三物白散對(duì)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62表達(dá)的影響*

袁宇晴，龍 丹，謝超群，魏堰翀，劉旭東，朱 瑩，鄒君君

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

胃癌（gastric carcinoma，GC）是指原發(fā)于胃的上皮源性惡性腫瘤。胃癌是全球第五大惡性腫瘤，也是癌癥的主要致死原因之一[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)胃癌新發(fā)病例超過(guò)47.9萬(wàn)例，死亡病例達(dá)37.4萬(wàn)例，分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的44.0%和48.6%[2]。近年來(lái)，盡管在全球范圍內(nèi)胃癌的總體發(fā)生率有所下降，但我國(guó)作為胃癌高發(fā)國(guó)家，在惡性腫瘤中其發(fā)病率和死亡率均高居第2位，防治意義重大[1]。目前，胃癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與幽門螺桿菌感染、高鹽飲食、吸煙、飲酒等多種因素相關(guān)。胃癌的發(fā)生是綜合多個(gè)步驟和階段受多重因素相互影響作用的復(fù)雜過(guò)程，需要眾多基因的參與[3-4]。

早期GC可根據(jù)腫瘤侵犯深度，接受內(nèi)鏡下治療或手術(shù)治療，但大多數(shù)病例在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。目前放療、化療及靶向治療在GC治療方面的進(jìn)展并不明顯，而中醫(yī)藥在治療GC上有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中藥在改善癌癥患者的生活質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期方面發(fā)揮了不可或缺的作用，可通過(guò)抑制多藥耐藥性和減少副作用來(lái)提高療效[5-7]?！皽叵路ā敝委熚赴┑呐R床療效顯著。前期研究表明：經(jīng)方三物白散治療胃癌具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制仍不明確[8-10]。從“自噬”相關(guān)通路探討中醫(yī)藥治療胃癌的作用機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[11-13]。自噬基因BECN 1（Beclin1）是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，可正向調(diào)節(jié)自噬。上調(diào)Beclin1表達(dá)可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[14]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）是自噬性細(xì)胞死亡的特異性分子標(biāo)志物。當(dāng)自噬受到激活時(shí)，LC3通過(guò)被蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化成微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅰ（LC3-Ⅰ）的胞質(zhì)蛋白。LC3-Ⅰ再與磷脂酰乙醇胺相互作用，轉(zhuǎn)變成微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）的膜蛋白。因此LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的高低可反映自噬的激活情況[15-16]。自噬降解底物蛋白1（p62）可以作為一種底物蛋白，將廣泛蛋白運(yùn)送至自噬體內(nèi)并在自噬過(guò)程中被消耗。自噬活性越強(qiáng)，p62表達(dá)越低[17-18]。本實(shí)驗(yàn)基于三物白散對(duì)胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3、p62表達(dá)的影響，探究三物白散抗胃癌的作用機(jī)制，旨在為該方的臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞 28只SPF級(jí)雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量（200.76±8.24）g，采購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYCK（湘）2020-0038。喂養(yǎng)環(huán)境室溫保持在20～25 ℃，濕度50%～70%，12 h/12 h明暗光照，動(dòng)物自由進(jìn)食進(jìn)水，分籠飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（審批號(hào)：ZYFY20220530-04）。胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS細(xì)胞（Procell CL-0022）購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥物及試劑 三物白散混懸液由巴豆霜（含10%油）、浙貝母、桔梗（質(zhì)量比為1：3：3）組成。飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)藥學(xué)部鄧桂明研究員鑒定為正品。兔源一抗p62（批號(hào)：00059474）、兔源一抗LC3B（批號(hào)00044252）、鼠源一抗Beclin1（批號(hào)00063125）、鼠源一抗β-actin（批號(hào)：00110322）均購(gòu)自美國(guó)proteintech公司；miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：25722）、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：09623）購(gòu)自中國(guó)北京康為世紀(jì)有限公司。

