秒轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析

Transcriptome Sequencing and Bioinformatics Analysis of Alsophila spinulosa

SHI YunLi'， YANG KaiBo'， LI QiJin'，HE QiuLan2，LIANG ShengHua2， CHEN JianHong2 HUANG HongBao2， HUANG YaoHeng2* （'Engineering Construction Management Branch of the China Southern Power Grid Peak and Frequency Modulation Power Generation Co.，Ltd.， Guangzhou， Guangdong 510510， China； 2 Guangxi Key Laboratory of Special NonWood Forest Cultivationamp;Utilization，Guangxi Laboratory ofForestry/GuangxiForestry Research Institute，Nanning， Guangxi 530002， China；）

Abstract： 【Objective】As an ancient fern species existed from ancient time， Alsophila spinulosa has important ecological and economic value. This study aimed to reveal the gene expression characteristics of A. spinulosa through transcriptome sequencing， thereby providing a theoretical basis for its molecular breeding and functional research.【Method】In this study， high-throughput transcriptome sequencing and bioinformatics techniques were used to obtain the unigenes sequences of A. spinulosa.After data cleaning and quality control， the Trinity software was used for assembly，followed by annotation through comparison with five databases：NR， KOG， SwissProt， GO， and KEGG.Additionally， potential molecular markers were identified through SSR analysis.【Result】A total of 46 664 870 raw reads were obtained through transcriptome sequencing， and 43 877 810 clean reads were retained after filtering， accounting for 94% of the raw reads. The Q30 base distribution reached 96.65% ， and the GC content was 47.35% . 35 359 unigenes were assembled after redundancy removal， withatotallength of41138 988 bp.The longest unigenes was 15 891 bp， and the N50 was 1555 bp. The annotation results showed that the highest number of unigenes 26 213， 74.13% were matched to the NR database， with the highest homology to Adiantum capillus-veneris. In KOG， SwissProt，GO and KEGG，17 166（ 48.55% ，18208（ 51.49% ，12247（ 34.64% ，and9063（ 25.63% ） unigenes were annotated， respectively. 5 341 unigenes were annotated in all databases， accounting for approximately 15.11% . Furthermore， a total of 8 996 SSR loci were detected. 1 346 were single nucleotide repeats， accounting for approximately 14.96% ，among which A/T were the most. In dinucleotide repeats， most were AG/CT （3 405）， accounting for approximately 37.85% . The types of trinucleotide repeats were the most， mainly including AAG/CTT（526） and AGC/CTG（478）.【Conclusion】Through transcriptome sequencing and bioinformatics analysis， this study unvealed the gene function and metabolic network of A. spinulosa， providing a foundation for further investigation of functional genes， genetic diversity， and molecular markers.

Keywords： Alsophila spinulosa； transcriptome； bioinformatics； gene annotation； SSR

