五指毛桃飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

梁永娟，韋禮校，蘇靜紅，李錦清，陳 清，林青華,，蔣 林,

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200）

五指毛桃始載于清代何克諫所著的《生草藥性備要》，時(shí)稱之“五爪龍”[1]，今又名土黃芪、五指牛奶、土五加皮、母豬奶、南芪，主要產(chǎn)銷于廣東、廣西，有“廣東人參”的美譽(yù)[2-4]，是嶺南地區(qū)常用的藥食同源類中藥[5-6]。五指毛桃為?？浦参锎秩~榕Ficus hirta Vahl的干燥根，其味甘性平，歸脾、肺、胃、大腸、肝經(jīng)，具有健脾益氣、行氣利濕、舒筋活絡(luò)的功效，用于治療脾虛浮腫、食少無(wú)力、肺癆咳嗽、盜汗、帶下、產(chǎn)后無(wú)乳、風(fēng)濕痹痛、水腫、鼓脹、肝膽濕熱、跌打損傷[7-8]?，F(xiàn)代研究表明，五指毛桃主要含有苯丙素類、黃酮類、萜類、甾醇類、揮發(fā)油類等多種化學(xué)成分，具有保肝、提高免疫力、止咳祛痰、抗氧化、抗菌、抗炎等多種藥理作用，廣泛應(yīng)用于治療消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)疾病[9-10]?，F(xiàn)已開(kāi)發(fā)出的五指毛桃香雞、五指毛桃果凍等多種食用產(chǎn)品[11]，極具藥用、食用的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

中藥飲片作為中醫(yī)臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，是直接用于臨床調(diào)配或制劑生產(chǎn)的原料藥[12-13]。因此，中藥飲片質(zhì)量對(duì)于保障中醫(yī)臨床用藥的有效性、安全性，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展具有重要意義[14-15]。然而，五指毛桃飲片并未被2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載，現(xiàn)僅收載于廣東[16]、福建[17]、湖南[18]的地方炮制規(guī)范中?，F(xiàn)有的五指毛桃飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并不完善，這不利于五指毛桃飲片的質(zhì)量控制及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。此外，五指毛桃飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面的文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道，故本研究參照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）和《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》[19]的相關(guān)規(guī)定，對(duì)不同產(chǎn)地的29批五指毛桃飲片進(jìn)行研究，以期為完善五指毛桃飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考和依據(jù)，同時(shí)也為五指毛桃配方顆粒及其相關(guān)制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；Direct-Q5UV超純水儀一體機(jī)（廣西南寧博美生物科技有限公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；DMB-1223型數(shù)顯生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、SX2-4-10型馬弗爐（沈陽(yáng)市節(jié)能電爐廠）；硅膠板G板（青島海洋化工有限公司）；HWS-28型恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；KQ-500E超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品和試劑 補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)：RP220515）、佛手苷內(nèi)酯對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)：HR21513B1）均購(gòu)于成都麥德生科技有限公司；色譜級(jí)甲醇[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；甲醇、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸、磷酸等均為分析純。

收集五指毛桃飲片共29批，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院朱意麟教授鑒定為?？浦参锎秩~榕Ficus hirta Vahl干燥根的加工品，樣品信息具體見(jiàn)表1。

表1 五指毛桃飲片樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀鑒別 本品呈類圓形或不規(guī)則的厚片，直徑0.5~8.0 cm。表皮灰棕色至紅褐色，細(xì)縱紋明顯，可見(jiàn)橫向皮孔。木部寬廣，黃白色，密布同心性環(huán)紋，皮部薄而韌，易與木部相剝離。質(zhì)硬而脆，斷面纖維性，氣微香，味微甘。（見(jiàn)圖1）

圖1 類圓形（A）及不規(guī)則形（B）的五指毛桃飲片

2.2 粉末顯微鑒別 本品粉末灰黃白色。石細(xì)胞散在或成群，直徑16~45 μm，孔溝明顯。草酸鈣方晶散在，直徑5~25 μm。淀粉粒眾多，多為復(fù)粒（2～5分粒），臍點(diǎn)圓點(diǎn)形，層紋不明顯，單粒呈類圓形或類橢圓形。木纖維多成束，壁厚。木栓細(xì)胞呈紅棕色，壁較厚。導(dǎo)管多為具緣紋孔導(dǎo)管。（見(jiàn)圖2）

