腦震寧顆粒調(diào)節(jié)三重腦震蕩大鼠線粒體能量代謝的機(jī)制研究Δ

高麗，趙樂，魏楠楠，武立雅，王恬恬，張唯依，王永輝 （山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619）

創(chuàng)傷性顱腦損傷是由于機(jī)械外力作用于顱腦內(nèi)容物導(dǎo)致腦組織結(jié)構(gòu)損傷或功能中斷，從而引起一系列分子損傷的連鎖反應(yīng)[1―2]。腦震蕩屬于輕型創(chuàng)傷性顱腦損傷，主要表現(xiàn)為記憶下降、情志異常、認(rèn)知障礙等癥狀，多呈現(xiàn)出腦組織挫傷、神經(jīng)性血管損傷、顱內(nèi)壓升高、血腦屏障破壞等原發(fā)或繼發(fā)性病理特點(diǎn)[3]。目前腦震蕩的發(fā)病率在逐年增高[4]，嚴(yán)重影響患者的日常生活，并給社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為一個(gè)亟待解決的公共衛(wèi)生問題。

腦震寧顆粒由生地黃、當(dāng)歸、丹參、丹皮、川芎、地龍、炒酸棗仁、柏子仁、茯苓、陳皮、竹茹11味藥組成，共奏活血通絡(luò)、寧心安神、除煩止嘔之功效。有研究表明，腦震寧顆粒對(duì)于腦震蕩、創(chuàng)傷性綜合征、神經(jīng)血管性疾病等所致的頭痛頭暈相關(guān)癥狀有很好的療效[5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腦震寧顆粒可以增加線粒體三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的含量，改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能，從而促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)再生[6―7]，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)腦組織的神經(jīng)發(fā)生和保護(hù)，并與線粒體分布、代謝及相關(guān)動(dòng)力學(xué)改變密切相關(guān)[8]。因此，本實(shí)驗(yàn)以Wnt信號(hào)通路為出發(fā)點(diǎn)，探究腦震寧顆粒調(diào)節(jié)三重腦震蕩（multiple cerebral concussion，MCC）模型大鼠海馬組織線粒體能量代謝的作用機(jī)制，以期為腦震寧顆粒的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：XR-XZ301型曠場(chǎng)及分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司），R540IE型呼吸麻醉機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），UC7型超薄切片機(jī)（德國(guó)Leica公司），HT7800型透射電子顯微鏡（日本株式會(huì)社日立制作所），Pannoramic MIDI型掃描儀（濟(jì)南丹吉爾電子有限公司），KZ-Ⅲ-FP型研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），A51119600C型酶標(biāo)儀（瑞士SGS集團(tuán)），Mini MP4型電泳儀、Mini TBT型轉(zhuǎn)印儀[莫納（蘇州）生物科技有限公司]，ImageQuant LAS 500型一體化成像儀（美國(guó)GE公司）。

1.2 主要藥品與試劑

腦震寧顆粒（批號(hào)20200701）購自山西振東安特生物制藥有限公司；吡拉西坦片（批號(hào)4201008，規(guī)格0.4 g）購自東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司；異氟烷（批號(hào)20221102）購自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；ATP含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20230329）購自南京建成生物工程研究所；電鏡固定液、組織自發(fā)熒光淬滅劑、DAPI染色試劑（批號(hào)分別為G1102、G1221、G1012）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（批號(hào)分別為18C13B46、BST15D07AE54）均購自武漢博士德生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠試劑盒（批號(hào)BB1207）購自陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；兔源過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1α，PGC-1α）單克隆抗體、兔源核呼吸因子1（nuclear respiratory factor-1，NRF-1）單克隆抗體、兔源線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）單克隆抗體、兔源Wnt-3a多克隆抗體、兔源β-連環(huán)蛋白（β-catenin）單克隆抗體、兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)分別為3523010313、0206040201、5500022039、00084249、4000000136、3500026050）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔源動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）單克隆抗體、兔源線粒體裂變蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1）單克隆抗體、兔源線粒體融合蛋白1（mitochondrial fusion 1，Mfn1）單克隆抗體、兔源視神經(jīng)萎縮蛋白1（optic atrophy protein 1，Opa1）單克隆抗體（批號(hào)分別為12957-1-AP、10956-1-AP、13798-1-AP、27733-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，共52只，體重（220±10） g，雌雄各半，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2021-0006。大鼠飼養(yǎng)于山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，環(huán)境溫度（22±2） ℃，相對(duì)濕度（50±10）%，自由晝夜光照，自由進(jìn)食、進(jìn)水。本實(shí)驗(yàn)通過山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)為2021DW031。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