0 引言

【研究意義】秒楞（Alsophilaspinulosa）又名刺紗，是楞科（Cyathenaceae）秒屬（Al-sophila）的重要代表植物。作為現(xiàn)存唯一的樹形蕨類植物，被譽為“活化石”，并被列為國家二級保護野生植物（宗秀虹等，2016；廖阿慶，2024），具有重要的生態(tài)價值。秘的生態(tài)地位使其成為珍稀物種，但由于過度采伐，秘的生存面臨威脅，部分地區(qū)已瀕臨滅絕（RANILetal.，2017）。此外，秒楞株形美觀，莖蒼葉秀，髓可入藥，具有一定的觀賞價值和藥用價值（范劍明等，2023），因此其生態(tài)保護和利用具有重要的科學(xué)意義。研究秒轉(zhuǎn)錄組和相關(guān)生物學(xué)信息，有助于提高秒楞的種植、保護及其藥用開發(fā)的潛力。【前人研究進展】隨著新一代測序技術(shù)（NGS）的發(fā)展，RNA-Seq作為一種高效、可行的研究方法，已被廣泛應(yīng)用于植物的基因表達譜分析（王悅等，2022）。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物研究領(lǐng)域的應(yīng)用較早且深入，無論是在木本植物還是草本植物中均有所成就。JU等（2018）和CHENG等（2024）分別分析了紫薇（Lagerstroemiaindica）和錦繡杜鵑（Rhododen-dronpulchrum）的轉(zhuǎn)錄組信息，分析了細胞模式調(diào)控的差異表達基因（differential expressed genes，DEGS），并在轉(zhuǎn)錄水平評估了這些基因之間的調(diào)控關(guān)系。LI等（2020）通過比較菠菜（Spinaciaolera-cea）雄花和雌花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對其可變剪接、可變多聚腺苷酸化及長鏈非編碼RNA進行了綜合分析，探索了菠菜的性別分化機制，為菠菜的功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)已成為獲取基因序列的重要方法，對于揭示生物系統(tǒng)的遺傳網(wǎng)絡(luò)、挖掘候選基因以及進行功能鑒定等生物學(xué)研究至關(guān)重要（李健玲等，2023；夏銘澤等，2024）。蕨類植物擁有超過10000種現(xiàn)存物種，是無種子維管植物中種類最豐富的群體（SMITHetal.，2006）。水蕨（Ceratopteristhalictroides）為一年生水生或濕生的同型孢子蕨類植物，通過比較海南島的3個水蕨種群和邢氏水蕨的葉綠體基因rbcL序列，發(fā)現(xiàn)海南島的3個水蕨種群為南方型水蕨，同時為邢氏水蕨的分類提供了佐證（董元火等，2024）。秒楞一直受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，過去的研究主要集中在秒的群落學(xué)、繁育栽培以及化學(xué)藥理等方面，探索其生長環(huán)境、繁殖特性和藥用成分等（袁守良和白小節(jié)，2005；何琴琴，2011；侯夢丹等，2023；王文沛等，2023）。近期，在秒植物生理生化方面的研究已有相關(guān)報道，如對秒楞幼苗在干旱脅迫下的生理反應(yīng)（呂朝燕等，2023）以及不同光照強度下葉片性狀和光合作用特性的變化（劉雯雯等，2024）進行了研究?！颈狙芯壳腥朦c】目前，關(guān)于秒楞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究仍較為有限，尤其是分子調(diào)控機制尚未得到深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用RNA-Seq技術(shù)，采用生物信息學(xué)方法對秒楞葉片的轉(zhuǎn)錄組進行分析，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)探究秒的基因表達，旨在探討秒楞的分子調(diào)控機制，為秘的分子育種和藥用價值挖掘提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2024年10月，在廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西林科院那坨苗圃中采集植株生長健壯、無病蟲害的秒楞葉片作為轉(zhuǎn)錄組測序樣品。采集的葉片立即放入液氮中進行快速冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至一 冰箱中保存以備后續(xù)使用。

1.2秒RNA提取及文庫構(gòu)建

使用TRIzol法提取每個秒楞樣品的總RNA。采用Agilent2100生物分析儀對每個樣品的總RNA的質(zhì)量進行檢測，并使用NanoDrop-2000定量。采用 Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit （Illumi-na，美國）試劑盒構(gòu)建文庫，將含有Oligo（dT）的磁珠富集帶有polyA尾巴的真核mRNA后，利用超聲波打斷。以打斷的mRNA為模板，加入隨機寡核苷酸，在逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈。然后用RNaseH降解RNA鏈，再通過DNA聚合酶和dNTPs合成第二條鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)過純化、末端修復(fù)、加A尾、連接測序接頭后，用AMPureXP磁珠篩選出約200bp的cDNA片段，進行PCR擴增并再次純化，最終得到測序文庫。

1.3轉(zhuǎn)錄組測序及拼接組裝

利用IlluminaNovaSeq 6000測序平臺對秒葉片轉(zhuǎn)錄組文庫進行測序。在測序的flowcell中加入4種帶熒光標(biāo)記的dNTP、DNA聚合酶和接頭引物進行擴增。每當(dāng)一個熒光標(biāo)記的dNTP被加入延伸的互補鏈中時，就會釋放出對應(yīng)的熒光信號。測序儀通過捕獲這些熒光信號，并利用計算機軟件將光信號轉(zhuǎn)化為測序峰，從而解析出待測片段的序列信息，稱之為rawreads或rawdata。使用Trimmomaticv0.36對原始配對末端reads進行修剪和質(zhì)量控制，獲得clean reads。然后用Trinityv2.8.6軟件對所有的干凈數(shù)據(jù)進行denovo組裝，之后再利用CD-HIT軟件聚類去冗余得到最終的unigenes序列文件。

