蓮草直胸跳甲短神經(jīng)肽F 受體基因sNPFR的克隆及表達(dá)分析

王康　趙雪瑩　霍楠　胡軍　王苑馨　楊軍　賈棟

摘要：為明確蓮草直胸跳甲（Agasicles hygrophila）短神經(jīng)肽F 受體AhsNPFR 功能及其表達(dá)特點(diǎn)，為探索蓮草直胸跳甲生防作用奠定理論基礎(chǔ)，利用PCR 技術(shù)克隆鑒定蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析其在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時(shí)期和組織中的時(shí)空表達(dá)譜。結(jié)果表明，克隆獲得基因AhsNPFR 全長1 669 bp，開放閱讀框1 257 bp，編碼418 個(gè)氨基酸；預(yù)測其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為48.11 ku，理論等電點(diǎn)為8.21，AhsNPFR 具有7 個(gè)典型保守跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于GPCRs 家族，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，其與玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera sNPFR 親緣關(guān)系最近。AhsNPFR 基因在不同發(fā)育階段均有表達(dá)，在1 齡幼蟲中的表達(dá)量最高，是卵中表達(dá)量的9.06 倍；在卵中表達(dá)量最低；雌成蟲的表達(dá)量顯著高于雄成蟲。AhsN ?PFR 基因在不同組織中均有表達(dá)，在3 齡幼蟲后腸中顯著高表達(dá)，是脂肪體表達(dá)量的12.21 倍；在雌雄成蟲后腸顯著高表達(dá)，并在所有組織中均沒有雌雄表達(dá)差異。

關(guān)鍵詞：蓮草直胸跳甲；短神經(jīng)肽F 受體基因sNPFR；基因克隆；發(fā)育時(shí)期表達(dá)；組織表達(dá)

中圖分類號(hào)：S476.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2024）01?0137?08

神經(jīng)肽是一類重要的信號(hào)分子，在昆蟲的生長發(fā)育、繁殖和行為等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。昆蟲神經(jīng)肽作為配體通過與同源的G 蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）相互作用介導(dǎo)其生物學(xué)功能[2]。短神經(jīng)肽F（shortneuropeptide F，sNPF）是最初通過神經(jīng)肽F（neuro?peptide F，NPF）C 末端抗體在馬鈴薯甲蟲Leptino?tarsa decemlineata 和沙漠蝗蟲Schistocerca gregaria中鑒定得到的一類NPF 短肽[3-4]，這些NPF 短肽僅由8～10 個(gè)氨基酸組成，而不是無脊椎動(dòng)物NPF 典型的36～40 個(gè)氨基酸[5]，基于其羧基末端的RLRF酰胺序列類似于無脊椎動(dòng)物的NPF 的RPRF 基序[6]，因此，命名為sNPF。

與大多數(shù)神經(jīng)肽信號(hào)系統(tǒng)相同，sNPF 也是通過激活其特異性短神經(jīng)肽F 受體（short neuropep?tide F receptor，sNPFR），進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制發(fā)揮系列功能[7]。sNPFR 首次在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)[8]，隨后在紅火蟻Solenopsis invicta 和岡比亞按蚊Anopheles gambiae 中相繼克隆出來[9-10]。sNPF 信號(hào)系統(tǒng)在昆蟲的晝夜節(jié)律[11]、生長發(fā)育[12]、寄主定位[13-14]、取食等生理過程中發(fā)揮重要作用，尤其在昆蟲取食中的調(diào)控作用引起相關(guān)研究者的廣泛關(guān)注。在黑腹果蠅Drosophila melanogaster 中，DmsNPF及其受體DmsNPFR 的表達(dá)能促進(jìn)取食量增加及體型增大，相反RNA 干擾二者的功能后果蠅的取食量減少且體型變小[15-16]。華山松大小蠹Dendrocto?nus armandi 中敲除DasNPF 及其受體DasNPFR后，幼蟲和雌雄成蟲的取食量均減少[17]。與上述昆蟲相反，在沙漠飛蝗S. gregaria 中，SgsNPF 及其受體SgsNPFR 的敲除反而會(huì)導(dǎo)致取食量增加[18-19]。大量研究表明，昆蟲頭部和腸道是sNPFR 的主要表達(dá)部位，但在其他組織部位如中樞神經(jīng)系統(tǒng)（cen?tral nervous system，CNS）、觸角、脂肪體、馬氏管等也都有表達(dá)[10，17，20]，關(guān)于sNPFR 的表達(dá)部位目前還沒有明確結(jié)論。