1.3 主要儀器 磁力攪拌器（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號(hào)：JB-13）；低速離心機(jī)（上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司，型號(hào)：SL02）；電磁爐（荷蘭飛利浦電子公司，型號(hào)：HD4925）；電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-24DN）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-2C）；電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，型號(hào)：JJ224BC）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ChemiScope6100）；精密PH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號(hào)：PHS-3C）；生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司，型號(hào)：BioPrep-24）；水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCP-31DN）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湖南湘儀科學(xué)儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：H1650R）；旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：GL-88B）；搖床（其林貝爾儀器有限公司，型號(hào)：TS-1）；熒光PCR板（美國(guó)Thermofisher公司，型號(hào)：SPL0960）；熒光定量RCP儀（美國(guó)Thermofisher公司，型號(hào)：PIKOREAL96）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-40D）。

2 方法

2.1 藥物制備 根據(jù)本課題組前期研究方法[19-21]，將桔梗、浙貝打粉后，參照《傷寒論》原文，并參考《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算成大鼠給藥濃度，取含油量為10%的巴豆霜0.5 g、浙貝母1.5 g、桔梗1.5 g，混勻后加入超純水700 mL調(diào)節(jié)成0.005 g/mL的混懸液，封于玻璃瓶?jī)?nèi)，滅菌后4 ℃保存。

2.2 含藥血清制備 28只SPF級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量200~220 g，編號(hào)后根據(jù)體質(zhì)量用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為空白組、三物白散低劑量組、三物白散中劑量組、三物白散高劑量組，每組7只，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。灌胃開(kāi)始前，所有大鼠禁食12 h。三物白散低、中、高劑量組分別按0.031 25、0.062 5、0.125 0 g/（kg·d）劑量灌胃，空白組給予相同體積的生理鹽水，1 mL/（kg·d），1次/d，連續(xù)灌胃7 d。最后一次灌胃完成45 min后，將所有大鼠以0.3%戊巴比妥（10 mL/kg）麻醉。大鼠取仰臥位，“ V”型剪開(kāi)大鼠腹部皮膚，用小濾紙片輕輕地將腸管及脂肪推向鼠左側(cè)腹部，使其腹主動(dòng)脈充分暴露，采血針自下而上進(jìn)針，待進(jìn)針完成后，采血針另一側(cè)插入真空采血管中。采血結(jié)束后，將采血管室溫靜置1 h，以3 000 r/min（離心半徑為10 cm）離心15 min，然后用移液器吸取上層血清到新的離心管中。離心管置于56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，用0.22 μm微孔濾膜無(wú)菌過(guò)濾后，分裝于2 mL離心管，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 AGS細(xì)胞用10%的完全培養(yǎng)基（Ham's F 12營(yíng)養(yǎng)液+10%胎牛血清FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為空白對(duì)照組（空白組）、三物白散低劑量含藥血清組（低劑量組）、三物白散中劑量含藥血清組（中劑量組）、三物白散高劑量含藥血清組（高劑量組）。

2.4 CCK-8法檢測(cè)AGS細(xì)胞活性的影響 將生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞接種于6孔板中，經(jīng)PBS沖洗、胰酶消化、離心后，添加完全培養(yǎng)基，吹打均勻成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，使得細(xì)胞數(shù)為2×103個(gè)/孔，在96孔板最外一周的孔中加入100 μL PBS防止揮發(fā)。待細(xì)胞密度長(zhǎng)至50%~60%時(shí)高、中、低劑量組分別加入5%、10%、15%、20%的含藥血清，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，每孔加入10 μL的CCK-8溶液及試劑干預(yù)細(xì)胞，然后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h。孵育完成后用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。細(xì)胞活性=（實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值）/（對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

2.5 三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞形態(tài)變化的影響 將活性、形態(tài)均正常的AGS細(xì)胞用胰酶消化，分別接種于6孔板中，并于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入空白血清、低劑量含藥血清、中劑量含藥血清、高劑量含藥血清，干預(yù)48 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于0、48 h在倒置顯微鏡下觀察并拍照，比較細(xì)胞的形態(tài)變化。