1.4Unigenes功能注釋

使用Diamondv0.9.22.123軟件在NR數(shù)據(jù)庫、KOG數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫和SwissProt數(shù)據(jù)庫進行比對，利用eggNOG-mapperv5.0進行GO數(shù)據(jù)庫的注釋。取e-value 的注釋，篩選具有序列相似性最高的蛋白，從而獲得unigenes序列的功能注釋信息。

1.5 SSR分析

使用BWA和Samtools軟件將高質(zhì)量測序reads與unigenes序列比對。用MicroSatellite對基因轉(zhuǎn)錄本進行SSR位點的檢測，對應(yīng)的各重復(fù)類型最少重復(fù)次數(shù)為兩堿基6次，三堿基、四堿基、五堿基和六堿基分別為5次，并對SSR的發(fā)生頻率、基元類型、基元長度和基元重復(fù)次數(shù)進行分析。使用MISA軟件識別SSR位點并進行引物設(shè)計。

2 結(jié)果與分析

2.1秒楞轉(zhuǎn)錄組測序及組裝

秘楞葉片經(jīng)過RNA提取，cDNA文庫的構(gòu)建之后，對其進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得46664870條raw reads，共計 。通過過濾reads中的接頭序列、質(zhì)量較低的堿基以及短序列后，得到43877810條cleanreads，占rawreads的94% ，總長度為 。其中Q20basesratio高達 98.74% ，Q30basesratio高達 96.65% ，GC含量為 47.35% 。結(jié)果表明獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

由于秒楞沒有參考基因組，使用Trinity軟件對獲得的所有cleandata進行從頭組裝。去余后共獲得35359條unigenes，總長41138988bp。最長的unigenes為 ，平均長度為1163.47bp，N50為 。unigenes的N50值大于平均值，表明秘轉(zhuǎn)錄組的測序深度大，拼接效果較好。將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量序列與拼接序列進行比對，比對率達到 92.76% ，再次表明組裝效果較好。35359條unigenes中，長度為 的數(shù)量最多，達到8876條，占比約 25.1% ；長度為

的數(shù)量最少，僅為11條，占比約0.03% （圖1）。

2.2秒轉(zhuǎn)錄組注釋

將秒組裝后的unigenes序列與五大常見數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果如圖2所示。其中，注釋到NR數(shù)據(jù)庫的unigenes數(shù)量最多，為26213條，占比約74.13% ；注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的unigenes數(shù)量為17166條，占比 48.55% ；KEGG數(shù)據(jù)庫被注釋到的unigenes最少，為9063條，占比約 25.63% 。此外，至少在一個數(shù)據(jù)庫中注釋成功的unigenes數(shù)量為26253條，約占總基因數(shù)的 74.25% ；而在所有數(shù)據(jù)庫中均注釋成功的基因數(shù)量為5341條，約占總基因數(shù)的 15.11% 。

2.3 NR數(shù)據(jù)庫

將得到的序列與NCBI的數(shù)據(jù)庫（NR庫）進行比較，可以獲得unigenes序列與相近物種的匹配情況。由圖3可知，與紗轉(zhuǎn)錄組序列同源性最高的物種是鐵線蕨（Adiantumcapillus-veneris），達到11512條，約占匹配到序列總數(shù)的 43.92% 其次是蓮葉鐵線蕨（Adiantumnelumboides），為8841條，約占 33.73% ；排名第三的為水蕨（Ceratopter-isrichardii），比對到2981條，占比約 11.37% ；另外在扁枝石松（Diphasiastrumcomplanatum）、日本柳杉（Cryptomeriajaponica）、寬葉卷柏（Selag-inellamoellendorffii）、紅豆杉（Taxuschinensis）、地錢（Marchantiapolymorpha）、馬毛大葉蘚（Sphagnummagellanicum）、泥炭蘚（Sphagnumfallax）分別比對到699、148、99、90、86、75、73條，占比約為 2.67% 、 0.56% 、 0.38% 、 0.34% ，0.33% 、 0.29% 、 0.28% 。

