阿卡斑病毒G1蛋白原核表達(dá)及其主要抗原結(jié)構(gòu)域的抗原性分析

Prokaryotic Expression of Gl Protein of Akabane Virus and Antigenicity Analysis of its Main Domain

YANG Qingl2，CAI Chang2，WEI XianXin， WEI ShanShan2， LU ChenYang2，

LIN Jun2， QIN ShaoMin2， CHEN FengLian2， WU JianMin2， OU ChangBo'， OU YANG Kangl*， MA Ling*

（'CollegeofAnimalScienceandTechnologyGuangxiUniversityNanning，Guangxi34，China；2Guangxi Veterinary Research Institute/ Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology/Key Laboratory of China

（Guangxi）-ASEAN Cross-Border Animal Disease Prevention and Control，Ministry of Agriculture and RuralAffairs，

Nanning，Guangxi 301，China；Binyang Center forAnimalDiseaseControlandPrevention，Nanning，Guangxi 530400， China）

Abstract： 【Objective】 Akabane（AKA） is a vector-borne infectious disease caused by Akabane virus（AKAV）， which mainly infects catle and sheep， and is one of the epidemic diseases that must be quarantined for imported cattle and sheep in China. The purpose of this study was to prepare the AKAV Gl protein and its polyclonal antibodies for analyzing the antigenicity of the main structural domain of Gl protein， and to provide the foundation for establishing the detection method of AKAV and analyzing biological function of AKAV G1. 【Method】 The recombinant AKAV G1 protein was expressed by a prokaryotic expression system through online bioinformatics analysis， and polyclonal antibodies were prepared using it as the immunogen. Immunogenicity of the G1 protein and the specificity of the polyclonal antibodies were detected by indirect ELISA， IFA， Western blot， and neutralization tests. Based on antigenic epitope analysis， G1b（Thr189-Val397） 0-0 was identified as the main antigenic structural domain of G1 protein， and Glb was expressed by eukaryotic expression system， and the antigenicity of G1b was verified by Western blot.【Result】 The target protein G1 was successfully expressed at about ， and the polyclonal antibody was prepared with a potency of and a neutralizing potency of 1：251.19 ，which showed good reactivity and neutralizing activity， and could specifically recognize the Gl protein. Western blot validation of the recombinant Glb protein showed that Glb protein could be specifically recognized by polyclonal antibody to G1 protein. 【Conclusion】 This study has successfully prepared the recombinant AKAV G1 protein with good expression and immunogenicity. The generated polyclonal antibodies have highly specificity， high potency and strong neutralizing activity， and the Glb protein has good antigenicity， which provides a basis for the establishment of AKAV detection methods and further exploration of AKAV infection and pathogenic mechanisms.

Keywords： Akabane virus； G1 protein； bioinformatics； polyclonal antibody； antigenicdomain

0 引言

【研究意義】阿卡斑病（Akabane，AKA）又稱赤羽病，是由阿卡斑病毒（Akabanevirus，AKAV）引起的一種主要感染牛、羊的蟲媒性傳染病，該病主要通過蚊和庫等媒介昆蟲在宿主動物間叮咬進(jìn)行傳播，妊娠期的牛、羊最易感病，感染后能引起流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、新生胎兒關(guān)節(jié)彎曲和積水性無腦綜合征等癥狀（馬玲等，2022）。除牛、羊外，AKAV也可以感染豬、雞、野牛、羚羊等多種家養(yǎng)和野生動物，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展以及野生動物安全，存在跨物種傳播的風(fēng)險，為《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》二類傳染病，是我國進(jìn)口牛、羊必檢的疫病之一（INOUEetal.，2024）。研究AKAV主要結(jié)構(gòu)蛋白的功能，對指導(dǎo)AKAV檢測方法建立、疫苗研制以及致病機(jī)制研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】AKAV屬于布尼亞病毒目（Bunyavi-rales）泛布尼亞病毒科（Peribunyaviridae）正布尼亞病毒屬（Orthobunyaviruses）辛波血清群，為分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，有3個節(jié)段，分別為S、M、L基因節(jié)段。S節(jié)段高度保守，編碼核衣殼蛋白（N）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSs）；M節(jié)段高度變異，編碼病毒囊膜糖蛋白（G1、G2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NSm）；L節(jié)段編碼RNA依賴的RNA聚合酶，具有復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活性。M節(jié)段約 ，編碼高甘露糖型GP前體，可被宿主蛋白酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔切割，形成G1、G2和NSm蛋白，其中G1蛋白參與構(gòu)成AKAV纖突，具有型特異性，參與病毒附著于哺乳動物細(xì)胞的過程，是病毒重要的毒力因子，同時G1蛋白包含了中和抗原表位決定簇，具有強(qiáng)烈的免疫原性，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性的體液免疫以及具有保護(hù)性的中和抗體（陳冬杰等，2024；蔡暢等，2024；李運(yùn)娜等，2024）。G1具有至少5個抗原結(jié)構(gòu)域（A、B、C、D、E），其中A、C抗原結(jié)構(gòu)域各有2個抗原表位（AKASHIetal.，1997）。【本研究切入點(diǎn)】目前國內(nèi)并無對AKAV的有效防治方法，囊膜糖蛋白G1具有重要作用，但G1蛋白由936個氨基酸組成，分子量較大不易表達(dá)，目前關(guān)于AKAV抗原表位的研究也較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對G1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組G1蛋白，進(jìn)而制備多克隆抗體，同時根據(jù)抗原表位分析結(jié)果，真核表達(dá)具有天然結(jié)構(gòu)的G1b（Thr189-Val397）抗原結(jié)構(gòu)域，進(jìn)行抗原性分析，旨在為建立AKAV檢測方法以及研究AKAVG1蛋白生物學(xué)功能，深入探索AKAV感染和致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、病毒和血清