蓮草直胸跳甲Agasicles hygrophila 是世界惡性雜草喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides 的專食性天敵昆蟲[21-23]。本研究擬基于神經(jīng)肽sNPF信號(hào)系統(tǒng)與昆蟲的寄主定位及取食密切相關(guān)的特性，克隆鑒定蓮草直胸跳甲sNPF 信號(hào)系統(tǒng)的sNPFR 基因，檢測其在不同發(fā)育階段及組織的表達(dá)模式，旨在為后續(xù)深入研究蓮草直胸跳甲專一性定位寄主與取食的分子調(diào)控機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蓮草直胸跳甲采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，后飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲室。飼養(yǎng)條件為：溫度（25±1）℃ ，相對(duì)濕度為85%±5%，光周期14L∶10D。幼蟲飼養(yǎng)于玻璃培養(yǎng)皿（直徑15 cm，高2.5 cm），成蟲飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲罐（直徑12 cm，高17 cm）。

喜旱蓮子草采自浙江省玉環(huán)縣，現(xiàn)種植于太谷區(qū)山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治基地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 昆蟲樣品收集

基因克隆樣品為蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的混合樣本。各發(fā)育階段的取樣分別為：1 日齡卵，1 日齡的1、2、3 齡幼蟲，1 日齡蛹和雌雄成蟲。其中，3 齡幼蟲組織的取樣為：頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體；雌雄成蟲取樣為：觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管、脂肪體。以上樣本均3 次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA 的提取與cDNA 合成

總RNA 使用Trizol 試劑（TaKaRa，大連）提取，通過超微量蛋白核酸分析儀（BioDrop，Cambridge，UK）測定濃度，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。以1 μg RNA 為模板，采用HiScript? Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）的步驟合成cDNA 第1 鏈，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 AhsNPFR 的克隆鑒定與序列分析

基于課題組的蓮草直胸跳甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[24]，利用Primer5.0 設(shè)計(jì)目的基因的擴(kuò)增引物（表1），以1.2.2 合成cDNA 為模板，利用Phanta? Max Super-FidelityDNA Polymerase 試劑盒（Vazyme，南京）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為：2×Phanta Max Buffer10 μL，引物AhsNPFR-F/AhsNPFR-R 各0.8 μL，1 ? cDNA 1 μL，Phanta MAX Super-Fidelity DNApolymerase 0.5 μL，dNTP Mix 0.4 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，48 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；徹底延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過M5 Gel Extraction Kit（Mei5bio，Beijing，China）進(jìn)行回收，連接于pEASY?-Blunt3 CloningVector（Trans Gen Biotech，北京），轉(zhuǎn)入TOP10 感受態(tài)細(xì)胞（ANGYUBIO，上海），菌液送上海生工生物工程有限公司測序。

利用NCBI ORF（Open Reading Frame）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）預(yù)測AhsNPFR 基因的開放閱讀框，DNAMAN 進(jìn)行多序列比對(duì)，ExPASy-ProtParam（http：//web. expasy. org/prot?param/）預(yù)測等電點(diǎn)及蛋白質(zhì)分子量大小，DeepT?MHMM（https：//dtu. biolib. com/DeepTMHMM）預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/）預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域與蛋白家族。通過MEGA 7.0 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1 000 次。

