TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)解析Rummeliibacillus suwonensis 3B-1 生長及己酸代謝機(jī)制

陳曉松 劉超杰 鄭佳 喬宗偉 羅惠波 鄒偉，2

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，宜賓 644005；2.中國輕工業(yè)濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜賓644007；3.宜賓五糧液股份有限公司，宜賓 644007）

白酒是一種傳統(tǒng)的蒸餾酒［1］，根據(jù)風(fēng)格的不同，可分為三大香型（濃香型、醬香型、清香型）和九種小香型（兼香型、鳳香型、米香型、藥香型、芝麻香型、豉香型、特香型、老白干香型、馥郁香型［2-3］）。濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)高達(dá)1 200 余種［4］，己酸乙酯為濃香型白酒的主體香味物質(zhì)，其含量高低決定了白酒的品質(zhì)和風(fēng)格的典型性。己酸菌作為濃香型白酒發(fā)酵過程中最為重要的功能微生物之一，其主要代謝產(chǎn)物為己酸，而己酸是合成己酸乙酯的前體物質(zhì)，因此己酸菌對(duì)白酒風(fēng)味的形成和白酒品質(zhì)的提高有著重要影響［5］。

己酸的合成依賴于乙醇的逆β-氧化（reverse β-oxidation, RBO）循環(huán)羧酸鏈延長。在該過程中，乙醇或乳酸作為電子供體被氧化為乙酰輔酶A［6-8］，然后與乙酸縮合生成丁酸，丁酸再與另一個(gè)乙酰輔酶A 縮合生成己酸［9-11］。水源拉梅爾芽孢桿菌首次發(fā)現(xiàn)于2013 年［12］，是拉梅爾桿菌屬物種，前期研究發(fā)現(xiàn)，水源拉梅爾芽孢桿菌在厭氧和好氧條件下均能正常生長，且主要代謝產(chǎn)物為己酸，然而該菌在厭氧和好氧條件下的生長與代謝差異及其機(jī)制尚未明確。

近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法發(fā)展迅速，基于TMT 的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是目前差異蛋白質(zhì)定量分析方法中通量最高、系統(tǒng)誤差最小、功能最強(qiáng)大的分析方法之一［13］，具有高靈敏度、高分離能力、高通量等特點(diǎn)。本研究以R.suwonensis 3B?1 為研究對(duì)象，利用TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析該菌株在厭氧和好氧條件下的蛋白質(zhì)差異，篩選與菌株生長及己酸代謝相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，在蛋白水平闡明氧氣對(duì)該菌生長的影響及其己酸代謝的分子機(jī)制，以期為水源拉梅爾芽孢桿菌的基因工程改造提供一定技術(shù)基礎(chǔ)，對(duì)提高水源拉梅爾芽孢桿菌的發(fā)酵能力具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 R.suwonensis 3B?1 分離自四川某濃香型酒廠窖泥。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株R.suwonensis 3B?1 的培養(yǎng)和發(fā)酵分別采用乙醇乙酸鈉培養(yǎng)基（ES 培養(yǎng)基）和乙醇乙酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基［14］。

1.2 方法

1.2.1 菌株R.suwonensis 3B?1 生長曲線的測定 將R.suwonensis 3B?1 活化好的種子液以5%的接種量接種至ES 培養(yǎng)基中，分別置于35℃厭氧工作站和35℃搖床中（200 r/min）培養(yǎng)，初期每隔12 h 測一次OD600nm值；在生長對(duì)數(shù)期，每隔6 h 測一次；平穩(wěn)期每隔2 h 測一次，直至繪制出完整的生長曲線。