2.4 KOG數(shù)據(jù)庫

為了進一步探索秒楞轉(zhuǎn)錄組中基因的功能特性，利用KOG數(shù)據(jù)庫對注釋到的17166條unigenes進行了功能分類，共劃分為25個功能類別，如圖4所示。從分類結(jié)果來看，功能類別中unigenes數(shù)量最多的是次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝（Secondary metabolites biosynthesis， transportandcatabolism，Q），包含2687條基因。其次是脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝（Lipidtransport and metabolism，I），為2675條。功能未知（Functionunknown，S）

排名第三（2496條），表明轉(zhuǎn)錄組中仍然存在大量功能尚未明確的基因，這為后續(xù)功能研究提供了潛在的研究方向。轉(zhuǎn)錄后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋 白（Posttranscriptional modification，pro-tein turnover，chaperones，O）、信號傳導(dǎo)機制（Sig-nal transductionmechanisms，T），和轉(zhuǎn)錄（Tran-scription，K）的unigenes數(shù)量分別為1840、1653和1072條，顯示了秒在遺傳信息表達及能量代謝方面的活躍性。

2.5 GO注釋

對秒轉(zhuǎn)錄組unigenes進行GO功能注釋，共注釋到12247條unigenes，分為分子功能（molec-ular function，MF）、生物過程（biologicalprocess，BP）和細胞組分（cellularcomponent，CC）三大類和41個亞類（圖5）。在第一大類BP中，共含有24個亞類，其中細胞過程（cellularprocess）注釋到的unigenes數(shù)量最多，而碳利用（carbonutiliza-tion）、氮利用（nitrogenutilization）、生物黏附（biologicaladhesion）和生物礦化（biomineraliza-tion）中注釋到的數(shù)量少；在第二大類MF中，注釋到14個亞類，其中催化活性（catalytic activity）和結(jié)合因子（binding）的unigenes數(shù)量最多，而蛋白標(biāo)簽（proteintag）、營養(yǎng)儲存活性（nutrient res-ervoiractivity）和小分子傳感器活性（smallmolec-ular sensor activity）的unigenes數(shù)量少；在第三大類CC中，僅注釋到3個亞類，其中細胞解剖學(xué)實體（cellular anatomical entity）的unigenes最多，而蛋白復(fù)合體（protein-containingcomplex）的unigenes數(shù)量最少。

2.6 KEGG通路分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對秘的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行注釋和功能分析，進一步揭示其生物學(xué)過程中的代謝路徑和基因功能分布情況。結(jié)果表明，注釋到的基因主要分布于五大功能分類系統(tǒng)，包括代謝過程、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞過程、有機系統(tǒng)（圖6）。第一大系統(tǒng)代謝過程包含11個亞類，共9582條unigenes，其中全球及概覽地圖（Globalandoverviewmaps）相關(guān)unigenes最多（5473條），約占總數(shù)的 40% 以上；此外，氨基酸代謝（Aminoacidmetabolism）、碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）和脂質(zhì)代謝（Lipidmetabolism）的unigenes也占據(jù)了顯著比例，分別為629、1104、561條，共占約 17.40% 。第二大系統(tǒng)是遺傳信息處理系統(tǒng)，包含5個亞類，翻譯（Translation）亞類中比對到的unigenes最多，達到768條；折疊、分類和降解（Folding，sorting and degradation）亞類次之，為759條。第三大類為環(huán)境信息處理系統(tǒng)，包括2個亞類，主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signaltransduc-tion）和膜轉(zhuǎn)運（Membranetransport）通路，分別比對到458條和38條unigenes。第四大系統(tǒng)為細胞工程（Cellularprocesses），包括運輸與分解代謝（Transport andcatobolism）和細胞運動（Cellmotil-ity）2個亞類，分別比對到431條和138條unige-nes。在有機系統(tǒng)中，涉及環(huán)境適應(yīng)（Environmen-tal adaptation）的unigenes較少，為296條。

