秒楞葉綠體基因組特征及其系統(tǒng)發(fā)育分析

Chloroplast Genome Characteristics and Phylogenetic Analysis of Alsophila spinulosa

CHEN JianHong'，LONG Fang2， LIU Cao2， LIANG ShengHua'，HE QiuLan'， HUANG HongBao'，HUANG YaoHeng'，ZHU ZeKuan2*

（' Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation amp; Utilization， Guangxi Laboratory of Forestry， GuangxiForestry Research Institute，Nanning， Guangxi 53002， China；2Engineeing Construction Management

Branch of the China Southern Power Grid Peak and Frequency Modulation Power Generation Co.， Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510510， China）

Abstract： 【Objective】 This study aimed to investigate the structural characteristics and functional genes of the chloroplast genome in Alsophila spinulosa，explore its genomic evolutionary characteristics，andrevealthephylogeneticrelationships ofA.spinulosawith itsrelated speciesbasedon chloroplast genome data， so as to provide a basis for the taxonomy and evolutionary studies of ferns. 【Method】Using high-throughput sequencing technology， the complete chloroplast genome sequence was obtained， and bioinformatics tools were employed for genome annotation and SSR analysis.Related fern species were selected as references， and a phylogenetic tree was constructed based on chloroplast protein-coding genes to analyze evolutionary relationships among them.【Result】The chloroplast genome of A. spinulosa had a typical tetradic structure， with a total length of approximately 156 196 bp and a GC content of 40.44% . A total of 132 functional genes were annotated， including 89 protein-coding genes， 35 tRNA genes， and 8 rRNA genes. In the chloroplast genomes， 127 SSRs were identified， and most of them（94， accounting for approximately 74.02% ）were single nucleotide SSRs. Codon preference analysis revealed that among the 30 codons with RSCU values greater than 1，28 ended with A or U and 2 ended with G or C. Phylogenetic analysis demonstrated that the chloroplast genome（PQ740943.1）of A. spinulosa used in this study and the chloroplast genome of A. spinulosa published in NCBI （NC012818.1）were in the same cluster， both sharing close relationships with Sphaeropteris； and A. spinulosa had a close genetic relationship with A.podophylla and A. denticulata.【Conclusion】The chloroplast genome of A. spinulosa contains a conserved genomic structure and gene composition. The results provide data support for the taxonomic position and evolutionary history of Alsophila plants. Furthermore， this study lays a foundation for the evolutionary studies， species identification and genetic diversity analysis of ferns.

Keywords： Alsophila spinulosa； chloroplast genome； codon preference； phylogenesis

0 引言

【研究意義】秒楞（Alsophilaspinulosa）是秒科秘屬蕨類(lèi)植物，是白堊紀(jì)末、第三紀(jì)早期冰川的子遺植物，為現(xiàn)今僅有的木本蕨類(lèi)植物，被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物。蕨類(lèi)植物，又叫羊齒植物，喜愛(ài)陰涼環(huán)境（LIetal.，2014）。根據(jù)文獻(xiàn)記載，蕨類(lèi)植物的起源可以追溯到約4億年前，是地球上最早出現(xiàn)的維管植物之一（王婷等，2022）。蕨類(lèi)植物是植物界重要的類(lèi)群，代表了種子植物之前的一個(gè)演化階段，在研究植物進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育方面扮演著重要角色（ROTHFELSetal.，2015）。葉綠體基因組因其在光合作用、氨基酸合成及生物分類(lèi)學(xué)中的重要作用，被廣泛應(yīng)用于植物的系統(tǒng)發(fā)育研究（SONGetal.，2022a，2022b）。秒楞不僅具有園林觀賞價(jià)值，還兼具藥用和科學(xué)研究意義（范劍明等，2023；廖阿慶，2024）。因此，研究屬植物葉綠體基因組特征并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，不僅對(duì)蕨類(lèi)植物的分類(lèi)與進(jìn)化研究具有重要意義，也為保護(hù)瀕危植物提供科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，蕨類(lèi)植物最早具備較多的染色體數(shù)量，這與其早期分化及基因組重構(gòu)密切相關(guān)（CLARKetal.，2016）。葉綠體基因組由環(huán)狀DNA分子組成，其進(jìn)化速率低于核基因組，但高于線(xiàn)粒體基因組，在系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮著重要作用（錢(qián)方等，2022；SHIetal.，2023）。高通量測(cè)序技術(shù)推動(dòng)了植物葉綠體基因組研究的快速發(fā)展，積累了豐富的數(shù)據(jù)資源，為推測(cè)植物分期時(shí)間及生物地理提供了科學(xué)依據(jù)（WANGetal.，2021；龔琴，2024）。蕨類(lèi)植物的葉綠體基因組大多系母系遺傳，在進(jìn)化過(guò)程中可以保持相對(duì)的獨(dú)立性（GASTONYandYATSKIEVYCH，1992）。鐵線(xiàn)蕨中發(fā)現(xiàn)的PHY3嵌合體蛋白對(duì)紅藍(lán)光響應(yīng)敏感，為蕨類(lèi)植物在弱光環(huán)境下的生存發(fā)育提供了重要支撐（嚴(yán)岳鴻等，2019）?；谌~綠體基因組的鳳尾蕨屬研究表明，遠(yuǎn)距離擴(kuò)散是其全球分布的主要驅(qū)動(dòng)力（CHAOetal.，2014）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，秒楞屬植物的葉綠體基因組數(shù)據(jù)仍較為有限，限制了對(duì)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和進(jìn)化機(jī)制的深入研究。雖然已有多種蕨類(lèi)植物的葉綠體基因組被解析并應(yīng)用于分類(lèi)學(xué)研究，但楞屬植物的葉綠體基因組特征尚未得到系統(tǒng)研究。因此，本研究將聚焦屬代表物種，通過(guò)葉綠體基因組測(cè)序，探索其基因組特征?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)解析秒屬代表物種的葉綠體基因組特征，并以此為基礎(chǔ)探討秒屬植物與其近緣物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為進(jìn)一步研究紗屬植物的進(jìn)化特征及其在蕨類(lèi)植物分類(lèi)學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)中的地位提供理論和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以種植于廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院那坨苗圃的紗楞植株為試驗(yàn)材料，從生長(zhǎng)健壯的植株上摘取新鮮葉片，用紙巾擦拭干凈后，隨即放入液氮中速凍，接著轉(zhuǎn)移至一 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取及測(cè)序