1.2.2 菌株R.suwonensis 3B?1 發(fā)酵液的測定 使用氣相質(zhì)譜（GC?MS）分別測定好氧與厭氧條件下發(fā)酵液中丁酸和己酸的含量。將R.suwonensis 3B?1 種子液接種至ES 液體培養(yǎng)基中，分別置于35℃厭氧工作站和35℃搖床中（200 r/min）培養(yǎng)10 d，完成發(fā)酵。取發(fā)酵液通過0.22 μm 有機(jī)相濾膜收集至EP管內(nèi)，以5 000 r/min 離心10 min，吸取1 mL 離心后的發(fā)酵液于進(jìn)樣瓶進(jìn)行樣品含量的測定。

1.2.3 菌株R.suwonensis 3B?1 樣品的制備 具體的制備步驟如下：（1）吸取厭氧條件下培養(yǎng)且處于對(duì)數(shù)生長期的9 mL 菌液至10 mL 已滅菌離心管中，轉(zhuǎn)速5 000 r/m，離心5 min 后收集菌體。（2）菌體沉淀后，加入1 mL xPBS 緩沖液（購自Thermo 公司），混合均勻，于7 000 r/min 下離心5 min，收集菌體，重復(fù)2-3 次，直至離心后的上清液呈現(xiàn)澄清透明的狀態(tài)。（3）舍棄上清液，保留沉淀，記錄每個(gè)樣品的名稱與編號(hào)，將樣品放于裝滿干冰的泡沫箱內(nèi)，密封后送至上海派森諾公司進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 蛋白樣品的提取和肽段酶解 （1）采用SDT 裂解法提取樣品；（2）采用二喹啉甲酸（bicin?choninic acid，BCA）法定量蛋白；（3）采用FASP（filter?aided sample preparation）法進(jìn)行胰蛋白酶酶解；（4）用C18Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽；（5）肽段定量（OD280nm）［15］。

1.2.5 TMT 標(biāo)記 各樣品分別取100 μg 肽段，按照Thermo 公司TMT 標(biāo)記試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。

1.2.6 基于LC?MS/MS 的數(shù)據(jù)采集 采用納升流速的 HPLC 液相系統(tǒng) Easy nLC 對(duì)每份樣品進(jìn)行分離。緩沖液 A 液為 0.1%甲酸水溶液， B 液為 0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈為 84%）。色譜柱以 95%的 A 液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱（Thermo Sci?entific Acclaim PepMap100, 100 μm×2 cm, nanoVi?per C18），經(jīng) 過 分 析 柱（Thermo scientific EASY col?umn, 10 cm, ID7 5 μm, 3 μm, C18?A2）分 離，流 速 為300 nL/min。

樣品經(jīng)色譜分離后用 Q?Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測方式為正離子，母離子掃描范圍 300-1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為 70 000（200 m/z），AGC（automatic gain control）target 為 1×106，Maxi?mum IT 為 50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為 60.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集 20 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），MS2 activation type 為HCD，isolation window 為2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率17 500（200 m/z），normalized collision energy 為30 eV，underfill 為 0.1%［16］。

1.2.7 蛋白質(zhì)鑒定與定量分析 采用Proteome Discoverer 1.4 和Mascot 2.2 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行質(zhì)譜分析，便于查庫鑒定及定量分析［17］。

1.2.8 生物信息學(xué)分析 將鑒定到的蛋白質(zhì)序列分別與亞細(xì)胞定位、基因本體論（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、STRING 或 IntAct 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得蛋白在各數(shù)據(jù)庫的注釋信息，分析DEPs 互相作用關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 菌株生長及代謝情況

如圖1?A 所示，就菌體生長而言，好氧條件下，菌株R.suwonensis 3B?1 的生長速度明顯快于厭氧條件，最大生物量約為厭氧條件下的2 倍，但二者達(dá)到最大生長量的時(shí)間基本相同；菌株R.suwonensis 3B?1 的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量如圖1?B 所示，在厭氧條件下，該菌株的丁酸、己酸產(chǎn)量都高于好氧條件下的產(chǎn)量，其中，丁酸產(chǎn)量提高了1.14 倍，己酸產(chǎn)量提高了1.97 倍。