Vero細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、293T細(xì)胞、新型AKAV毒株（GXLCH16-70）、AKAV陽性血清由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所畜禽疫病專家診治中心（下稱“本實(shí)驗室”）保存；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；新西蘭大白兔購自南寧市研誠生物科技有限公司；Endo-FreePlasmidMidiKit購自O(shè)mega 公司；FastPure EndoFree Plasmid MiniKit-BOX2購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；NheI、XhoI、BamHI內(nèi)切酶、兔抗 6× His多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔IgG、異丙基 ？β -D-硫代半乳糖苷（isopropyl β -D-1-thioga-lactopyranoside，IPTG）、磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）、碳酸鹽緩沖溶液（carbon-atebuffersolution，CBS）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA）、3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-Tetramethylbenzidine，TMB）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma-Al-drich公司。

1.2AKAVG1蛋白氨基酸序列特征分析

通過多種在線工具，對新型AKAVM基因序列（GenBank登錄號：KY381280.1）進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分別通過Protparam（https：//web.ex-pasy.org/protparam/）、ProtScale（https：//web.ex-pasy.org/protscale/）、NetPhos-3.1（https： //services.healthtech.dtu. dk / service.php？ NetPhos-3.1）、TMHMM2.0（https： //services.healthtech.dtu.dk /services.php？TMHMM-2.0）、SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk / services / SignalP-4.1/）、IEDB （http： /imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl）預(yù)測AKAVG1蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽以及抗原表位。

1.3重組AKAVG1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及可溶性分析

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成去除了跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)域的G1基因片段，同時進(jìn)行密碼子優(yōu)化，構(gòu)建pET-30a-G1質(zhì)粒。篩選IPTG誘導(dǎo)濃度（0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2mmol/L）和誘導(dǎo)時間（0、2、4、6、8、10、18、 24h） ，通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組AKAVN蛋白；用 $0.01＼mathrm{＼mol/L}$ PBS（pH7.4）重懸菌體并超聲破碎，收集上清液和沉淀物，通過SDS-PAGE判斷重組蛋白可溶性。經(jīng)Ni柱純化后，獲得純化重組AKAVG1蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE、Westernblot鑒定。

1.4重組AKAVG1蛋白表達(dá)、純化及鑒定

用含有 6mol/L 鹽酸胍的包涵體溶解液處理包涵體，經(jīng)Ni柱純化后，進(jìn)行復(fù)性，使用 $30＼mathrm{＼kDa}$ 超濾離心管濃縮復(fù)性蛋白。最后使用 透析袋，將重組AKAVG1蛋白溶解緩沖液置換成PBS，測定蛋白濃度并進(jìn)行Westernblot鑒定。