圖2 五指毛桃飲片的粉末顯微圖

2.3 薄層鑒別 按2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）的薄層色譜法（通則0502）操作要求，取五指毛桃粉末（過(guò)2號(hào)篩）1 g，加乙醇15 mL，超聲（功率500 W）處理40 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即得供試品溶液。另取補(bǔ)骨脂素對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1.03 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別于日光和紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品與對(duì)照品在薄層板相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且斑點(diǎn)清晰，分離度良好，但不同批次樣品斑點(diǎn)的大小及顏色的深淺略有不同。（見(jiàn)圖3）

圖3 五指毛桃飲片在日光下（A）和熒光下（B）的薄層色譜圖

2.4 檢查 按照2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（四部）的水分測(cè)定法（通則0832，烘干法）、灰分測(cè)定法（通則2302）、浸出物測(cè)定法（通則2201，熱浸法），對(duì)29批五指毛桃飲片進(jìn)行測(cè)定，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 五指毛桃飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物檢測(cè)結(jié)果 （n=2）

結(jié)果表明，29批五指毛桃飲片水分、總灰分、酸不容性灰分及水溶性浸出物的含量范圍分別為5.67%~11.29%、1.90%~3.85%、0.06%~0.69%、5.71%~19.17%，其平均含量分別為8.02%、2.47%、0.23%和12.16%。按各檢測(cè)項(xiàng)平均值波動(dòng)20%的原則[20-21]，并綜合考慮產(chǎn)地氣候、生長(zhǎng)環(huán)境、采收加工、炮制加工、存儲(chǔ)條件等因素[22]的影響，擬定五指毛桃飲片的水分、總灰分和酸不溶性灰分分別不得超過(guò)12.0%、4.0%和0.7%，其水溶性浸出物不得低于6.0%。

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 對(duì)照品溶液的制備 取補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含補(bǔ)骨脂素100.4 μg、佛手柑內(nèi)酯50 μg的溶液，即得。

2.5.2 供試品溶液的制備 取五指毛桃飲片粉末約0.5 g（過(guò)5號(hào)篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5 mL水浴揮干，殘?jiān)蛹状? mL復(fù)溶，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 色譜條件 色譜柱為UltimateRXB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0~10 min，40%A~50%A；10~18 min，50%A~54%A；18~30 min，54%A~80%A；30~35 min，80%A~95%A；35~40 min，95%A）；柱溫為30 ℃；流速為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm；進(jìn)樣量為20 μL。對(duì)照品及供試品的色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照品溶液（A）和供試品溶液（B）的HPLC 圖

2.5.4 方法學(xué)考察 （1）線性關(guān)系的考察：精密取對(duì)照品溶液1、3、5、7、10 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，按“2.5.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得補(bǔ)骨脂素的回歸方程為Y=148 599X+61 866（R2=0.9 991），佛手柑內(nèi)酯的回歸方程為Y=71 096X+17 836（R2=0.9R997），表明補(bǔ)骨脂素與佛手柑內(nèi)酯分別在10.04~100.40 μg/mL和5~50 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（2）精密度試驗(yàn)：取五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。求得補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.18%、0.08%，表明儀器精密度良好。（見(jiàn)表3）

表3 精密度試驗(yàn)考察結(jié)果

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：稱取五指毛桃飲片（WT15），按“2.5.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.5.3”項(xiàng)下條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積。求得補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為2.08%、0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件分別于0、2、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。求得補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為0.73%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）加樣回收率試驗(yàn)：稱取已知補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯含量的五指毛桃飲片（WT15）9份，分別按補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯含量的80%、100%和120%加入相應(yīng)對(duì)照品，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄峰面積。求得補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯平均加樣回收率分別為101.23%和98.72%，RSD值分別為1.78%和2.12%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好。（見(jiàn)表4）