2.7 SSR分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對秒楞進行SSR（簡單重復(fù)序列）位點的檢測和分析，共發(fā)現(xiàn)6種類型的SSR，包括單核苷酸重復(fù)（Mononucleotide）、雙核苷酸重復(fù)（Dinucleotide）和三核苷酸重復(fù)（Trinucleotide）等。如圖7所示，SSR位點中單核苷酸重復(fù)類型為1346條，占比約 14.96% ，其中以A/T重復(fù)最為豐富，表明其在秘基因組中的顯著優(yōu)勢地位。此外，雙核苷酸重復(fù)類型中AG/CT最多（3405條），占比約 37.85% ，是雙核苷酸重復(fù)中最主要的類型。三核苷酸重復(fù)中類型最多，常見類型為AAG/CTT（526條）和AGC/CTG（478條），其數(shù)量顯著高于其他類型，顯示出秒楞特定基因區(qū)域在進化過程中的保守性。四核苷酸（Tetranucleotide）、五核苷酸（Pentanucleotide）和六核苷酸（Hexanucleotide）重復(fù)類型較少，分布數(shù)量相對較低。SSR位點多態(tài)性與基元的堿基數(shù)和重復(fù)次數(shù)相關(guān)（楊也等，2024），當(dāng)基序長度大于等于 時，其多態(tài)性較高。根據(jù)SSR長度分類，長度小于 的SSR占大多數(shù)，而大于 的SSR比例較低。根據(jù)引物設(shè)計原則篩選了一些符合條件的引物（表1），這將為后續(xù)分子標(biāo)記的開發(fā)提供參考。

3討論

目前國內(nèi)對的研究主要集中在引種栽培（曾莉莉等，1997）、組織培養(yǎng)（郭秉左，2000）和基因結(jié)構(gòu)（WANGetal.，2019）等方面，并取得了一定的研究成果。然而，在組學(xué)層面的研究主要集中在基因組學(xué)方面。在鐵線蕨的葉綠體基因組研究中展示了維管植物中未曾見過的一些獨特特征，如tRNA基因缺失，這種現(xiàn)象此前僅在非光合植物的葉綠體基因組中觀察到（WOLFetal.，2003）。通過比較4種蕨類植物葉綠體基因組序列，確認了2個主要的重排事件將高等薄囊蕨類與基部蕨類譜系區(qū)分開來。秒楞的葉綠體基因組在基因組成、基因順序和GC含量方面與薄囊蕨類植物鐵線蕨相似（GAOetal.，2009）。2020年首次從高通量測序數(shù)據(jù)中組裝和表征了秒的完整葉綠體基因組（MAetal.，2020）。轉(zhuǎn)錄組是指在特定時空條件下，某一生物體的細胞或組織轉(zhuǎn)錄的所有RNA的總和（張春蘭等，2012）。轉(zhuǎn)錄組測序被廣泛用于探索功能基因、確定代謝通路和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制等多個方面。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，系統(tǒng)地揭示了秒的基因表達特征和代謝通路，提供了關(guān)于遺傳基礎(chǔ)和生態(tài)適應(yīng)性相關(guān)的數(shù)據(jù)。首先，轉(zhuǎn)錄組測序共獲得35359條unigenes，與NR、KOG、SwissProt、GO和KEGG五大數(shù)據(jù)庫進行比對的結(jié)果表明，注釋到NR數(shù)據(jù)庫的基因占比最高（ 74.13% ），且在NR數(shù)據(jù)庫中顯示，秒與鐵線蕨同源性最高，與其他物種的同源性均較低。其次，KOG功能分類結(jié)果顯示，注釋到17166條unigenes，占比 48.55% ，與翻譯、核糖體生物合成及能量轉(zhuǎn)化等相關(guān)的基因豐度較高，進一步證明了秒楞在維持細胞基本生命活動方面的穩(wěn)定性和適應(yīng)能力。對基因通路進行KEGG分析結(jié)果表明，注釋到的unigenes最少（9063條），占比約 25.63% ，秒羅轉(zhuǎn)錄組中的基因主要涉及氨基酸代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等重要生物學(xué)過程，揭示了秘在代謝調(diào)控和基因表達方面的復(fù)雜性。SSR分析發(fā)現(xiàn)了大量A/T和AG/CT重復(fù)序列，這些SSR位點不僅具有較高的多態(tài)性，且易于開發(fā)為分子標(biāo)記，具有廣泛的應(yīng)用潛力。未來的研究可以進一步探索在不同生態(tài)環(huán)境中的適應(yīng)性機制以及特定功能基因的精細調(diào)控，為秒楞的保護與育種提供理論依據(jù)。

