

2.2 保留指數(shù)準(zhǔn)確定性黑胡椒精油的揮發(fā)性成分

基于GC-MS分析，采用保留指數(shù)對(duì)黑胡椒精油揮發(fā)性成分進(jìn)行充分定性，這種組合的分析方法較以往單獨(dú)使用GC-MS的NIST 17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索分析更加準(zhǔn)確。在精油成分分析中，有一個(gè)明顯的色譜峰，其保留時(shí)間為17.182 min，通過(guò)NIST 17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索，得到兩個(gè)具有90%以上相似度的化合物，為杜松烯的同分異構(gòu)體，分別是δ-杜松烯（KI*值為1 524[13]）、β-杜松烯（KI*值為1 472[14]），而通過(guò)計(jì)算得到符合此色譜峰的化合物保留指數(shù)KI值為1 525，故可鑒定此化合物為δ-杜松烯。

在精油成分分析中保留時(shí)間為8.403 min時(shí)的色譜峰，由質(zhì)譜定性分析可知為右旋檸檬烯和檸檬烯，計(jì)算得出保留指數(shù)KI值為1 030，通過(guò)查閱的保留指數(shù)KI*值為1 033 [15]，而右旋檸檬烯的保留指數(shù)KI*值未能查出。雖二者在黑胡椒精油文獻(xiàn)中均有報(bào)道[6-10]，但定性為檸檬烯的文獻(xiàn)較多，結(jié)合保留指數(shù)分析，故可將保留時(shí)間為8.403 min的色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物鑒定為檸檬烯。

在精油成分分析中保留時(shí)間為9.548 min和9.596 min時(shí)的色譜峰，由質(zhì)譜定性分析可知為Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）和Cyclohexene， 1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯），二者的保留指數(shù)KI*值分別為1 083[16]，1 089[17]，故保留時(shí)間為9.548 min的色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物鑒定為Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯），而9.596 min的色譜峰所對(duì)應(yīng)的化合物鑒定為Cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）。

另外，在精油成分分析中保留時(shí)間為11.781 min時(shí)的色譜峰，由質(zhì)譜定性分析可知為順式香檜醇，根據(jù)實(shí)測(cè)保留指數(shù)KI值為1 216，而文獻(xiàn)保留指數(shù)KI*值為1 143[18]，二者數(shù)值差異達(dá)到5%以上。根據(jù)同一組分析中保留指數(shù)隨保留時(shí)間的增加而遞增的規(guī)律，順式香檜醇的保留指數(shù)KI*值為1 143，小于出峰時(shí)間更早的對(duì)甲基苯異丙醇、α-松油醇的保留指數(shù)KI*值（見(jiàn)表1），似乎不符合為這個(gè)色譜峰的化合物。但是，質(zhì)譜分析順式香檜醇的匹配度高達(dá)91%，且也在段夢(mèng)雅等[7]報(bào)道的黑胡椒精油中存在，揮發(fā)性成分分析的出峰時(shí)間也介于α-松油醇和δ-欖香烯二者出峰時(shí)間之間，同本文分析結(jié)果一致，因此可鑒定為順式香檜醇，其文獻(xiàn)保留指數(shù)KI*值為1 143，值得商榷，也有待于后續(xù)學(xué)者開(kāi)展黑胡椒精油中這一化合物鑒定的相關(guān)研究。

在精油成分分析中保留時(shí)間為8.317 min時(shí)的色譜峰，由質(zhì)譜定性分析可知為鄰傘花烴、間傘花烴或?qū)慊N，三者互為同分異構(gòu)體，經(jīng)比對(duì)保留指數(shù)文獻(xiàn)可知，3個(gè)互為同分異構(gòu)體的化合物的保留指數(shù)KI*值十分接近，分別為1 022，1 026，1 024（見(jiàn)表2），根據(jù)實(shí)測(cè)保留指數(shù)KI值為1 025，為鄰傘花烴的概率最小，但也無(wú)法鑒定是間傘花烴還是對(duì)傘花烴。由表2可知，3種化合物均報(bào)道存在于黑胡椒精油中，可能是因?yàn)楹诤肪驮系钠贩N、產(chǎn)地的土壤和氣候、收獲期等因素的影響，各產(chǎn)地或品種的黑胡椒精油成分中含有的傘花烴（cymene）結(jié)構(gòu)不同。而在Al-Sayed等[9]、Dosoky等[10]報(bào)道的黑胡椒精油中，結(jié)合保留指數(shù)進(jìn)行了揮發(fā)性成分分析，傘花烴基本以對(duì)傘花烴結(jié)構(gòu)存在，即使存在二種或二種以上結(jié)構(gòu)的傘花烴，也是以對(duì)傘花烴為主要組分。再結(jié)合本文選取相對(duì)含量大于0.1％的化學(xué)成分進(jìn)行分析的先決條件，綜合黑胡椒精油文獻(xiàn)報(bào)道和保留指數(shù)分析，此色譜峰的化合物定性為對(duì)傘花烴的概率較大，該色譜峰的化合物最終可鑒定為對(duì)傘花烴。

3 結(jié)論

在質(zhì)譜的定性分析結(jié)果中，從概率上看保留指數(shù)和質(zhì)譜圖均一致的揮發(fā)性成分出現(xiàn)的頻率較低，因此采用保留指數(shù)分析同分異構(gòu)體具有特殊的優(yōu)勢(shì)，在食品、油脂等定性工作中是十分重要的輔助方法[11]。但是，保留指數(shù)在揮發(fā)性成分定性分析中也存在些許不足，特別是在揮發(fā)性成分的多個(gè)同分異構(gòu)體的KI*值較接近的條件下，也需要借助人工解析等進(jìn)行定性，如本研究中黑胡椒精油中傘花烴的定性。

同時(shí)采用保留指數(shù)與NIST 17.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索對(duì)黑胡椒精油揮發(fā)性成分進(jìn)行了準(zhǔn)確定性，相對(duì)含量較高的組分為β-石竹烯23.91%、3-蒈烯19.30%、檸檬烯17.23%、β-蒎烯7.83%、異桉葉油醇4.25%和石竹烯氧化物3.01%。黑胡椒精油中β-石竹烯的含量居首位，與王玨等[6]、侯冬巖等[8]和王花俊等[23]的研究結(jié)果一致，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道3-蒈烯的含量居首位，基本上β-石竹烯和3-蒈烯的含量在黑胡椒精油中居前兩位。

在黑胡椒精油中已鑒定的27種組分中26種是由保留指數(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索結(jié)果鑒定得到的，特別是δ-杜松烯、檸檬烯、Cyclohexene，3-methyl-6-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、Cyclohexene，1-methyl-4-（1-methylethylidene）-（萜品油烯）、對(duì)傘花烴等的鑒定，其分析結(jié)果比僅使用譜庫(kù)檢索的方式更準(zhǔn)確。

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