1.2.4 AhsNPFR 基因的表達(dá)模式分析

以1.2.2合成cDNA 為qPCR 模板，通過BeaconDesign 7.0設(shè)計(jì)AhsNPFR 特異性引物，以18S 核糖體蛋白（RPS18）[25]作為不同發(fā)育階段和不同組織處理的內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（表1）。qPCR 所使用的儀器為ABI7500（Applied Biosystems，F(xiàn)os?ter City，CA，USA）。反應(yīng)體系為：2?ChamQ Uni?versal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，10 ? cDNA 1 μL，加ddH2O 至20 μL。qPCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性3 min；95 ℃ 變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。不同發(fā)育階段和各組織樣品分別設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

qPCR 相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt[26]法進(jìn)行分析，使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），Tukey?s HSD 進(jìn)行多重比較差異分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。所得結(jié)果采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤表示，柱狀圖均由GraphPadPrism 8 繪制。

2結(jié)果與分析

2.1 AhsNPFR 基因克隆鑒定

克隆獲得了1 個(gè)短神經(jīng)肽受體基因，產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到與預(yù)期長度一致的目的片段（圖1），其開放閱讀框ORF 長1 257 bp，編碼418 個(gè)氨基酸（圖2），命名為AhsNPFR（Gen?Bank 登錄號(hào)為OQ550102）。

2.2 序列與系統(tǒng)發(fā)育分析

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為48.11 ku，等電點(diǎn)（pI）為8.21；結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示，在38—297 位氨基酸殘基之間具有GPCRs 家族的保守結(jié)構(gòu)域，屬于GPCRs 家族；多序列比對(duì)結(jié)果（圖3）顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 氨基酸序列與其他5 種鞘翅目昆蟲的sNPFR 序列相似性最高，為72.15%～87.22%，其中，與玉米根螢葉甲Di?abrotica virgifera virgifera 相似性最高（87.22%），與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyx mori 相似性次之（52.34%），與雙翅目昆蟲黑腹果蠅D. melanogaster相似性最低（38.83%）。根據(jù)與其他昆蟲sNPFR共有的7 個(gè)典型保守跨膜結(jié)構(gòu)域，克隆序列應(yīng)該為AhsNPFR 基因。

將蓮草直胸跳甲sNPFR 氨基酸序列與鞘翅目、鱗翅目、雙翅目和半翅目等其他26 種昆蟲進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖4 所示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 與其他鞘翅目昆蟲聚為一支；其中與玉米根螢葉甲DvsNPFR、光肩星天牛AgsNPFR 和馬鈴薯甲蟲LdsNPFR 親緣關(guān)系較近；其他目昆蟲也能分別聚類，符合分類學(xué)關(guān)系。

2.3 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段的表達(dá)模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段內(nèi)的表達(dá)水平。結(jié)果表明，AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲各發(fā)育階段均有表達(dá)，其中幼蟲期（1～3 齡幼蟲）和成蟲期（雌雄成蟲）的表達(dá)量均顯著高于卵期和蛹期（P<0.05），1、3 齡幼蟲表達(dá)量顯著高于2 齡幼蟲，雌成蟲表達(dá)量顯著高于雄成蟲（P<0.05）。AhsNPFR 在1～3 齡幼蟲、蛹、雌、雄成蟲的相對(duì)表達(dá)量分別是卵期AhsNPFR表達(dá)量的9.05 倍、6.16 倍、8.03 倍、3.20 倍、8.84 倍和5.55 倍（圖5）。

2.4 AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同組織的表達(dá)模式

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲不同組織的表達(dá)水平，結(jié)果表明（圖6），AhsNPFR 基因在3 齡幼蟲各組織均有表達(dá)，其中后腸的表達(dá)量最高，顯著高于其他組織，是脂肪體表達(dá)量的12.21 倍（P<0.05）；在頭、前腸、中腸和馬氏管的表達(dá)量間沒有顯著差異（P>0.05）；在脂肪體的表達(dá)量最低。