使用改良的CTAB法提取紗葉片的總DNA，檢測(cè)合格后，通過(guò)Covaris超聲波破碎儀將其隨機(jī)打斷，經(jīng)末端修復(fù)、加A尾等標(biāo)準(zhǔn)流程構(gòu)建DNA文庫(kù)，在IlluminaNovaseq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)（cleandata）。

1.2.2葉綠體全基因組序列組裝與注釋

使用PAdesv3.11.0軟件（BANKEVICHet al.，2012）對(duì)獲得的cleandata進(jìn)行denovo組裝，設(shè)置kmer值分別為93、95、97、103、105、107、115。采用PGAv1.0.0軟件（QUetal.，2019）注釋秒葉綠體基因組，利用反向Blast確認(rèn)基因在葉綠體基因組中的具體位置。最終，將拼接并注釋完成的葉綠體基因序列上傳至OGDRAW（GREINERetal.，2019），利用在線(xiàn)工具生成注釋圖譜。

1.2.3葉綠體基因組特征分析

利用MISAv1.0軟件（BEIERetal.，2017）對(duì)秒楞葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）進(jìn)行分析檢測(cè)。單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重復(fù)閾值分別設(shè)為8、5、4、3、3和3，2個(gè)SSR位點(diǎn)間的最小檢出距離設(shè)置為 ，其余參數(shù)為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4密碼子堿基組成和偏好性分析

通過(guò)Perl腳本提取基因組的蛋白質(zhì)編碼序列，去除重復(fù)序列和長(zhǎng)度小于 的序列，保留以ATG為起始密碼子并以TAA、TAG或TGA為終止密碼子的編碼序列。對(duì)過(guò)濾后的序列進(jìn)行密碼子堿基組成分析，并使用CodonWv1.4.2軟件分析葉綠體基因組蛋白編碼基因的密碼子偏好性，計(jì)算相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymousco-don usage，RSCU）的值。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nihgov/）中下載11個(gè)物種的葉綠體基因組序列與本研究獲得的秒楞序列一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析（表1），其中7個(gè)來(lái)自屬（Alsophila，Cyathea），2個(gè)來(lái)自白秒楞屬（Sphaeropteris），以2個(gè)金毛狗屬（Ci-botium）物種的序列作為外群。通過(guò)MAFFTv7.037軟件（ROZEWICKIetal.，2019）進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用PhyloSuitevl.2.3軟件中的ModelFinder選擇最佳模型 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析；最后利用IQtreev2.2.0（MINHetal.，2020）構(gòu)建最大似然（maximumlikelihood，ML）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，1000次重復(fù)的Bootstrap檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1秒葉綠體基因組基本特征