圖1 3B-1 好氧和厭氧條件生長及代謝情況Fig.1 Growth and metabolism of 3B-1 under aerobic and anaerobic conditions

2.2 蛋白樣本質(zhì)控

經(jīng)BCA 法測定比較組蛋白濃度，結(jié)果如表1 所示，蛋白定量結(jié)果顯示，好氧條件下（RH1?RH3）的菌株蛋白總量普遍高于厭氧條件（RY1?RY3）。取一定量蛋白樣本進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS?PAGE），經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖2?A 所示，所有樣品蛋白完整性較好，條帶組間不平行，組內(nèi)相對(duì)平行，條帶清晰，蛋白量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。肽段離子質(zhì)量偏差分布、肽段離子得分分布分別如圖2?B、2?C 所示，所有鑒定肽段的質(zhì)量偏差主要分布在10 ppm 以內(nèi)，結(jié)合嚴(yán)格的分析工具M(jìn)ASCOT 對(duì)MS 圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，圖2?C顯示，超過69.37%的肽段得分大于20 分，肽段得分中位數(shù)為30 分。

表1 BCA 蛋白定量結(jié)果Table 1 BCA protein quantification results

圖2 蛋白樣品質(zhì)量控制Fig.2 Quality control of protein sample

2.3 蛋白鑒定及定量分析

由圖3?A 可知，經(jīng)Mascot 2.2 鑒定和Proteome Discoverer 1.4 定量分析共獲得623 624 張總譜圖（total spectra）。其中蛋白譜圖（spectra）26 634 張；肽段（peptide）數(shù)量為7 675 個(gè)，其中特有肽段（unique peptide）數(shù)量為5 573 個(gè)；蛋白（protein）數(shù)量為1 804 個(gè)，定量到的蛋白數(shù)量為1 803 個(gè)。以表達(dá)倍數(shù)（fold change, FC）大于1.2 倍或小于0.83（上調(diào)大于1.2 倍或下調(diào)小于0.83 倍）且P value＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較組間DEPs 篩選，結(jié)果見圖3?B，篩選獲得總差異表達(dá)蛋白810 個(gè)，其中顯著上調(diào)蛋白423 個(gè)，顯著下調(diào)蛋白387。DEPs 火山圖如圖3?C所示，其中顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)標(biāo)注為藍(lán)色，顯著上調(diào)標(biāo)注為紅色，無差異則為灰色；采用層次聚類算法（hierarchical cluster）對(duì)比較組DEPs 進(jìn)行分層聚類分析，結(jié)果如3?D 所示，好氧組內(nèi)（RH?1、RH?2和RH?3）差異蛋白表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)趨勢較一致，RH?1 和RH?3 先聚為一類，再與RH?2 聚為一類；厭氧組內(nèi)（RY?1、RY?2 和RY?3）差異蛋白表達(dá)量的上調(diào)和下調(diào)趨勢較一致，與好氧組組間的表達(dá)趨勢相反，RY?1 和RY?2 先聚為一類，再和RY?3 聚為一類，最終形成與好氧組明顯不同的簇。

圖3 蛋白鑒定和差異表達(dá)結(jié)果Fig.3 Results of protein identification and differential expression