實(shí)驗(yàn)大鼠分為正常組（n＝8）和造模組（n＝44）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，造模組采用“自由落體撞擊法”制備MCC大鼠模型，每日撞擊1次，連續(xù)3 d，撞擊部位為大鼠額顳葉部，撞擊條件為：高度100 cm，撞擊物質(zhì)量150 g。每次撞擊后若符合下列條件則視為造模成功[7]：（1）撞擊后動(dòng)物立刻出現(xiàn)一過性呼吸暫停，但不超過20 s即恢復(fù)正常呼吸節(jié)律；（2）動(dòng)物出現(xiàn)短暫的角膜反射、針刺疼痛反應(yīng)、翻正反射消失，但不超過3 min，恢復(fù)后無任何行動(dòng)障礙。

將造模成功的大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、吡拉西坦組（陽性對(duì)照藥）和腦震寧顆粒低、中、高劑量組，每組8只。通過人/大鼠體表面積換算后，計(jì)算出藥物等效劑量（70 kg的人，以每日50 g藥物的臨床劑量標(biāo)準(zhǔn)為中劑量，1/2中劑量為低劑量，2倍中劑量為高劑量）。各給藥組大鼠按吡拉西坦組0.324 g/kg，腦震寧顆粒低、中、高劑量組2.25、4.5、9 g/kg的劑量灌服相應(yīng)藥物。正常組和模型組大鼠灌服等體積生理鹽水。所有大鼠每天灌服1次，連續(xù)14 d。

2.2 大鼠運(yùn)動(dòng)探索能力的評(píng)估

采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。給藥14 d之后，首先清理實(shí)驗(yàn)箱，消除氣味的影響，之后將大鼠快速放入實(shí)驗(yàn)箱的中央，打開錄像系統(tǒng)，記錄其在5～10 min內(nèi)的曠場(chǎng)活動(dòng)軌跡，計(jì)算大鼠的水平運(yùn)動(dòng)總路程、中央格進(jìn)入次數(shù)、靜止時(shí)間、直立次數(shù)，評(píng)估其運(yùn)動(dòng)探索能力。

2.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估

采用新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。在給藥的最后3 d，每天撫摸大鼠1～2 min。測(cè)試時(shí)，將A、B兩個(gè)球形物體放入正方形箱子中，開啟錄像設(shè)備，記錄10 min內(nèi)大鼠與A、B兩物體的接觸情況，結(jié)束后放入飼養(yǎng)籠；1 h之后，將B物體換成立方體形狀的C物體，記錄2～5 min內(nèi)大鼠與A、C兩物體的接觸情況。運(yùn)用新物體識(shí)別指數(shù)來評(píng)估大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。新物體識(shí)別指數(shù)＝tC/（tB+tC）×100%，其中tB為探索舊物體B的時(shí)間，tC為探索新物體C的時(shí)間。

2.4 大鼠海馬組織線粒體ATP含量的檢測(cè)

給藥14 d之后，大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，開顱取腦，冰上剝離組織，取100 mg海馬組織塊，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1∶9的比例加入9倍體積的冷雙蒸水，勻漿后制成勻漿液，水浴煮沸后離心取上清進(jìn)行后續(xù)操作。按照試劑盒說明書制備相應(yīng)試劑，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A）值，并根據(jù)以下公式計(jì)算組織中的ATP含量：ATP含量（μmol/g prot）＝（A測(cè)定－A對(duì)照）/（A標(biāo)準(zhǔn)－A空白）×c標(biāo)準(zhǔn)×N÷cpr。c標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)品濃度，1 000 μmol/L；N：樣本測(cè)定前稀釋倍數(shù)；cpr：勻漿蛋白濃度。