楞葉綠體基因組組裝圖譜見(jiàn)圖1，為一段全長(zhǎng)156196bp的雙鏈環(huán)狀四分體分子，其結(jié)構(gòu)包括86 313bp的大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、 的反向重復(fù)A區(qū)（invertedrepeatA，IRA）、21623bp的小單拷貝區(qū)（small singlecopy，SSC）以及24130bp的反向重復(fù)B區(qū)（in-vertedrepeatB，IRB），這些區(qū)域以順時(shí)針?lè)较蛞来闻帕?。其中，IRA和IRB是具有相同堿基序列但轉(zhuǎn)錄方向相反的一對(duì)重復(fù)區(qū)，該基因組的GC含量為 40.44% 。獲得的秒楞葉綠體全基因組序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得的序列登錄號(hào)為PQ740943.1。本研究的平均測(cè)序深度為159.44X，并以NC012818.1作為注釋的參考基因組。經(jīng)過(guò)基因注釋后，秒楞共鑒定出132個(gè)基因，包括蛋白編碼基因89個(gè)、rRNA基因8個(gè)、tRNA基因35個(gè)。根據(jù)注釋信息，分為4類(lèi)（表2）：一是psaA、psaB、psaC等44個(gè)與光合作用相關(guān)的基因，二是rps3、rps4、rps7、rps8等58個(gè)與蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制相關(guān)的基因，三是5個(gè)未知功能基因ycfl、ycf2、ycf32、ycf4和ycf12，四是6個(gè)其他基因matK、clpP、cemA、accD、ccsA和infA。此外，對(duì)楞葉綠體基因組的內(nèi)含子進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)rpsl6、trnG-UCC、atpF、rpoC1、trnL-CAA、trnV-UAC、petB、petD、rpll6、rpl2、trnA-UGC、trnI-GAU和ndhA等基因中各包含1個(gè)內(nèi)含子，而clpP和ycf3基因則含有2個(gè)內(nèi)含子。此外，ndhB和rps12基因中存在反式剪接現(xiàn)象。

2.2 SSR特征分析

對(duì)楞葉綠體基因組進(jìn)行SSR分析，共檢測(cè)到127個(gè)符合預(yù)設(shè)條件的SSR（表3），其中大多數(shù)為單核苷酸SSR，共94個(gè)，約占總數(shù)的 74.02% ，其中A/T重復(fù)73個(gè)，C/G重復(fù)21個(gè)；二核苷酸SSR共19個(gè)，約占總數(shù)的 14.96% ，包含AG/CT和

AT/AT基因序列；三核苷酸SSR僅2個(gè)，約占總數(shù)的 1.57% ，包含AAG/CTT和AAT/ATT基因序列；四核苷酸SSR有12個(gè)，約占總數(shù)的 9.45% ，重復(fù)序列有5種類(lèi)型，包含AAAG/CTTT、AAAT/ATTT、AACC/GGTT、AGAT/ATCT、AGGG/CCCT。

2.3 密碼子堿基組成及偏好性分析

對(duì)秒葉綠體密碼子進(jìn)行分析所得的結(jié)果如表4所示，葉綠體基因編碼區(qū)包含21887個(gè)密碼子（不含終止密碼子），用于編碼20種已知氨基酸。其中，甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）各由單一密碼子編碼，其余氨基酸則由2至6種密碼子進(jìn)行編碼（圖2）。出現(xiàn)次數(shù)最高的氨基酸為亮氨酸（Leu），包含UUG、CUA、CUU、UUA、CUG、CUC，總數(shù)為2260個(gè)，約占總數(shù)的 10.33% 。其次是編碼絲氨酸（Ser）的密碼子UCC、UCG、UCU、AGU、UCA、AGC，總數(shù)為1862個(gè)，約占總數(shù)的 8.51% ，其中UCU使用頻率最高，達(dá)483個(gè)。半胱氨酸（Cys）的密碼子使用頻率最低，包括同義密碼子UGC和UGU，總計(jì)233個(gè)，其中UGC僅有73個(gè)。RSCU是衡量葉綠體基因組中密碼子使用偏好性的重要指標(biāo)，RSCU值等于1表示密碼子符合期望使用頻率，小于1.00表示使用頻率低于期望值，大于1.00表示使用頻率高于期望值（黃色彩等，2024）。本研究中共有30個(gè)密碼子的RSCU值大于1，其中28個(gè)以A或U結(jié)尾，僅2個(gè)以G或C結(jié)尾。使用頻率最高的密碼子為GCU，RSCU值達(dá)到1.78；最低的是AGC和GGC，RSCU值均為0.41。編碼Leu的CUA、編碼Met的AUG和編碼Trp的UGG的RSCU值為1，表明無(wú)偏好性。其余28個(gè)密碼子的RSCU值小于1，使用頻率較低。