4結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序和生物信息學(xué)分析，揭示了秘楞的基因功能和代謝網(wǎng)絡(luò)，為今后進一步挖掘其功能基因、遺傳多樣性、分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻References

董元火，蔡方陶，白雪依，宋呈鈺，寧婷婷，熊飛，曾長立， 2024.瀕危植物邢氏水蕨和海南島水蕨葉綠體序列 rbcL比較及隱種分析[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報，33（1）：28-34. DONGYH，CAIFT，BAIXY，SONGCY，NINGTT， XIONG F， ZENG C L.2024.Comparison of chloroplast sequences rbcL of the endangered Ceratopteris shingii and C. thalictroides from Hainan island in China，and analysis of cryptic species of C. thalictroides[J].Ecology and Environmental Sciences，33（1）：28-34.doi：10.16258/ j.cnki.1674-5906.2024.01.003.

范劍明，溫秀鳳，王溢豪，葉雪蘭，羅萬業(yè)，朱昔嬌，2023.珍 稀瀕危植物的研究進展與開發(fā)前景分析[J].熱帶農(nóng) 業(yè)科學(xué)，43（7）：46-52. FAN JM，WEN XF， WANG Y H， YE XL， LUO WY， ZHU X J. 2023. Research and development prospect analysis of rare and endangered plant Alsophila spinulosa[J]. Chinese Journal of Tropical Agriculture， 43（7）： 46-52. doi： 10.12008/j.issn.1009-2196.2023.07.007.

侯夢丹，何卓冀，杜旭燁，周徐平，鄧欣妍，何琴琴，楊衛(wèi)誠，曾 芷若，彭濤．2023.秒 Alsophila spinulosa 組培快繁體 系的建立[J/OL].分子植物育種，1-10.（2023-02-27） [2024-10-08]. HOU M D， HE Z J， DU X H， ZHOU XP， DENG XY， HE Q Q，YANG W C， ZENG Z R， PENG T.2023.Establishment of tissue culture and rapid propagation system of Alsophila spinulosa[J/OL]. Molecular Plant Breeding， 1-10. （2023-02-27）[2024-10-08].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/ 46.1068.S.20230224.2020.020.html.

何琴琴.2011.赤水楞保護區(qū)楞種群分布的現(xiàn)狀及保護 對策[J].綠色科技，13（5）：40-41. HE Q Q. 2011. Current situation and protection countermeasures of Alsophila spinulosa population distribution in Chishui Alsophila spinulosa reserve[J]. Journal of Green Science and Technology， 13（5）： 40-41.doi： 10.3969 /j. issn.1674-9944.2011.05.016.

李健玲，秦波，黃欣，蔣日紅，孫苗，梁圣華，黃耀恒，韋廣綏. 2023.海菜花轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析[J].湖南農(nóng) 業(yè)科學(xué)，（12）：13-17，23. LI J L，QIN B， HUANG X， JIANG R H， SUN M， LIANG S H， HUANG Y H，WEI G S. 2023. Transcriptome sequencing and bioinformatics analysis of Ottelia acuminata [J]. Hunan Agricultural Sciences， （12）： 13-17， 23. doi： 10. 16498/j.cnki.hnnykx.2023.012.003.

廖阿慶.2024.永定區(qū)龍?zhí)独闳郝涮卣骷氨Ｗo建議[J].福 建林業(yè)，（5）：25-27. LIAO A Q. 2024. Characteristics and protection suggestions of Alsophila community in Longtan town of Yongding District[J]. Fujian Forestry， （5）： 25-27.

劉雯雯，饒丹丹，吳二煥，韓豫，陳或.2024.遮陰對幼苗 的葉片性狀及光合特性的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 （自然科學(xué)版），44（2）：52-62. LIU W W， RAO DD，WU E H， HAN Y， CHEN Y. 2024. Effects of shading on leaf traits and photosynthetic characteristics of Alsophila spinulosa seedlings[J]. Journal of Shanxi Agricultural University （Natural Science Edition）， 44（2）：52-62.doi： 10.13842/j.cnki.issn1671-8151.20231 1002.