1.5AKAVG1多克隆抗體制備及鑒定

取復(fù)性的重組AKAVG1蛋白與等量的弗氏完全佐劑混合乳化均勻后，按照 （只·次）采用肌肉多點(diǎn)注射免疫新西蘭大白兔，同時設(shè)PBS免疫組為對照；首次免疫后選擇弗氏不完全佐劑乳化重組G1蛋白，在第14d、28d進(jìn)行第2次、第3次免疫，免疫劑量和免疫途徑與首次免疫相同。第3次免疫后14d通過頸動脈采血、分離血清，通過間接ELISA、IFA、Westernblot和中和試驗評價多克隆抗體特異性和效價。

1.5.1 間接ELISA鑒定

用 0.05mol/LCBS（ ）將純化的重組AKAVG1蛋白稀釋到 0.2～mL，按 100uL孔 包被過夜，用 1% BSA 封閉 ，將待檢血清及陰性血清分別以 1：500 倍進(jìn)行倍比稀釋，每個樣品設(shè)2個重復(fù)， 反應(yīng) ，加入 100～uL1：10000 稀釋的HRP-山羊抗兔IgG， 反應(yīng)45min ，加入TMB避光顯色 10min 后，終止反應(yīng)，測定各孔在 處的OD值。

1.5.2 IFA鑒定

用GXLCH16-70毒株感染BHK-21細(xì)胞，并同時設(shè)正常細(xì)胞為陰性對照， 后棄上清液，用4% 多聚甲醛固定后，用 0.5% TritionX-100反應(yīng)15 ，然后用 1% BSA封閉，分別按 1：50 稀釋AKAVG1多克隆抗體和陰性血清， 孵育90 ，以 1：100 稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG， 孵育 ，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.3 Westernblot鑒定

將純化的GXLCH16-70毒株進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，先后經(jīng)抗AKAVG1蛋白多克隆抗體 （1：1000） 、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1：5000）孵育，進(jìn)行Westernblot分析。

1.5.4中和效價測定

培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞單層，待長至 80% ，采用固定病毒稀釋血清法測定多克隆抗體中和效價，將血清以2倍比稀釋，每一稀釋度設(shè)4個重復(fù)與200 的AKAV等體積混合，在 下孵育 0然后將病毒一抗體混合物加入到96孔板的BHK-21細(xì)胞中，并在 、 5% 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 后，記錄每組出現(xiàn)CPE的細(xì)胞孔數(shù)，按Reed-Muench法計算該血清的中和效價。

1.6重組AKAVG1b真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)G1蛋白（Thr189-Val397）涵蓋9個AKAVG1基因抗原表位的片段。由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成特異性引物，AKAVG1b/F：5'-CGCGGATCCATGTCATTGCAT-GTCCTAAATAAG-3'；AKAVG1b/R：5'-CCGCTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAGGGTAGCAATCTACATCG-3'，以GXLCH16-70毒株cD-NA為模板擴(kuò)增目的片段G1b（Thr189-Val397）。純化PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1/Hygro（+）載體連接，鑒定后，命名為pcDNA3.1-G1b。

1.7重組AKAVG1b真核表達(dá)及鑒定

按照去除內(nèi)毒素的質(zhì)粒大提試劑盒說明書，抽提重組質(zhì)粒pcDNA3.1-G1b，測定核酸濃度，按照LipofectamineM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)。 培養(yǎng) 后，收集細(xì)胞上清液和沉淀物，分別使用 6× His多克隆抗體、AKAV陽性血清進(jìn)行Westernblot分析，鑒定重組蛋白抗原性。

2 結(jié)果與分析

2.1AKAVG1蛋白生物信息學(xué)分析

G1蛋白由936個氨基酸組成，相對分子量為 ，是等電點(diǎn)為8.42的堿性蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)35.17，平均親水性指數(shù)為-0.249，表明是一種穩(wěn)定的親水蛋白（表1、圖1A）。通過Net-Phos-3.1、TMHMM2.0、SignalP-5.0分析，顯示G1蛋白不含信號肽，推測為非分泌蛋白；存在一個跨膜螺旋，1-888aa位于膜外側(cè)，在889-911 aa、912-936aa分別為跨膜螺旋和膜內(nèi)區(qū)域，推測G1蛋白可能是一種非分泌的跨膜蛋白（圖1B-C）；此外，G1蛋白有102個磷酸化修飾位點(diǎn)，包括35個蘇氨酸稀釋位點(diǎn)、48個絲氨酸修飾位點(diǎn)和19個酪氨酸修飾位點(diǎn)（圖1D）。