2.4 差異表達(dá)蛋白功能注釋

利用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件CELLO 對(duì)DEPs 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，725 個(gè)DEPs 定位到6 個(gè)條目上，分別是細(xì)胞質(zhì)（cytoplasmic）蛋白567 個(gè)，細(xì)胞膜（cytoplasmic membrane）蛋白138 個(gè)，細(xì)胞壁（cellwall）蛋白9 個(gè)以及其他蛋白11 個(gè)［胞外（extracellular）蛋白6 個(gè)，孢子（spore）蛋白3 個(gè)和鞭毛（flagellar）蛋白2 個(gè)］；對(duì)DEPs 進(jìn)行GO 功能注釋，結(jié)果如圖4?A 所示，生物過程（biological process）方面主要涉及細(xì)胞過程（cellular process）蛋白394 個(gè)，代謝過程蛋白（metabolic process）373 個(gè)，生物調(diào)節(jié)蛋白（biological regulation）65 個(gè)等；分子功能（molecular function）方面主要涉及催化活性（catalytic activity）蛋白478 個(gè)，結(jié)合功能（binding）蛋白413 個(gè)和結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）蛋白55 個(gè)等；細(xì)胞組分（cellular component）方面主要涉及細(xì)胞（cell）蛋白280 個(gè)，細(xì)胞部分（cell part）蛋白276 個(gè)和細(xì)胞膜（membrane）蛋白55 個(gè)等。對(duì)DEPs 進(jìn)行GO 功能富集分析，GO 三大分類下的GO 條目富集情況結(jié)果如圖4?B-D 所示，在該比較組中細(xì)胞酰胺代謝過程（cellular amide metabolic process）、肽的生物合成過程（peptide biosynthetic process）、翻譯（translation）和肽代謝過程（peptide metabolic process）等生物學(xué)過程；核糖體的結(jié)構(gòu)組成（structural constituent of ribosome）、結(jié)構(gòu)分子活性（structural molecule activity）、rRNA、RNA 結(jié) 合（rRNA binding、RNA binding）和嘌呤核苷結(jié)合（purine nucleoside binding）等分子功能；核糖體（ribosome）、核糖核蛋白復(fù)合物（ribonucleoprotein complex）、細(xì)胞質(zhì)部分（cytoplasmic part）和細(xì)胞內(nèi)非膜結(jié)合細(xì)胞器（intracellular non?membrane?bounded organelle）等細(xì)胞組分發(fā)生了顯著變化。

圖4 比較組DEPs 的GO 注釋圖Fig.4 GO annotation map of DEPs in comparative group

2.5 差異表達(dá)蛋白KEGG注釋

將所有DEPs 進(jìn)行KEGG 代謝通路注釋，結(jié)果如圖5 所示，其中DEPs 主要參與的通路為核糖體（56 個(gè),且全部上調(diào)），輔因子生物合成（44 個(gè)，上調(diào)25 個(gè)，下調(diào)19 個(gè)），雙組分系統(tǒng)（30 個(gè)，上調(diào)8個(gè)，下調(diào)22 個(gè)）和ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（24 個(gè)，上調(diào)13個(gè)，下調(diào)11 個(gè)）等途徑。在碳水化合物代謝中，厭氧條件顯著提高了磷酸戊糖代謝通路中蛋白的表達(dá)，其中有10 個(gè)DEPs 的表達(dá)量上調(diào)，6 個(gè)下調(diào)；淀粉和蔗糖代謝（HAD 家族磷酸酶），糖酵解/糖異生代謝通路［果糖二磷酸醛縮酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ATP）］中的DEPs 表達(dá)量上調(diào)。在氨基酸代謝中，厭氧條件降低了氨基酸降解酶的表達(dá)，如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等。在能量代謝中，涉及氧化磷酸化（NADH：醌還原酶、無機(jī)焦磷酸酶、F 型H+轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 酶亞基a 等）和硫代謝（半胱氨酸合成酶、硫轉(zhuǎn)移酶等）途徑中的DEPs 表達(dá)量上調(diào)。

圖5 KEGG 富集代謝通路Fig.5 KEGG enriched metabolic pathways

2.6 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

利用CytoScape 軟件構(gòu)建比較組DEPs 相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，如圖6?A 所示，關(guān)聯(lián)度排名前20位的蛋白如圖6?B、表2 所示，其中關(guān)聯(lián)度最高的是苯丙氨酸?tRNA 連接酶β 亞基（A0A3N6AUL8），關(guān)聯(lián)度為149；其次是核黃素生物合成蛋白R(shí)ibD（A0A143HEW7），關(guān)聯(lián)度為147，兩者在厭氧條件下均呈下調(diào)特征。呈上調(diào)特征的DEPs 主要集中在5-13 位，關(guān)聯(lián)度為105 左右。