呂朝燕，高智席，徐興線，吳煥，陳興艷.2023.光合特性 （1）： 51-61. LYU C Y， GAO Z X， XU X X， WU H， CHEN X Y. 2023. Responses of photosynthetic characteristics and water potential of Alsophila spinulosa to drought stress and rehydration[J]. Forest Resources Management， （1）： 51-61. doi： 10.13466/j.cnki.lyzygl.2023.01.007.

王文沛，張昊禎，ISHAQMUHAMMAD，徐宇，吳嘉佳，羅巍， 李莎莎，肖雪，嚴(yán)詩楷，金慧子．2023.秒的化學(xué)成分 及藥理活性研究進展[J].化學(xué)試劑，45（6）：44-51. WANGWP，ZHANGHZ，MUHAMMADI，XUY，WU J J， LUO W， LI S S， XIAO X， YAN S K， JIN H Z. 2023. Research progress on chemical components and pharmacological activities of Alsophila spinulosa[J]. Chemical Reagents， 45（6）： 44-51. doi： 10.13822 / j.cnki. hxsj.2023.0006.

王悅，李瑋琦，劉雪梅，郝愛平，任如意，魏繼承．2022.波斯 菊轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析[J/OL].分子植物育種， 1-11. （2022-09-06）[2024-11-10]. http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？ filename=FZZW20220905000amp;d bname=CJFDamp;dbcode=CJFQ. WANG Y， LI W Q，LIU X M，HAO AP， REN RY， WEI J C.2022. Sequencing and bioinformatics analysis of Cosmos transcriptome[J/OL]. China Industrial Economics，： 1- 11. （2022-09-06）[2024-11-10]. http：//kns.cnki.net/KCMS/ detail/detail.aspx？filename=FZZW20220905000amp;dbname CJFDamp;dbcode=CJFQ.

鄔秉左.2000.引種栽培初報[J].江蘇林業(yè)科技，27（6）： 27-32. WU B Z. 200. Preliminary report on introduction and cultivation of Alsophila spinulosa[J]. Journal of Jiangsu Forestry Science amp; Technology， 27（6）： 27-32.

夏銘澤，唐慧琳，張欣偉，李彥．2024.下田菊葉片轉(zhuǎn)錄組測 序及生物信息學(xué)分析[J/OL].分子植物育種，1-13. （2024-06-18）[2024-11-10]. http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx？filename=FZZW20240614004amp;dbname= CJFD amp;dbcode=CJFQ. XIA M Z， TANG H L， ZHANG X W， LI Y. 2024. Transcriptome sequencing and bioinformatics analysis of leaves of Chrysanthemum morifolium[J/OL]. China Industrial Economics，1-13. （2024-06-18）[2024-11-10]. http：// kns.cnki. net / KCMS / detail / detail. aspx？ filename= FZZW20240614004 amp;dbname=CJFDamp;dbcode=CJFQ.

楊也，李勝輝，張素勤，耿廣東．2024.蜜本南瓜EST-SSR標(biāo) 記開發(fā)及多態(tài)性分析[J].分子植物育種，22（6）：1934- 1943. YANG Y， LI S H， ZHANG S Q，GENG G D. 2024. ESTSSR marker development and polymorphism analysis of miben pumpkin[J]. Molecular Plant Breeding， 22（6）： 1934-1943.doi： 10.13271/j.mpb.022.001934.

袁守良，白小節(jié).2005.珍稀瀕危植物移栽的探索[J].貴 州環(huán)保科技，11（1）：43-45. YUAN S L， BAI X J. 2005.Environmental Protection and Technology，11（1）： 43-45.doi： 10.3969 / j.issn.1674- 0254.2005.01.006.

曾莉莉，魏德生，陳德明，王用平．1997.易地引種與保 護地栽培[J].中國中藥雜志，22（2）：80-82. ZENG L L，WEI D S， CHENDM，WANG YP.1997. Introduction and protected cultivation of Alsophila spinulosa in different places[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 22（2）： 80-82.