2.2AKAVG1蛋白抗原表位及預(yù)測

通過DNAStar軟件和在線工具IEDB分別對G1氨基酸序列進(jìn)行親和力分析和抗原表位預(yù)測，結(jié)果顯示G1蛋白有37個B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，蛋白的抗原表位區(qū)域與親水區(qū)、表面可及區(qū)大致相同，發(fā)現(xiàn)G1蛋白（Thr189-Val397）涵蓋9個

AKAVG1基因抗原表位的片段（圖2）。由于G1蛋白分子量較大且存在跨膜結(jié)構(gòu)域，因此挑選抗原性較高的區(qū)域，同時保留兩端 螺旋、 β 折疊或無規(guī)則卷曲，即將G1蛋白第 位氨基酸的截短區(qū)域進(jìn)行真核表達(dá)，并分析其抗原性。

2.3重組AKAVG1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-G1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，優(yōu)化重組AKAVG1誘導(dǎo)表達(dá)條件，發(fā)現(xiàn)在IPTG濃度為 0.25mmol/L

誘導(dǎo) 時，在 101.1kDa 處可見與預(yù)計相符的條帶，表達(dá)量最高（圖3）；目的蛋白主要存在于菌體破碎沉淀物中，以包涵體形式表達(dá)（圖4）。

Fig.3 Optimization of induced expression conditions for the recombinant G1 fusion protein

A：不同誘導(dǎo)時間的產(chǎn)物（M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1＼～8：pET-30a-G1誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10、18、24h產(chǎn)物）；B：不同誘導(dǎo)濃度的產(chǎn)物（9：pET-30a-G1未誘導(dǎo)；10＼～16：pET-30a-G1使用0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)6h產(chǎn)物）

A：productsinducedfordifferenttimes（Mproteinarker；＼～8proctsnducedbypE-aGfor，46，80h）；

B：productsunderdiffrentinductionconcentrations（9：notinducedbypET-30aG1；0＼～16：pET-30a-GlinducedbyIPTGof0，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0mmol/L for 6h）

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：G1融合蛋白表達(dá)菌破碎前；2：G1蛋白表達(dá)菌破碎上清液；3：G1蛋白表達(dá)菌破碎沉淀物M：proteinmarker；1：Glfusionproteinexpressonbacteriabeforecrushing；2supernatantafterGlproteinexpressionbacteriacrushing； 3： precipitate after G1 protein expression bacteria crushing

2.4重組AKAVG1蛋白的純化及鑒定

根據(jù)優(yōu)化的誘導(dǎo)條件，大量表達(dá)重組AKAVG1蛋白。重組蛋白經(jīng)純化、復(fù)性、超濾及透析后，進(jìn)行Westernblot鑒定，結(jié)果顯示純化的重組AKAVG1蛋白可以分別與兔抗 多克隆抗體（圖5A）、AKAV陽性血清反應(yīng)（圖5B），說明該蛋白有較好的反應(yīng)性。使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定純化濃縮后的G1蛋白濃度為 $0.425＼mathrm{＼mg/mL}$ ，可用于免疫動物制備多克隆抗體。

A： 標(biāo)簽抗體鑒定（M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1： 標(biāo)簽抗體鑒定純化后G1蛋白）；B：AKAV陽性血清鑒定（M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；2：AKAV陽性血清鑒定純化后G1蛋白）

A： 6× His tag antibody identification （M： protein molecular quality standard； 1： purified G1 protein identified by tag antibody）；B：AKAV-postiveserumdentification（M：proteinmolecularqualitystandardpurifiedG1proteinidentifiedbyAKAVpositive serum）

2.5AKAVG1蛋白多克隆抗體制備及鑒定

以純化的重組AKAVG1蛋白作為免疫原，免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體。通過間接ELISA測定抗體效價達(dá) 1：512000 （圖6A），說明重組蛋白具有較好的免疫原性、多克隆抗體具有較高效價。IFA和Westernblot結(jié)果證實(shí)，AKAVG1多克隆抗體可與AKAVGXLCH16-70毒株發(fā)生特異性反應(yīng)，分別出現(xiàn)與預(yù)計一致的 條帶和特異性的綠色熒光（圖6B、C），證實(shí)制備的AKAVG1多克隆抗體能夠特異性識別AKAV。

A：G1多克隆抗體血清效價測定；B：Westernblot鑒定；C：IFA鑒定

A：G1 polyclonalantibody serum potency assay；B：Western blot identification； C：IFA identification