表2 比較組蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)聯(lián)度最高的20 個(gè)蛋白質(zhì)Table 2 Top 20 proteins with the highest correlation in the interaction network of DEPs

圖6 比較組DEPs 互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果Fig.6 Results of the interaction network analysis of DEP in the comparative groups

3 討論

3.1 菌株R.suwonensis 3B?1的生長情況

菌株R.suwonensis 3B?1 在好氧和厭氧條件下，表現(xiàn)出明顯的生長和代謝差異，本研究通過對(duì)DEPs 的挖掘發(fā)現(xiàn)，DEPs 主要與代謝過程相關(guān)，包括能量代謝、碳水化合物代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝等，其中糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)和丙酮酸代謝是DEPs 最集中的代謝通路。厭氧條件下，影響糖酵解/糖異生通路的主要上調(diào)蛋白為磷酸甘油酸激酶（A0A511C542）和磷酸丙酮酸水合酶（A0A3N6AA05）。作為糖酵解/糖異生通路的關(guān)鍵酶，磷酸甘油酸激酶在催化三磷酸腺苷（ATP）的形成中有著至關(guān)重要的影響［18］，為菌株的后續(xù)生長代謝提供能量，其表達(dá)量的上調(diào)使菌株的能量供應(yīng)得到保障。磷酸丙酮酸水合酶是一種多功能酶，可通過催化2?磷酸?D?甘油酸脫水生成磷酸烯醇丙酮酸［19］，該酶在厭氧條件下的表達(dá)上調(diào)，使得菌株3B?1 內(nèi)的磷酸烯醇丙酮酸產(chǎn)量高于好氧條件。主要下調(diào)蛋白為丙酮酸脫氫酶（A0A3N5ZV13）和丙酮酸激酶（A0A3N5ZTV7），丙酮酸脫氫酶可減弱丙酮酸對(duì)2?羥基-乙基?Thpp 的抑制作用［20］，由于其在厭氧條件下的表達(dá)量下調(diào)，使得菌株體內(nèi)的丙酮酸含量較低。丙酮酸激酶在調(diào)節(jié)丙酮酸的合成與代謝中起著重要作用，可催化磷酸烯醇丙酮酸和ADP轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ATP［21］，該酶表達(dá)量的下調(diào)，導(dǎo)致菌株體內(nèi)丙酮酸和能量供應(yīng)不足。此外，丙酮酸激酶還是糖酵解途徑中的限速酶，其表達(dá)量的下調(diào)導(dǎo)致菌株在厭氧條件下的生長發(fā)育緩慢。

雙組分系統(tǒng)富集到較多的DEPs，其中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白R(shí)esD 通過接收環(huán)境信號(hào)并調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與菌體的適應(yīng)性反應(yīng)和生理調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)，ResD 在調(diào)控有氧和無氧呼吸過程中起著重要作用［22-23］，該蛋白在厭氧條件下呈下調(diào)趨勢，符合菌株3B?1 在厭氧條件下的生長特征。在氨基酸和輔因子合成途徑中，厭氧條件導(dǎo)致菌株在亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等氨基酸代謝和硫胺素代謝結(jié)合蛋白（A0A3N5ZSI0）、生物素蛋白連接酶（A0A3N5ZTP5）的表達(dá)呈現(xiàn)下調(diào)特征，這可能表明菌株3B?1 更適合在好氧環(huán)境中生長。在蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)高關(guān)聯(lián)度的蛋白：苯丙氨酸?tRNA連接酶β 亞基和核黃素生物合成蛋白R(shí)ibD，兩者在厭氧條件下均呈下調(diào)特征。苯丙氨酸?tRNA 連接酶β 亞基主要參與在核糖體中的mRNA 分子蛋白質(zhì)的生物合成，其通過與ATP、鎂離子、鋅離子或tRNA結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能［24］，該蛋白在厭氧條件下呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，導(dǎo)致該菌株在厭氧條件下對(duì)于鎂離子、鋅離子的結(jié)合能力較弱，從而影響相應(yīng)的生物學(xué)功能。核黃素生物合成蛋白R(shí)ibD 主要參與核黃素的生物合成［25-26］，該蛋白表達(dá)量的下調(diào)導(dǎo)致菌株在核黃素的生物合成方面能力較弱。