2.5 大鼠海馬組織線粒體結(jié)構(gòu)的觀察

采用透射電鏡觀察。取“2.4”項(xiàng)下各組大鼠海馬組織約1 mm3為檢測(cè)樣本，置于電鏡固定液（4 ℃）中。取出海馬組織先用0.1 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。之后滴加1%鋨酸避光室溫固定2 h，再用0.1 mol/L PBS漂洗3次，每次15 min。漂洗結(jié)束后將組織以30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%的梯度依次進(jìn)行乙醇脫水，每次20 min，繼續(xù)用丙酮脫水2次，每次15 min。然后進(jìn)行滲透包埋和聚合，用超薄切片機(jī)切片，再用2%醋酸鈾飽和乙醇溶液避光染色8 min，用2.6%枸櫞酸鉛溶液避CO2染色8 min。等室溫干燥后通過透射電鏡觀察線粒體結(jié)構(gòu)，并采集圖像進(jìn)行分析。

2.6 大鼠海馬組織線粒體分裂、融合蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫熒光法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下透射電鏡所剩的石蠟切片，每組各取6個(gè)樣本，脫蠟至水后進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)完成后，自然冷卻。切片置于PBS中洗滌3次，每次5 min。干燥后用組化筆圈出腦組織范圍，滴加牛血清白蛋白，封閉30 min。滴加一抗（線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1和線粒體融合蛋白Mfn1、Opa1稀釋度均為1∶200），4 ℃孵育過夜。切片于PBS中洗滌3次，每次5 min，滴加二抗（稀釋度均為1∶300），避光室溫孵育50 min。采用DAPI復(fù)染細(xì)胞核后，加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。室溫晾干，抗熒光淬滅封片劑封片。電子顯微鏡下觀察并采集圖像，采用Image J軟件對(duì)其熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以熒光強(qiáng)度反映蛋白表達(dá)水平，熒光強(qiáng)度值越高表明蛋白表達(dá)水平越高。

2.7 大鼠海馬組織線粒體生物合成和通路蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用Western blot法檢測(cè)。取“2.4”項(xiàng)下大鼠海馬組織，每組各取6個(gè)樣本，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA試劑盒測(cè)定組織蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液后加熱變性，制膠加樣進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入TBST稀釋的一抗（PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、β-catenin的稀釋度均為1∶1 000，β-actin的稀釋度為1∶30 000），4 ℃孵育12～18 h過夜。次日用TBST洗脫3次，每次10 min，加入稀釋后的二抗（稀釋度為1∶10 000或1∶5 000），常溫孵育60 min。TBST洗脫后，加入ECL發(fā)光染液顯影，凝膠成像分析儀拍攝圖像，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 27.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 腦震寧顆粒對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)探索能力的影響

與正常組比較，模型組大鼠的運(yùn)動(dòng)總路程、中央格進(jìn)入次數(shù)和直立次數(shù)均顯著降低（P＜0.01），靜止時(shí)間顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，吡拉西坦組和腦震寧顆粒中、高劑量組大鼠的運(yùn)動(dòng)總路程、中央格進(jìn)入次數(shù)和直立次數(shù)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），靜止時(shí)間顯著降低（P＜0.01）；腦震寧顆粒低劑量組大鼠的運(yùn)動(dòng)總路程和直立次數(shù)均顯著升高（P＜0.01），靜止時(shí)間顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)探索能力相關(guān)指標(biāo)結(jié)果比較（±s，n＝8）

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)探索能力相關(guān)指標(biāo)結(jié)果比較（±s，n＝8）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組吡拉西坦組腦震寧顆粒低劑量組腦震寧顆粒中劑量組腦震寧顆粒高劑量組運(yùn)動(dòng)總路程/m 86.86±7.91 55.03±10.27a 71.58±7.10b 72.89±8.83c 75.15±8.94c 70.98±7.11b靜止時(shí)間/s 10.50±5.50 29.44±3.90a 16.00±3.17c 21.25±3.68b 16.13±3.71c 19.00±1.57c中央格進(jìn)入次數(shù)/次4.88±0.64 1.38±0.92a 3.13±0.83c 2.00±0.76 2.50±0.93b 2.88±0.99c直立次數(shù)/次18.25±2.50 9.00±1.41a 14.25±1.26c 13.50±1.29c 14.50±1.29c 14.25±2.63c