采用固定病毒一稀釋抗血清法對本實(shí)驗制備的AKAVG1重組蛋白的兔源多克隆抗體進(jìn)行中和效價測定，結(jié)果如表2所示：該抗體中和效價為1：251.19，AKAVG1多克隆抗體具有體外中和活性。

2.6重組AKAVG1b蛋白真核表達(dá)及鑒定

構(gòu)建pcDNA3.1-G1b真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)鑒定后（圖7），轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞表達(dá)。經(jīng)Ni柱純化后，通過SDS-PAGE分析，獲得較純的重組AKAVG1b（Thr189-Val397）蛋白（圖8A）。Westernblot鑒定顯示濃縮后的重組AKAVG1b蛋白可以分別與兔抗 6×His 多克隆抗體、AKAVG1多克隆抗體、AKAV陽性血清反應(yīng)，在 處均可見與預(yù)計相符的單一條帶（圖8B-D），說明該重組蛋白具有良好的抗原性。

A：G1b目的片段擴(kuò)增（M：DNA marker 2000；1＼～2：G1b；3：陰性）；B：重組質(zhì)粒雙酶切鑒定（M：DNA marker 2000；1：pcDNA3.1-G1b雙酶切）

A：amplificationoftheGlbtargetfragment（M：DNAmarker200；1＼～2：Glb；3，negative）；B：doubleenzymedigestionoftherecombinant plasmid（M，DNA marker 5000； 1： pcDNA3.1-G1b double digestion）

A：純化重組AKAV G1b蛋白SDS-PAGE 分析（M：蛋白 marker；1：pcDNA3.1空載；2：G1b蛋白）；B：His 標(biāo)簽抗體WB 驗證（M：蛋白marker；1：Glb蛋白；2：AKAV全病毒）；C：G1多克隆抗體驗證（M：蛋白 marker；1：G1b蛋白）；D：AKAV陽性血清WB驗證（M：蛋白marker；1：G1b蛋白；2：AKAV全病毒）

A：SDS-PAGE analysis ofpurifiedrecombinantAKAVGlb protein（M：protein marker；1：pcDNA31empty vector；2：Glb pro-

tein）；B：WBverificationwithHis agantibody（M：protein marker；1：Glbprotein；2：AKAVwholevirus）；C：Glpolyclonalantibody verification（M：protein marker； 1： G1b protein）；D：WB validation of AKAV positive serum（M： protein marker；1：Glb protein； 2：whole AKAV）

3 討論

AKA作為一種蟲媒病，廣泛流行于全球溫帶、熱帶地區(qū)，我國在該病的流行區(qū)域內(nèi)，目前全國28個?。ㄊ?、自治區(qū)）檢出該?。╓ANGetal.，2017）。AKA傳播性強(qiáng)、危害大，曾給日本、韓國和澳大利亞的牛、羊產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來在我國華南、西南、東北、西北地區(qū)陸續(xù)發(fā)生AKA病例，相繼在內(nèi)蒙古和貴州分離出國內(nèi)首株AKAVIb亞型和Ⅱ型毒株，并在廣西邊境地區(qū)的蚊蟲中檢出AKAV，說明我國AKAV流行日趨復(fù)雜，并存在跨區(qū)域傳播的風(fēng)險（TANGetal.，2017；宋頌，2018；朱沛等，2021；章凡等，2022；鮑顯偉等，2023；ZANetal.，2023；貴州省動物疫病預(yù)防控制中心等，2024）。目前，尚無針對該病的有效治療方法，一旦發(fā)病，往往會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，危害我國家養(yǎng)和野生動物安全，因此亟需開展針對AKAV的研究。