2.6 LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá) 采用RT-qPCR法檢測(cè)LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA、Beclin1 mRNA表達(dá)。各組AGS細(xì)胞干預(yù)24、48 h后，使用Trizol、三氯甲烷、異丙醇提取細(xì)胞總RNA，紫光分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR進(jìn)行定量擴(kuò)增，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.7 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、p62蛋白表達(dá) 采用Western blotting法檢測(cè)LC3-Ⅱ、LC3-I、Beclin1、p62蛋白表達(dá)。各組AGS細(xì)胞干預(yù)24、48 h后，提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。于蛋白樣品中按比例加入上樣緩沖液，100 ℃水浴中變性5 min，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h后加入一抗（1：1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，二抗（1：5 000）室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊，采用One-Way ANOVA進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞活性的影響及最佳濃度的確定 當(dāng)處理時(shí)間相同時(shí)，5%、10%、15%、20%高、中、低劑量組AGS細(xì)胞活性顯著低于空白組（P＜0.01）；10%、15%、20%高劑量組AGS細(xì)胞活性低于5%高劑量組（P＜0.05或P＜0.01），20%中劑量組AGS細(xì)胞活性低于5%中劑量組（P＜0.01），15%、20%低劑量組AGS細(xì)胞活性低于5%低劑量組（P＜0.05）；20%高劑量組AGS細(xì)胞活性低于10%、15%高劑量組（P＜0.01），20%中劑量組AGS細(xì)胞活性低于10%中劑量組（P＜0.05），20%低劑量組AGS細(xì)胞活性低于10%低劑量組（P＜0.05）。（見(jiàn)表2～4）

表2 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

表2 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與5%高劑量組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與10%高劑量組比較，dP＜0.01；與15%高劑量組比較，eP＜0.01。

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表3 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

表3 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與5%中劑量組比較，bP＜0.01；與10%中劑量組比較，cP＜0.05。

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表4 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

表4 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，%）

注：與空白組比較，aP＜0.01，bP＜0.05；與5%低劑量組比較，cP＜0.05；與10%低劑量組比較，dP＜0.05。

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處理時(shí)間為48 h時(shí)，5%、10%、15%、20%高劑量組AGS細(xì)胞活性低于處理時(shí)間為24 h（P＜0.05或P＜0.01）；5%、15%中劑量組AGS細(xì)胞活性低于處理時(shí)間為24 h（P＜0.05或P＜0.01）；5%、10%、15%、20%低劑量組AGS細(xì)胞活性與處理時(shí)間為24 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖1～3）

圖1 不同濃度三物白散高劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，n=3）

圖2 不同濃度三物白散中劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，n=3）

圖3 不同濃度三物白散低劑量含藥血清對(duì)胃癌AGS 細(xì)胞活性的影響 （±s，n=3）

綜上所述，三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞有明顯抑制作用，與空白組比較，5%、10%、15%、20%三物白散高劑量含藥血清可呈濃度-時(shí)間依賴性抑制AGS細(xì)胞活性，故選用抑制細(xì)胞活性效果最佳的20%濃度開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞形態(tài)的影響 空白組細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞形態(tài)呈較規(guī)則的多邊形，細(xì)胞數(shù)量較多。與空白組比較，低、中、高劑量組細(xì)胞間連接逐漸疏松，排列逐漸錯(cuò)亂，細(xì)胞形態(tài)逐漸變細(xì)變長(zhǎng)，形態(tài)欠規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。中、高劑量組部分細(xì)胞變成碎片，培養(yǎng)基表面漂浮少量死細(xì)胞。（見(jiàn)圖4）

圖4 三物白散含藥血清對(duì)AGS 細(xì)胞形態(tài)的影響 （×10）

3.3 三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA表達(dá)的影響 高、中劑量組AGS細(xì)胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量高于空白組，p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于空白組（P＜0.01）；低劑量組AGS細(xì)胞LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)量高于空白組，p62 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于空白組（P＜0.01）。（見(jiàn)圖5）

圖5 三物白散含藥血清對(duì)AGS 細(xì)胞Beclin1 mRNA、LC3-ⅠmRNA、LC3-ⅡmRNA、p62 mRNA 表達(dá)的影響（±s，n=3）注：與空白組比較，aP＜0.01。

3.4 三物白散含藥血清對(duì)AGS細(xì)胞Beclin1、p62蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響 高劑量組AGS細(xì)胞Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于空白組，p62蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組（P＜0.01）；中劑量組AGS細(xì)胞Beclin1蛋白相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ高于空白組（P＜0.05或P＜0.01），p62蛋白相對(duì)表達(dá)量低于空白組（P＜0.01）。（見(jiàn)圖6～7）