通過qPCR 分析了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲不同組織的表達(dá)水平，結(jié)果表明（圖7），AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲雌雄成蟲各個(gè)組織均有表達(dá)，且表達(dá)模式相似，后腸的表達(dá)量均顯著高于其他組織（P<0.05）；觸角、頭、前腸、中腸、馬氏管、脂肪體的表達(dá)量沒有顯著差異，雌雄成蟲相同組織中表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

本研究克隆了蓮草直胸跳甲sNPFR 基因全長序列，其開放閱讀框編碼418 個(gè)氨基酸殘基，具有GPCRs 家族的保守結(jié)構(gòu)域。目前，已鑒定的節(jié)肢動(dòng)物短神經(jīng)肽受體sNPFR 均屬于GPCRs 家族[18]，主要典型特征為含有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。本研究結(jié)果顯示，蓮草直胸跳甲AhsNPFR 也含有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，并且與其它昆蟲sNPFR 的保守結(jié)構(gòu)域高度保守。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明該基因可用于物種的進(jìn)化關(guān)系研究。

蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因在幼蟲和成蟲期的表達(dá)量顯著高于卵和蛹期，1 齡幼蟲表達(dá)量最高。有研究表明，在豌豆蚜Acyrthosiphon pisum 中，ApsNPFR 在若蟲和成蟲中都有表達(dá)，且1 齡若蟲表達(dá)量最高，敲除ApsNPFR 后，刺探電位圖譜（EPG）結(jié)果顯示，豌豆蚜A. pisum 刺吸植物的次數(shù)和刺吸時(shí)間顯著減少[27]。在黑腹果蠅中，DmsNPFR的過表達(dá)導(dǎo)致取食量增加[16]。由此可見，sNPFR 在調(diào)控昆蟲取食中發(fā)揮重要功能作用，蓮草直胸跳甲是喜旱蓮子草的專食性天敵昆蟲，我們推測，AhsNPFR 也可能與蓮草直胸跳甲取食密切相關(guān)，但其功能還需后續(xù)基因干擾及行為試驗(yàn)驗(yàn)證。另外發(fā)現(xiàn)，蓮草直胸跳甲雌成蟲AhsNPFR 表達(dá)量顯著高于雄成蟲，相關(guān)結(jié)果在其它文獻(xiàn)未見報(bào)道，推測可能為蓮草直胸跳甲雌成蟲取食量高于雄成蟲的重要分子基礎(chǔ)。

AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲3 齡幼蟲和雌雄成蟲后腸中顯著高表達(dá)。有研究表明，在華山松大小蠹D. armandi 中，DasNPFR 基因在頭和中腸組織中顯著高表達(dá)，功能驗(yàn)證表明其主要與取食相關(guān)[17]。在橘小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis 中，BdsN ?PFR 在觸角和中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯著高表達(dá)，通過CRISPR/Cas9 敲除BdsNPFR，發(fā)現(xiàn)該蟲定位寄主能力變?nèi)酰籈AG 反應(yīng)中，對(duì)3 種氣味物質(zhì)的電生理反應(yīng)均顯著降低[28]。家蠶B. mori sNPF 的3 個(gè)同源受體（BNGR-A7、BNGR-A10 和BNGR?A11）在不同組織中表達(dá)模式不同，其中BNGR?A7 僅在成蟲頭部高表達(dá)，BNGR?A10 在幼蟲和蛹的馬氏管中高表達(dá)，而在成蟲馬氏管中表達(dá)量較低，BNGRA11在幼蟲和成蟲的馬氏管、中腸和精巢中表達(dá)量較高，而在蛹期的卵巢中相對(duì)表達(dá)量較高[20]。由此可見，短神經(jīng)肽受體sNPFR 在不同昆蟲的調(diào)控模式可能不同。本研究中檢測了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲觸角、頭、前腸、中腸、后腸、馬氏管和脂肪體的表達(dá)情況，但仍有不足。有文獻(xiàn)報(bào)道，sN ?PFR 在昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯著高表達(dá)[27]，由于技術(shù)原因，沒有檢測AhsNPFR 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)CNS中的表達(dá)情況。