3.2 腦震寧顆粒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

正常組、模型組、吡拉西坦組和腦震寧顆粒低、中、高劑量組大鼠的新物體識(shí)別指數(shù)分別為（68.67±8.42）%、（42.20±6.00）%、（51.29±10.81）%、（51.89±7.19）%、（55.74±7.63）%、（49.92±8.78）%。與正常組比較，模型組大鼠的新物體識(shí)別指數(shù)顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，吡拉西坦組和腦震寧顆粒低、中劑量組大鼠的新物體識(shí)別指數(shù)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 腦震寧顆粒對(duì)大鼠海馬組織線粒體ATP含量的影響

正常組、模型組、吡拉西坦組和腦震寧顆粒低、中、高劑量組大鼠海馬組織的線粒體ATP含量分別為（4.27±0.30）、（2.54±0.53）、（2.86±0.49）、（3.20±0.57）、（3.58±0.56）、（3.47±0.40） μmol/mg。與正常組比較，模型組大鼠海馬組織的線粒體ATP含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，腦震寧顆粒中、高劑量組大鼠海馬組織的線粒體ATP含量顯著升高（P＜0.05）；吡拉西坦組和腦震寧顆粒低劑量組大鼠海馬組織的線粒體ATP含量升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.4 腦震寧顆粒對(duì)大鼠海馬組織線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡掃描結(jié)果（圖1）顯示，正常組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞膜完整清晰，細(xì)胞核的核膜結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，線粒體數(shù)量可、膜完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見明顯擴(kuò)張、數(shù)量尚可。模型組大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞中度水腫，胞內(nèi)基質(zhì)稀疏，細(xì)胞器大多中度腫脹，以線粒體腫脹為主，線粒體數(shù)量豐富，嵴大量斷裂、減少，膜內(nèi)基質(zhì)局部溶解、變淡，部分線粒體膜內(nèi)髓樣變（圖1B紅色箭頭），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部區(qū)域模糊斷裂。吡拉西坦組大鼠海馬組織細(xì)胞膜完整，線粒體中度腫脹（圖1C綠色箭頭），個(gè)別體積變大，嵴斷裂、減少，基質(zhì)溶解或呈空泡樣，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較少，局部區(qū)域模糊斷裂。腦震寧顆粒低劑量組大鼠海馬組織細(xì)胞核的核膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體腫脹明顯、數(shù)量尚可、大多膜完整，膜內(nèi)基質(zhì)溶解、變淡，部分線粒體膜內(nèi)髓樣變（圖1D紅色箭頭），粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量豐富、未見明顯擴(kuò)張。腦震寧顆粒中劑量組大鼠海馬組織細(xì)胞核的核膜結(jié)構(gòu)清晰，染色質(zhì)均勻，線粒體輕、中度腫脹（圖1E綠色箭頭），膜完整，嵴少量斷裂、減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較多。腦震寧顆粒高劑量組大鼠海馬組織細(xì)胞核呈橢圓形，染色質(zhì)均勻，線粒體中度腫脹，膜完整，嵴大量斷裂、減少，膜內(nèi)基質(zhì)局部溶解、變淡，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部輕度擴(kuò)張（圖1F藍(lán)色箭頭）、數(shù)量較多。其中以腦震寧顆粒中劑量組的損傷程度最輕。

圖1 各組大鼠海馬組織線粒體透射電鏡掃描圖（×2 500）

3.5 腦震寧顆粒對(duì)大鼠海馬組織線粒體分裂、融合蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬組織Drp1、Fis1的熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.01），Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠海馬組織Drp1、Fis1的熒光強(qiáng)度均顯著降低（P＜0.01），Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠海馬組織Drp1、Fis1、Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度結(jié)果比較（±s，n＝6，AU）

表2 各組大鼠海馬組織Drp1、Fis1、Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度結(jié)果比較（±s，n＝6，AU）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05。