圖6 LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、p62 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

圖7 三物白散含藥血清對(duì)AGS 細(xì)胞Beclin1、p62 蛋白表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的影響 （±s，n=3）

4 討論

中醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤病理的認(rèn)識(shí)基本達(dá)到共識(shí)，總結(jié)為“正”“邪”消長(zhǎng)兩方面，即“正勝則邪卻”和“邪盛則病進(jìn)”[22]。但治法上卻存在兩種觀點(diǎn)，即“扶正以祛邪”和“祛邪以扶正”?；谥嗅t(yī)理論“邪之所湊，其氣必虛”，“壯實(shí)人無(wú)積，虛人則有之”，中晚期腫瘤的治療主要應(yīng)用“扶正以祛邪”治則，選方用藥偏重補(bǔ)益[23-24]。此外，“祛邪以扶正”亦在中醫(yī)古籍中早有記載，如“堅(jiān)者削之”“結(jié)者散之”等[25]?！鞍Y瘕”“反胃”“積聚”等疾病包含了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)范疇的中晚期腫瘤。張從正從“扶正”的角度來(lái)探討“祛邪”治則，提出“先論其攻邪，邪去而元?dú)庾詮?fù)也”，“醫(yī)之道，損有余，乃所以補(bǔ)其不足也”，即為“不補(bǔ)之中有真補(bǔ)存焉”。下法能夠使“陳痤去而腸胃潔，癥瘕盡而榮衛(wèi)昌”，突出了“祛邪以扶正”的治療原則[26]。

三物白散首載于《傷寒論·辨太陽(yáng)病脈證并治》，即“寒實(shí)結(jié)胸，無(wú)熱證者，與三物小白散”[27]。三物白散作為溫下逐邪治法的經(jīng)典名方，由巴豆、貝母、桔梗組成。巴豆味辛、性熱，歸胃經(jīng)、大腸經(jīng)，有利水谷道之效，可破通五臟六腑久積之閉塞[28]；桔梗味苦、辛，性平，歸肺經(jīng)、胃經(jīng)，宣暢氣機(jī)，寬利胸膈，可破滯氣及積塊[29]；貝母味苦，性寒，歸肺經(jīng)、心經(jīng)，清熱化痰，散結(jié)解毒，散心胸久郁痰結(jié)[30]。全方藥簡(jiǎn)力專，能溫下寒實(shí)又不誤祛痰結(jié)邪氣。三物白散以攻伐為重點(diǎn)，但內(nèi)含桔梗作為“舟車之輯”，又有巴豆可以逐水，實(shí)則蘊(yùn)含了“其高者，因而越之；其下者，引而竭之”這一“因勢(shì)利導(dǎo)”的治療法則。這可理解為給邪以出路?，F(xiàn)代藥理研究表明，桔梗具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[31]。這可理解為方中所寓之“補(bǔ)”。

GC是指來(lái)源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常采取外科手術(shù)治療、化學(xué)治療或姑息療法[32]，但由于早期胃癌發(fā)現(xiàn)難度較高，且術(shù)后胃癌細(xì)胞擴(kuò)散轉(zhuǎn)移率高，外科手術(shù)治療存在較大風(fēng)險(xiǎn)及局限性。近年來(lái)，研究自噬對(duì)胃癌細(xì)胞的干預(yù)機(jī)制成為GC診療的新方向。自噬能夠有效抑制GC細(xì)胞的增殖、提高人體對(duì)化療靶向藥物的反應(yīng)敏感性[33-34]。自噬全程從啟動(dòng)直到其終止由數(shù)種蛋白質(zhì)分子共同調(diào)控。到目前為止，在酵母中發(fā)現(xiàn)的與自噬特異性調(diào)控有關(guān)的蛋白質(zhì)基因有四十余種，被稱為自噬相關(guān)蛋白（ATG）。絕大多數(shù)ATG在哺乳動(dòng)物的基因組之間同源性顯著。

Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因。Beclin1是自噬的正向調(diào)節(jié)基因，上調(diào)Beclin1的表達(dá)可以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。Beclin1既可以與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）相互結(jié)合，形成Beclin1-PI3KC3-Vps15復(fù)合體，促進(jìn)自噬發(fā)生，又可以與抗凋亡基因B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相互結(jié)合，形成Beclin1-Bcl-2復(fù)合體，抑制自噬活性。在特定情況下，c-Jun氨基末端激酶1能夠?qū)cl-2基因磷酸化，繼而與Beclin1基因分離，從而誘導(dǎo)自噬。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（MAPLC3）是酵母ATG8的同系物，可分為2種類型，分別為L(zhǎng)C3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，而LC3-Ⅱ主要存在于自噬體及自噬溶酶體膜上[35]。當(dāng)自噬受到激活時(shí)，LC3被蛋白酶水解，轉(zhuǎn)化成LC3-Ⅰ的胞質(zhì)蛋白。LC3-Ⅰ再與磷脂酰乙醇胺相互作用，轉(zhuǎn)變成LC3-Ⅱ的膜蛋白。因此，LC3是自噬性細(xì)胞死亡的特異性分子標(biāo)志物。LC3-Ⅱ與LC3-Ⅰ比值的高低可檢測(cè)自噬的發(fā)生[36]。p62在人體中又稱SQSTM1，可與極化調(diào)節(jié)蛋白非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C，a PKC）形成配體關(guān)系，是一種結(jié)構(gòu)域相當(dāng)豐富的蛋白，參與了眾多信號(hào)路徑的反應(yīng)[37]。p62可以作為一種底物蛋白，將廣泛蛋白運(yùn)送至自噬體內(nèi)并在自噬過(guò)程中被消耗，與自噬具有雙向性的調(diào)控作用。它可以激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白1（mammalian target of rapamycin 1，mTORC1）下調(diào)自噬活性，而自噬抑制反過(guò)來(lái)會(huì)導(dǎo)致它的聚集，進(jìn)一步加強(qiáng)自噬被抑制，最終導(dǎo)致p62的大量聚集[17]。

研究表明，加味三物白散方聯(lián)合化療能明顯提高胃癌患者的臨床受益率、遠(yuǎn)期生存率、生活質(zhì)量及對(duì)化療的耐受性[38]。三物白散含藥血清不僅能有效抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，還能通過(guò)Survivin基因沉默轉(zhuǎn)染，對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞起到誘導(dǎo)凋亡、抑制遷移的作用[39-40]。此外，徐力等[41]發(fā)現(xiàn)，三物白散加味方可以下調(diào)胃癌相關(guān)基因P53、Bcl-2、rasP21、CD44的表達(dá)，這可能是其抗胃癌的作用機(jī)制之一；王明艷等[42]發(fā)現(xiàn)，三物白散加味方可能通過(guò)阻滯胃癌SGC-7901細(xì)胞G2/M周期，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；王梅等[43]發(fā)現(xiàn)，三物白散可逆轉(zhuǎn)Th1/Th2的漂移，從而發(fā)揮抗腫瘤的免疫正向調(diào)節(jié)作用；王莉蘭等[44]發(fā)現(xiàn)，三物白散可調(diào)控TGF-β/Smad通路抑制TGF-β1，誘導(dǎo)胃癌SGC-7901細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在相同作用時(shí)間下，AGS細(xì)胞活性隨著三物白散含藥血清濃度的升高而降低。在三物白散含藥血清濃度為20%時(shí)，AGS細(xì)胞活性最低。在相同處理濃度下，細(xì)胞活性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，在48 h時(shí)細(xì)胞活性最低。說(shuō)明三物白散高劑量含藥血清可呈濃度-時(shí)間依賴性抑制AGS細(xì)胞活性。同時(shí)，隨著三物白散含藥血清濃度升高，細(xì)胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。此外，三物白散可上調(diào)Beclin1、LC3表達(dá)，下調(diào)p62的表達(dá)，誘導(dǎo)GC細(xì)胞自噬。

綜上所述，三物白散高劑量含藥血清能抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖，該效應(yīng)呈濃度-時(shí)間依賴性。三物白散可上調(diào)Beclin1、LC3表達(dá)，下調(diào)p62表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬。這可能是其抗胃癌作用機(jī)制之一。