AKAVG1蛋白由936個氨基酸組成，為囊膜糖蛋白，具有型特異性，在病毒的附著哺乳動物細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，G1和G2糖蛋白共同組成病毒表面突起，G2位于基部，G1三聚體位于頂部，形成免疫結(jié)構(gòu)域，可以與B細(xì)胞受體結(jié)合，刺激B細(xì)胞產(chǎn)生體液免疫，從而強(qiáng)烈誘導(dǎo)宿主特異性免疫反應(yīng)（何凱鋒等，2023；陳赫威，2023）。由于AKAVG1蛋白天然形式的糖基化程度較高，徐樹蘭等（2008）使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)了重組AKAVG1蛋白，目前尚無通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該蛋白的報道。本研究采用多種生物信息學(xué)分析軟件，系統(tǒng)分析AKAVG1蛋白理化特性、結(jié)構(gòu)、功能及抗原表位等，結(jié)果顯示AKAVG1蛋白是一種穩(wěn)定的親水蛋白，有102個磷酸化修飾位點(diǎn)，無信號肽，有跨膜螺旋，是一種非分泌的跨膜蛋白，推測該蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中主要以包涵體形式存在。由于蛋白跨膜結(jié)構(gòu)不利于蛋白表達(dá)及抗體識別，本研究在構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒時去除跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)域，并對誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)IPTG濃度為 $0.25＼mathrm{＼mmol/L}$ 誘導(dǎo) 蛋白大量表達(dá)，獲得重組AKAVG1蛋白包涵體，與預(yù)測結(jié)果一致。本研究選用變性能力更強(qiáng)的 6mol/L 鹽酸胍溶解，獲得可溶性蛋白。在純化可溶性蛋白時，常規(guī)的方法是通過透析逐漸降低變性劑濃度，但使用該方法純化重組AKAVG1蛋白極易產(chǎn)生沉淀，因此本研究采用稀釋復(fù)性后超濾濃縮的純化方式，可以較好地控制復(fù)性過程中變性劑的去除速度，減少蛋白質(zhì)聚集，獲得了純化的可溶性重組AKAVG1蛋白。隨后，以該蛋白為免疫原，成功制備了效價較高的多克隆抗體，該抗體可以分別與AKAV毒株、重組AKAVG1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，并具有較好的中和活性，說明本研究表達(dá)的重組AKAVG1蛋白具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，制備的多克隆抗體可以識別天然病毒。國內(nèi)目前尚無AKAV的商品化診斷試劑盒，G1蛋白有望成為ELISA、免疫熒光（IFA）或膠體金試紙條等檢測技術(shù)的理想靶標(biāo)抗原。

已有研究證實(shí)，AKAVG1蛋白包含至少5個抗原結(jié)構(gòu)域、9個抗原表位（AKASHIandIN-ABA，1997）。OGAWA等（2022）利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)一系列截短的AKAVG1蛋白，通過Dotblot和中和試驗，篩選可以與9株單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的重組AKAVG1蛋白，發(fā)現(xiàn)其中1株單克隆抗體可以與G1N端截短蛋白反應(yīng)、4株單克隆抗體可以與中部截短蛋白反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)位于N端的1-97aa和中部的189-397aa包含抗原表位，以這2個截短蛋白免疫小鼠，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體。胡世享等（2023）通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)AKAVG1189-397aa，并證實(shí)該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。本研究通過分析抗原表位發(fā)現(xiàn)，AKAVG1蛋白有37個B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位，其中9個位于189-397aa，該肽段含有208個氨基酸、多個潛在磷酸化位點(diǎn)、 β -折疊和無規(guī)則卷曲，為優(yōu)勢抗原肽段（陳虎等，2024）。選取該片段通過真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，且為分泌表達(dá)，獲得的重組AKAVG1b蛋白與兔抗 6×His 多克隆抗體、AKAVG1多抗血清、陽性血清均發(fā)生特異性反應(yīng)，表明重組蛋白具有較好的抗原性（王彩霞等，2024）。本研究與上述研究結(jié)果一致，共同證實(shí)AKAVG1189-397aa中存在AKAV抗原表位。AKAV的N蛋白或G1蛋白的穩(wěn)定性較好，在多數(shù)病毒中同源性更高，普遍應(yīng)用N蛋白或G1蛋白作為赤羽病疫苗開發(fā)的靶標(biāo)抗原。重組AKAVG1b蛋白與G1蛋白相比，蛋白小且為分泌表達(dá)，蛋白質(zhì)不僅具有天然構(gòu)象和生物活性，還易于純化。相比原核系統(tǒng)，真核系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)糖基化模式與人類細(xì)胞相似，更少引起免疫反應(yīng)，且蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，適合作為重組亞單位疫苗的核心抗原和檢測方法的開發(fā)。

4結(jié)論

本研究成功獲得表達(dá)良好且具有較好的免疫原性的重組AKAVG1蛋白以及特異性強(qiáng)、效價高、具有較高中和活性的多克隆抗體，同時證實(shí)G1b具有抗原性，為進(jìn)一步建立AKAV檢測方法，深入探索AKAV感染和致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 謝紅輝）