Opa1 102.42±1.68 53.73±5.03a 62.92±3.24c 71.35±7.08b 91.10±1.54b 69.74±3.49b組別正常組模型組吡拉西坦組腦震寧顆粒低劑量組腦震寧顆粒中劑量組腦震寧顆粒高劑量組Drp1 31.22±2.01 75.97±3.07a 39.95±1.56b 48.29±4.34b 44.01±1.39b 40.13±1.77b Fis1 29.96±1.18 64.59±3.93a 45.63±1.73b 50.15±0.93b 41.87±0.54b 50.12±2.45b Mfn1 97.37±3.92 46.41±1.07a 57.81±1.79b 58.41±0.51b 68.29±4.66b 66.68±3.07b

3.6 腦震寧顆粒對(duì)大鼠海馬組織線粒體生物合成和通路蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬組織PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，吡拉西坦組和腦震寧顆粒低、中劑量組大鼠海馬組織PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、βcatenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01），腦震寧顆粒高劑量組大鼠海馬組織PGC-1α、TFAM、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.01）。結(jié)果見表3、圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織線粒體生物合成和通路蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組大鼠海馬組織線粒體生物合成和通路蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝6）

表3 各組大鼠海馬組織線粒體生物合成和通路蛋白表達(dá)水平比較（±s，n＝6）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別正常組模型組吡拉西坦組腦震寧顆粒低劑量組腦震寧顆粒中劑量組腦震寧顆粒高劑量組β-catenin/β-actin 0.63±0.03 0.21±0.02a 0.49±0.03b 0.42±0.02b 0.57±0.02b 0.47±0.02b PGC-1α/β-actin 0.55±0.02 0.24±0.01a 0.43±0.02b 0.42±0.02b 0.46±0.02b 0.34±0.03b NRF-1/β-actin 0.73±0.04 0.34±0.03a 0.71±0.02b 0.58±0.02b 0.42±0.02b 0.36±0.03 TFAM/β-actin 0.80±0.03 0.36±0.03a 0.65±0.03b 0.66±0.05b 0.74±0.05b 0.59±0.03b Wnt-3a/β-actin 0.91±0.02 0.41±0.03a 0.68±0.02b 0.56±0.03b 0.74±0.04b 0.56±0.03b

4 討論

腦震蕩屬于中醫(yī)“頭痛”“外傷性腦病”范疇，其證初期多實(shí)，后期多虛實(shí)夾雜?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載“若有所墜墮，惡血留內(nèi)而不去”[9]。機(jī)械外力作用于腦絡(luò)，致氣血逆亂、瘀血阻滯、元神失養(yǎng)，日久或痰瘀阻竅，或氣血耗損，出現(xiàn)昏脹頭暈、記憶模糊等精神障礙。腦震寧顆粒中川芎、當(dāng)歸、地龍、丹參用以除離經(jīng)之血，行氣血，緩頭痛；炒酸棗仁、柏子仁以養(yǎng)心安神、寧心定志；生地黃、丹皮清血分之熱；生地黃、當(dāng)歸補(bǔ)血分之不足；茯苓、陳皮、竹茹降逆和胃，化神竅之痰?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，川芎、炒酸棗仁等藥物可以減少細(xì)胞凋亡，提高ATP含量，減輕線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，改善機(jī)體癥狀[10―11]。王學(xué)建等[12]通過臨床研究表明，腦震寧顆?？梢跃徑饽X外傷后頭痛癥狀，糾正神經(jīng)功能紊亂。基于以上藥物的神經(jīng)保護(hù)作用，筆者進(jìn)一步探討了腦震寧顆粒對(duì)MCC模型大鼠線粒體能量代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制。