表4 五指毛桃飲片中補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的加樣回收率結(jié)果

2.5.5 樣品測(cè)定 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備各批次五指毛桃飲片的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件分別進(jìn)樣，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的含量。結(jié)果表明，29批五指毛桃飲片中補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的含量分別為0.01%~0.36%、0.01%~0.18%，平均含量分別為0.17%、0.05%。按平均含量下調(diào)20%的原則[20-21]，并在充分考慮中藥指標(biāo)性成分（有效成分）量值差異懸殊的基礎(chǔ)上，擬定五指毛桃飲片中補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯的含量分別不得低于0.02%、0.01%。（見(jiàn)表5）

表5 五指毛桃飲片中補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯的含量測(cè)定結(jié)果 （n=2）

2.6 特征圖譜

2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 同“2.5.1”項(xiàng)下方法。

2.6.2 供試品溶液的制備 同“2.5.2”項(xiàng)下方法。

2.6.3 色譜條件 同“2.5.3”項(xiàng)下色譜條件。

2.6.4 方法學(xué)考察 （1）精密度試驗(yàn)：按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。以4號(hào)峰為參照，求得11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值均＜3%，說(shuō)明儀器的精密度良好。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)：按“2.5.2”項(xiàng)下方法平行制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液6份，按“2.5.3”項(xiàng)下條件依次進(jìn)樣，記錄峰面積。以4號(hào)峰為參照，求得11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值均＜3%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)：按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備五指毛桃飲片（WT15）的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件分別于0、2、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄峰面積。以4號(hào)峰為參照，求得11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD值均＜3%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 特征圖譜的建立與共有峰的指認(rèn) 按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備29批五指毛桃飲片的供試品溶液，按“2.5.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》，以WT15色譜圖為參照，采用多點(diǎn)校正，以中位數(shù)法分別建立五指毛桃飲片的疊加圖譜和對(duì)照?qǐng)D譜，共確定11個(gè)共有峰，通過(guò)與對(duì)照品溶液比對(duì)，指認(rèn)4號(hào)、5號(hào)共有峰分別為補(bǔ)骨脂素和佛手柑內(nèi)酯。（見(jiàn)圖5）

圖5 五指毛桃飲片的HPLC 疊加特征圖譜（A）、對(duì)照特征圖譜（B）和對(duì)照品溶液（C）的HPLC 圖

2.6.6 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）》對(duì)29批樣品進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，29批樣品的相似度在0.917~0.998之間，說(shuō)明29批樣品與對(duì)照特征圖譜相似度較高。（見(jiàn)表6）

表6 五指毛桃飲片特征圖譜相似度結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)性成分 現(xiàn)代研究表明，五指毛桃含有多種化學(xué)成分[4,9]。其中以補(bǔ)骨脂素、佛手柑內(nèi)酯為代表的苯丙素類成分備受學(xué)者關(guān)注，是評(píng)價(jià)五指毛桃質(zhì)量的常見(jiàn)指標(biāo)性成分[23-24]。此外，補(bǔ)骨脂素可測(cè)性好，能夠以原型入血，且具有保肝作用[9]；佛手柑內(nèi)酯的抗衰老、抗炎作用與五指毛桃的藥理作用一致[25-27]。故本研究將補(bǔ)骨脂素和佛手苷內(nèi)酯作為五指毛桃飲片含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。

3.2 薄層色譜 本研究采用超聲提取法分別考察了不同溶劑（甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚）對(duì)五指毛桃飲片展開(kāi)效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、乙醚作為提取溶劑對(duì)薄層斑點(diǎn)數(shù)量、斑點(diǎn)大小的影響差異不大。鑒于乙醚是管制溶劑，乙醇較甲醇經(jīng)濟(jì)、安全，故選用乙醇作為制備薄層色譜供試品的溶劑。本研究比較了正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）[16]、正己烷-乙酸乙酯（體積比為4：1）[8]和環(huán)己烷-乙酸乙酯（5：2，V/V）[23]對(duì)供試品的展開(kāi)效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（體積比為20：0.4：0.5：0.7）為展開(kāi)劑時(shí)，供試品展開(kāi)后的斑點(diǎn)更加清晰，故選其作為展開(kāi)劑。