本研究克隆鑒定了蓮草直胸跳甲AhsNPFR 基因，明確了AhsNPFR 基因在蓮草直胸跳甲不同發(fā)育時(shí)期和不同組織的表達(dá)模式，為進(jìn)一步解析短神經(jīng)肽受體AhsNPFR 調(diào)控蓮草直胸跳甲的取食調(diào)控機(jī)制奠定依據(jù)，也為蓮草直胸跳甲生防世界惡性雜草喜旱蓮子草提供一些新的思路。

參考文獻(xiàn)：

［1］ ALTSTEIN M，N?SSEL D R. Neuropeptide signaling in in?sects[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology，2010，692：155-165.

［2］ HEWES R S，TAGHERT P H. Neuropeptides and neuropep?tide receptors in the Drosophila melanogaster genome[J]. Ge?nome Research，2001，11（6）：1126-1142.

［3］ SPITTAELS K，VERHAERT P，SHAW C，et al. Insect neu?ropeptide F（NPF）-related peptides：isolation from Colorado po?tato beetle（Leptinotarsa decemlineata） brain[J]. Insect Biochem?istry and Molecular Biology，1996，26（4）：375-382.

［4］ SCHOOFS L，CLYNEN E，CERSTIAENS A，et al. Newlydiscovered functions for some myotropic neuropeptides in locusts[J]. Peptides，2001，22（2）：219-227.

［5］ N?SSEL D R，WEGENER C. A comparative review of shortand long neuropeptide F signaling in invertebrates：any similari?ties to vertebrate neuropeptide Y signaling？ [J]. Peptides，2011，32（6）：1335-1355.

［6］ MAULE A G，SHAW C，HALTON D W，et al. NeuropeptideF（Moniezia expansa）：localization and characterization usingspecific antisera[J]. Parasitology，1992，105（ Pt 3）：505-512.

［7］ 栗洪飛. 短神經(jīng)肽F 受體（sNPFR）參與調(diào)控桔小實(shí)蠅覓食和取食行為[D]. 重慶：西南大學(xué)，2022.

LI HF. The short neuropeptide F receptor（sNPFR）involved inregulating foraging and feeding behaviors in the oriental fruit flyBactrocera dorsalis（Hendel）[D]. Chongqing：Southwest Univer?sity，2022.

［8］ MERTENS I，MEEUSEN T，HUYBRECHTS R，et al. Char?acterization of the short neuropeptide F receptor from Dro?sophila melanogaster[J]. Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，2002，297（5）：1140-1148.

［9］ GARCZYNSKI S F，CRIM J W，BROWN M R. Characteriza?tion and expression of the short neuropeptide F receptor in theAfrican malaria mosquito，Anopheles gambiae[J]. Peptides，2007，28（1）：109-118.

［10］ CHEN M E，PIETRANTONIO P V. The short neuropeptideF-like receptor from the red imported fire ant，Solenopsis in?victa Buren（Hymenoptera：Formicidae）[J]. Archives of InsectBiochemistry and Physiology，2006，61（4）：195-208.

［11］ JOHARD H A D，YOISHII T，DIRCKSEN H，et al. Peptider?gic clock neurons in Drosophila：ion transport peptide and shortneuropeptide F in subsets of dorsal and ventral lateral neurons[J]. The Journal of Comparative Neurology，2009，516（1）：59-73.

［12］ 李梅梅. 黏蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)與神經(jīng)肽F 及其受體基因功能研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2022.

LI M M. Study on genetic structure and neuropeptide F and itsreceptor gene function of armyworm population[D]. Yangling：Northwest A & F University，2022.

［13］ JIANG H B，GUI S H，XU L，et al. The short neuropeptide Fmodulates olfactory sensitivity of Bactrocera dorsalis upon star?vation[J]. Journal of Insect Physiology，2017，99：78-85.

［14］ ROOT C M，KO K I，JAFARI A，et al. Presynaptic facilita?tion by neuropeptide signaling mediates odor-driven food search[J]. Cell，2011，145（1）：133-144.