Fig.2 Base composition of chloroplast protein encoding genes inA. spinulosa

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地了解紗楞的種屬親緣關(guān)系，將與屬、白紗楞屬、金毛狗屬共12個(gè)物種的葉綠體基因組序列構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。不同屬物種根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近聚類(lèi)在一起，12個(gè)物種可分為2類(lèi)。本研究的秒葉綠體基因組序列（PQ740943.1）與NCBI已公開(kāi)的秒葉綠體基因組序列（NC012818.1）聚在一個(gè)分支，支持率為100% ；屬其他物種如小葉楞（A.podophyl-la）、鋸齒秒（A.denticulata）等與秒楞親緣關(guān)系較近，其次為白屬（Sphaeropteris）；金毛狗屬（Cibotium）2個(gè)物種聚在另一個(gè)分支，且與秒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3討論

葉綠體是植物體內(nèi)自我復(fù)制和母系遺傳的特異性細(xì)胞器，具有完整獨(dú)立的基因組，分子量小、保守性強(qiáng)，常作為研究物種分類(lèi)和進(jìn)化的重要對(duì)象（DANIELLetal.，2016）。本研究通過(guò)Ilumina測(cè)序平臺(tái)，獲得秘的葉綠體基因組全長(zhǎng)為156196bp，總GC含量為 40.44% ，為典型的四分體結(jié)構(gòu)，由86313bp的LSC區(qū)、21623bp的SSC區(qū)和24130bp的IRs重復(fù)區(qū)組成，與NCBI已經(jīng)公布的葉綠體基因組（NC012818.1）基本結(jié)構(gòu)（GAOetal.，2009）相似，與已報(bào)道的大多數(shù)物種的葉綠體基因組特征（ZHANGetal.，2012）也相符。不同植物之間葉綠體的tRNA基因數(shù)目存在差異，如山楂（Crataegus pinnatifida Bunge）注釋到30個(gè)tRNA（崔英賢，2020），黑果枸杞（Lyciumruthenicum）注釋到36個(gè)tRNA（柳迪等，2024）。本研究共注釋到132個(gè)功能基因，包括89個(gè)蛋白編碼基因、35個(gè)tRNA基因和8個(gè)rRNA基因；而NC012818.1基因組注釋到117個(gè)功能基因，其中85個(gè)蛋白編碼基因、28個(gè)tRNA基因和4個(gè)rRNA基因（GAOetal.，2009）。SSR廣泛存在于動(dòng)植物中，由于在進(jìn)化過(guò)程中堿基容易錯(cuò)位（JANSENetal.，2011），因此被用于物種鑒定、遺傳多樣性分析等領(lǐng)域（QIetal.，2014）。在秒楞葉綠體基因組中檢測(cè)到127個(gè)SSR位點(diǎn)，多數(shù)為單核苷酸SSR，共94個(gè)（約占總數(shù)的 74.02% ），以A/T為主。

密碼子偏好性是在基因突變和物種進(jìn)化等多種因素影響下形成的，不同物種間密碼子的出現(xiàn)頻率不同（CHIAPELLOetal.，1998）。編碼葉綠體基因的密碼子共有21887個(gè)（終止密碼子除外），由61種密碼子編碼20種已知氨基酸。出現(xiàn)頻率最高的氨基酸為L(zhǎng)eu，總數(shù)為2260個(gè)，約占總數(shù)的 10.33% ，其次是編碼Ser的密碼子1862個(gè)，約占總數(shù)的 8.51% ，其中UCU的使用頻率最高；出現(xiàn)頻率最低的是Cys，共233個(gè)，其中UGC僅含73個(gè)，這一結(jié)果與大多數(shù)被子植物的相關(guān)研究結(jié)果一致（柳迪等，2024；陸葉等，2024）。RSCU值大于1的密碼子有30個(gè)，其中堿基構(gòu)成以A/U結(jié)尾的有28個(gè)，G/C結(jié)尾的為2個(gè)，表明葉綠體基因組的密碼子偏好以A/U結(jié)尾?；谌~綠體基因組序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，本研究的秒序列與NCBI上已公布的秒楞序列（NC012818.1）聚在一個(gè)分支，表明物種鑒別方法正確。另外，與小葉秘和鋸齒楞聚在一起，表明它們親緣關(guān)系較近。

4結(jié)論

本研究對(duì)秒葉綠體基因組的基本特征、遺傳特點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化位置進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與已公布的葉綠體基因組整體結(jié)構(gòu)相似，下一步可通過(guò)序列比對(duì)深入分析兩者在SNP、InDel等分子標(biāo)記上的差異，并可結(jié)合樣品地理位置、生境環(huán)境、表型差異等揭示秒種內(nèi)及種間進(jìn)化的分子特征，進(jìn)一步為秒楞屬植物物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究提供理論依據(jù)，為蕨類(lèi)植物的保護(hù)與研究提供參考。

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（責(zé)任編輯 謝紅輝）