3.3 浸出物 中藥飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定應(yīng)以臨床應(yīng)用為導(dǎo)向，建立并完善符合中醫(yī)藥特點(diǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系[28]。湯劑以水為溶媒，是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用最早，也是目前中醫(yī)臨床中使用最廣泛的劑型[29]，故本研究測(cè)定五指毛桃飲片的水溶性浸出物。

3.4 含量測(cè)定

3.4.1 HPLC條件 本研究在確定HPLC流動(dòng)相時(shí)，分別對(duì)有機(jī)相（甲醇、乙腈）和水相（水及不同比例的甲酸水、乙酸水、磷酸水）進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于甲醇，乙腈出峰多而雜，且分離難度大，故選擇甲醇為有機(jī)相；磷酸水作為水相時(shí)，分離效果明顯優(yōu)于其他水相，且0.1%的磷酸水與0.2%的磷酸水對(duì)各峰分離效果無(wú)明顯差異，故最終選定甲醇、0.1%的磷酸水為HPLC的流動(dòng)相。

3.4.2 供試品的制備 本研究首先考察了提取方法（超聲提取、回流提?。⑻崛∪軇状?、乙醇）對(duì)HPLC圖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效果優(yōu)于乙醇，且超聲提取法和回流提取法對(duì)色譜峰的數(shù)量及峰面積的影響無(wú)明顯差異。鑒于超聲提取法操作簡(jiǎn)便，故本研究采用甲醇超聲法制備供試品。本研究繼而對(duì)甲醇濃度（50%、75%、100%）、提取時(shí)間（30、40、50、60 min）、料液比（20、50、100倍）、提取次數(shù)（1、2次）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度甲醇比低濃度甲醇提取效果好，提取40 min后色譜峰數(shù)量及峰面積無(wú)明顯變化，50倍與100倍料液比、提取1次和提取2次的提取效果均無(wú)明顯差異。鑒于此，本研究最終選定供試品的制備方法為50倍量甲醇超聲提取40 min。由于供試品直接進(jìn)樣，濃度偏低，故本研究采用濃縮、再?gòu)?fù)溶的方式對(duì)樣品進(jìn)行處理（具體見(jiàn)“2.5.2”項(xiàng)下內(nèi)容）。

3.5 特征圖譜 中藥是多成分、多靶點(diǎn)共同發(fā)揮藥效的復(fù)雜整體，單一指標(biāo)或幾個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)不能全面反映飲片的質(zhì)量。特征/指紋圖譜將中藥整體成分以一張圖譜的形式直觀地展現(xiàn)出來(lái)，具有信息量大、特征性強(qiáng)、整體性和模糊性的特點(diǎn)，特別適合中藥質(zhì)量的整體性評(píng)價(jià)[30]。本研究建立了五指毛桃飲片的HPLC特征圖譜，確定了11個(gè)共有峰，為五指毛桃飲片的整體質(zhì)量控制提供了參考。

3.6 現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)與本研究制定標(biāo)準(zhǔn)的比較 五指毛桃曾被1977年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）收載[13]，但其飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)卻未曾記載。本研究制定的五指毛桃飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與其現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)相比（見(jiàn)表7），完善了質(zhì)控指標(biāo)，提高了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于五指毛桃飲片的顯微鑒別，增加了淀粉粒的鑒別要求；優(yōu)化了薄層色譜供試品的制備方法，用乙醇替代了管制溶劑乙醚；相較于廣東飲片炮制規(guī)范，提高了五指毛桃飲片水分、酸不容性灰分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；以中醫(yī)臨床應(yīng)用為導(dǎo)向，制定了五指毛桃飲片水溶性浸出物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；新增了五指毛桃飲片的特征圖譜鑒定方法及其含量測(cè)定要求，從整體化學(xué)成分定性與指標(biāo)性成分定量相結(jié)合的角度進(jìn)一步完善了五指毛桃飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

表7 制定的五指毛桃飲片標(biāo)準(zhǔn)與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)的比較

綜上所述，本研究以不同產(chǎn)地的29批五指毛桃飲片為研究對(duì)象，對(duì)其各項(xiàng)質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行考察，完善了五指毛桃飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量的控制和評(píng)價(jià)提供了參考。