［15］ LEE K S，YOU K H，CHOO J K，et al. Drosophila short neu?ropeptide F regulates food intake and body size[J]. Journal ofBiological Chemistry，2004，279（49）：50781-50789.

［16］ LEE K S，KWON O Y，LEE J H，et al. Drosophila short neu?ropeptide F signalling regulates growth by ERK-mediated insu?lin signalling[J]. Nature Cell Biology，2008，10：468-475.

［17］ LIU B，F(xiàn)U D Y，NING H，et al. Identification of the short neu?ropeptide F and short neuropeptide F receptor genes and theirroles of food intake in Dendroctonus armandi[J]. Insects，2021，12（9）：844.

［18］ DILLEN S，ZELS S，VERLINDEN H，et al. Functional char?acterization of the short neuropeptide F receptor in the desertlocust，Schistocerca gregaria[J]. PLoS One，2013，8（1）：e53604.

［19］ DILLEN S，VERDONCK R，ZELS S，et al. Identification ofthe short neuropeptide F precursor in the desert locust：evi?dence for an inhibitory role of sNPF in the control of feeding[J].Peptides，2014，53：134-139.

［20］ MA Q，CAO Z，YU Y N，et al. Bombyx neuropeptide Gprotein-coupled receptor A7 is the third cognate receptor forshort neuropeptide F from silkworm[J]. The Journal of Biologi?cal Chemistry，2017，292（50）：20599-20612.

［21］ 賈棟，趙龍龍，王森，等. 蓮草直胸跳甲Hsp70 蛋白的生物信息學(xué)分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：397-400.

JIA D，ZHAO L L，WANG S，et al. Bioinformatic analysis ofAgasicles hygrophila Hsp70[J]. Journal of Shanxi AgriculturalSciences，2015，43（4）：397-400.

［22］ 馬瑞燕. 空心蓮子草天敵：蓮草直胸跳甲引進(jìn)中國后的生態(tài)適應(yīng)性研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2001.

MA R Y. Ecological adaptation of the introduced biocontrolagent，Agasicles hygrophila，for alligatorweed，Alternantheraphiloxeroides，in china[D]. Beijing：Chinese Academy of Agri?cultural Sciences，2001.

［23］ 余國梁，李政，李健，等. 喜旱蓮子草生物防治研究進(jìn)展[J]. 湖南生態(tài)科學(xué)學(xué)報(bào)，2020，7（4）：62-67.

YU G L，LI Z，LI J，et al. Research progress on biological con?trol of Alternanthera philoxeroides[J]. Journal of Hunan Eco?logical Science，2020，7（4）：62-67.

［24］ JIA D，WANG Y X，LIU Y H，et al. SMRT sequencing offull-length transcriptome of flea beetle Agasicles hygrophila（Selman and Vogt）[J]. Scientific Reports，2018，8：2197.

［25］ 賈棟，紀(jì)周瑜，劉艷紅，等. 蓮草直胸跳甲不同發(fā)育階段內(nèi)參基因的篩選與驗(yàn)證[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，40（4）：53-58.

JIA D，JI Z Y，LIU Y H，et al. Screening and validation of in?ternalreference genes in different developmentalstages of Agas?icles hygrophila[J]. Journal of Shanxi Agricultural University（Natural Science Edition），2020，40（4）：53-58.

［26］ LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative geneexpression data using real-time quantitative PCR and the2?ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

［27］ AMIR M B，SHI Y，CAO H H，et al. Short neuropeptide Fand its receptor regulate feeding behavior in pea aphid（Acyrtho?siphon pisum）[J]. Insects，2022，13（3）：282.

［28］ LI H F，HUANG X Y，YANG Y H，et al. The short neuropep?tide F receptor regulates olfaction-mediated foraging behaviorin the oriental fruit fly Bactrocera dorsalis（Hendel）[J]. InsectBiochemistry and Molecular Biology，2022，140：103697.