線粒體是一種多功能的半自主性細(xì)胞器，它通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)還原氧氣，維持機(jī)體的氧化平衡，合成ATP，釋放能量，在參與機(jī)體細(xì)胞程序性死亡、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖與代謝等方面發(fā)揮著重要作用[13]。顱腦作為機(jī)體的生命中樞，與線粒體的關(guān)系十分密切。有研究表明，在帕金森病小鼠模型中，小鼠中腦的神經(jīng)元數(shù)量減少，炎性因子表達(dá)增加，同時(shí)線粒體分裂、融合蛋白失衡[14]?？梢?，顱腦損傷類疾病多伴隨線粒體和神經(jīng)元的異常，且二者多相互影響。本課題組前期研究表明，腦震寧顆?？梢酝ㄟ^改善線粒體結(jié)構(gòu)和功能，增加ATP含量，對(duì)MCC模型大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并提高其學(xué)習(xí)記憶能力[7]，但并未深入探究其核心靶點(diǎn)和機(jī)制。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠海馬組織線粒體ATP含量顯著降低，線粒體出現(xiàn)明顯腫脹，嵴大量斷裂、減少，部分線粒體膜內(nèi)髓樣變，同時(shí)大鼠的運(yùn)動(dòng)探索能力和學(xué)習(xí)記憶能力下降。給予腦震寧顆粒干預(yù)后，腦震寧顆粒各劑量組大鼠海馬組織線粒體ATP含量顯著升高，神經(jīng)元內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)明顯改善，大鼠的運(yùn)動(dòng)探索和學(xué)習(xí)記憶能力有所提高?？梢姡X震寧顆?？梢孕迯?fù)神經(jīng)元線粒體損傷，提高大鼠運(yùn)動(dòng)探索和學(xué)習(xí)記憶能力。

Wnt信號(hào)通路是一組由蛋白質(zhì)Wnt和受體蛋白結(jié)合激發(fā)，多種蛋白參與，高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[15]。它在胚胎發(fā)育、器官發(fā)生、組織再生與穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用[16―17]。有研究表明，缺血再灌注損傷中，Wnt通路的關(guān)鍵分子糖原合成酶激酶3β表達(dá)增加，β-catenin被降解，誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示W(wǎng)nt信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖分化起重要作用；當(dāng)Wnt信號(hào)激活時(shí)，Wnt與其受體結(jié)合激活蓬亂蛋白Dsh，抑制了糖原合成酶激酶3β，促進(jìn)β-catenin與下游基因的轉(zhuǎn)錄[18]。研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路通過與線粒體生物合成及融合與分裂的相互作用來影響神經(jīng)元細(xì)胞的正常發(fā)育和功能發(fā)揮[19]。線粒體生物合成、融合與分裂是線粒體質(zhì)量控制過程中的重要環(huán)節(jié)。PGC-1α、NRF-1、TFAM是線粒體生物合成的3個(gè)關(guān)鍵蛋白，PGC-1α作為調(diào)控系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，可以通過誘導(dǎo)NRF-1的轉(zhuǎn)錄，增加TFAM的表達(dá)，從而促進(jìn)線粒體生物合成[20]。同時(shí)，上調(diào)Opa1、下調(diào)Drp1可以調(diào)控線粒體融合分裂平衡，保護(hù)線粒體形態(tài)，減少神經(jīng)元凋亡[21―22]。有研究發(fā)現(xiàn)，激活Wnt/β-catenin通路可以促進(jìn)線粒體生物合成，調(diào)節(jié)融合分裂平衡[8]。Mori等[23]研究顯示，給脂肪細(xì)胞孵育Wnt-3a可以促進(jìn)PGC-1α、TFAM的表達(dá)增加；而Godoy等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在海馬神經(jīng)元細(xì)胞中孵育Wnt-5a可以促進(jìn)線粒體先分裂后融合。以上研究均表明，Wnt信號(hào)通路和線粒體生物合成、融合與分裂及神經(jīng)元關(guān)系密切。本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠海馬組織PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，線粒體分裂蛋白Drp1、Fis1的熒光強(qiáng)度顯著升高，融合蛋白Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度顯著降低。在給予腦震寧顆粒干預(yù)后，PGC-1α、NRF-1、TFAM、Wnt-3a、β-catenin蛋白表達(dá)水平均有不同程度的上升，同時(shí)Drp1、Fis1的熒光強(qiáng)度均顯著降低，Mfn1、Opa1的熒光強(qiáng)度均顯著升高?？梢娔X震寧顆?？梢酝ㄟ^激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控線粒體分裂融合平衡，促進(jìn)生物合成，從而減少細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)功能，改善腦震蕩的相應(yīng)癥狀。

綜上所述，腦震寧顆粒可以提高M(jìn)CC模型大鼠的運(yùn)動(dòng)探索和學(xué)習(xí)記憶能力，修復(fù)神經(jīng)元損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，維持線粒體融合分裂平衡，促進(jìn)線粒體生物合成相關(guān)。后續(xù)的研究將進(jìn)一步探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體生物合成的具體方式和相關(guān)作用機(jī)制。