宗秀虹，張華雨，王鑫，李宗峰，吳洪英，梁盛，鄧洪平.2016. 赤水羅國家級自然保護區(qū)秒群落特征及物種多樣 性研究[J].西北植物學(xué)報，36（6）：1225-1232. ZONGXH，ZHANGHY，WANGX，LIZF，WUHY， LIANG S， DENG H P. 2016. Community characteristics and species diversity of Alsophila spinulosa in Chishui Alsophila national nature reserve[J]. Acta Botanica BorealiOccidentalia Sinica， 36（6）： 1225-1232. doi： 10.7606 /j. issn.1000-4025.2016.06.1225.

張春蘭，秦孜娟，王桂芝，紀(jì)志賓，王建民．2012.轉(zhuǎn)錄組與 RNA-Seq技術(shù)[J].生物技術(shù)通報，28（12）：51-56. ZHANG CL，QIN ZJ，WANGGZ， JIZB，WANGJM. 2012. Transcriptome and RNA-seq technology[J]. Biotechnology Bulletin，28（12）：51-56.doi： 10.13560/j.cnki. biotech.bull.1985.2012.12.025.

CHENG HF， WAN ZY， XU YX， SHEN J S，LI XQ， JIN S H. 2024. Transcriptome and photosynthetic analyses provide new insight into the molecular mechanisms underlying heat stresstolerancein Rhododendron × pulchrumSweet [J].Tree Physiology， 44（1）： tpad133. doi： 10.1093 / treephys/tpad133.

GAO L， YI X， YANG Y X， SU Y J， WANG T. 2009. Complete chloroplast genome sequence of a tree fern Alsophila spinulosa： Insights into evolutionary changes in fern chloroplast genomes[J]. BMC Evolutionary Biology， 9： 130. doi： 10.1186/1471-2148-9-130.

JU Y Q，F(xiàn)ENG L，WU JY，YE Y J，ZHENG TC，CAI M， CHENG TR，WANGJ，ZHANGQX，PANHT.2018. Transcriptome analysis of the genes regulating phytohormone and cellular patterning in Lagerstroemia plant architecture[J].Scientific Reports，8（1）： 15162.doi： 10.1038/ s41598-018-33506-8.

LI N，MENGZW，TAOMJ，WANGYY，ZHANGYL，LI S F， GAO W J， DENG C L.2020. Comparative transcriptome analysis of male and female flowers in Spinacia oleracea L.[J].BMC Genomics， 21（1）： 850. doi： 10.1186/ s12864-020-07277-4.

MA YY， JIAO P， QI Z， JIANG Z Z， GUAN S Y. 2020. Characterization of the complete chloroplast genome of Alsophila spinulosa， an endangered species endemic to China[J]. Mitochondrial DNA Part B， 5（3）： 2262-2263. doi： 10.1080/23802359.2020.1772142.

RANIL RH G， PUSHPAKUMARA D K N G， WIJESUNDARAD SA，BOSTOCKPD，EBIHARAA，F(xiàn)RASER-JENKINS C R.2017.Diversity and distributional ecology of tree ferns of Sri Lanka： A step towards conservation of a unique gene pool[J]. Ceylon Journal of Science， 46（5）： 127-135.doi：10.4038/cjs.v46i5.7460.

SMITH A R， PRYER K M， SCHUETTPELZ E， KORALL P， SCHNEIDER H，WOLF P G. 2006.A classification for extant ferns[J].TAXON， 55（3）： 705-731.doi： 10.2307/ 25065646.

WANG T，HE ZQ，WANGZ，SUNXY，SU YJ.2019.The first complete chloroplast genome of Alsophila costularis （Cyatheaceae）， a least concerned relict tree fern[J]. Mitochondrial DNA Part B，4（1）：1897-1898. doi： 10.1080/ 23802359.2019.1614888.

WOLF PG，ROWE C A， SINCLAIR R B，HASEBE M. 2003. Complete nucleotide sequence of the chloroplast genome from a leptosporangiate fern， Adiantum capillus-veneris L [J].DNA Research，10（2）：59-65.doi： 10.1093/dnares / 10.2.59.

（責(zé)任編輯 謝紅輝）