厭氧條件下，糖酵解階段丙酮酸脫氫酶和丙酮酸激酶表達(dá)量的下調(diào)，導(dǎo)致菌株R.suwonensis 3B?1的能量供應(yīng)量及丙酮酸合成量較低，加之相關(guān)氨基酸代謝和輔因子生物合成相關(guān)蛋白表達(dá)量的下調(diào)，進(jìn)而影響菌株R.suwonensis 3B?1 的生長發(fā)育，圖1?A也表明菌株R.suwonensis 3B?1 的最大生物量和生長速度低于好氧條件。綜上所述，菌株R.suwonensis 3B?1 更適合在好氧條件下生長。

3.2 菌株R.suwonensis 3B?1的代謝差異

菌株R.suwonensis 3B?1 在好氧和厭氧條件下的生長與其代謝產(chǎn)物產(chǎn)量有著明顯差異：相較于好氧條件，厭氧條件下的菌體生物量和生長速度有著明顯下降，但是己酸、丁酸的產(chǎn)量卻表現(xiàn)為上升。為從蛋白水平闡述此差異的分子機(jī)制，本研究著重關(guān)注菌株3B?1 己酸代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并構(gòu)建了己酸代謝通路圖（圖7）。乙酰輔酶A 是連接糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)和己酸代謝途徑的關(guān)鍵代謝物，其積累量在一定程度上影響菌體的生長發(fā)育和己酸代謝。在糖酵解/糖異生途徑中，由于丙酮酸激酶表達(dá)量的下調(diào)，導(dǎo)致由磷酸烯醇丙酮酸生成丙酮酸的速率較低，因此乙酰輔酶A 的積累量較少，但磷酸丙酮酸水合酶的上調(diào)，可催化2?磷酸?D?甘油酸脫水生成磷酸烯醇丙酮酸，使得磷酸烯醇丙酮酸在菌株體內(nèi)大量積累。同時(shí)，三羧酸循環(huán)途徑中各催化酶的表達(dá)量均呈現(xiàn)上調(diào)，可由此積累大量的草酰乙酸，由三羧酸循環(huán)生成的草酰乙酸可由磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶催化生成磷酸烯醇丙酮酸［27］，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶在厭氧條件下呈上調(diào)特征，使得磷酸烯醇丙酮酸在菌株體內(nèi)進(jìn)一步積累，并將三羧酸循環(huán)和糖酵解/糖異生途徑偶聯(lián)，為后續(xù)乙酰輔酶A 的生成提供豐富的前體物。此外，厭氧條件顯著提升了磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，由磷酸戊糖途徑會(huì)生成大量的NADPH 和磷酸核糖［28］，而己酸的合成依賴于乙醇的逆β-氧化循環(huán)羧酸鏈延長，此過程需要豐富的還原當(dāng)量和乙酰輔酶A［29-30］，磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)上調(diào)為己酸合成提供大量的NADPH?？梢哉f，糖酵解/糖異生、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖代謝途徑為后續(xù)己酸代謝提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量供應(yīng)。在己酸代謝通路中，乙酰輔酶A 乙酰轉(zhuǎn)移酶（A0A3N6AQ32）的蛋白表達(dá)量有所降低，可能由于菌株在厭氧條件生長初期，乙酰輔酶A 的產(chǎn)量和積累量相對(duì)較少，菌株首先用其滿足生長發(fā)育需求。與之相似的是3?羥基丁酰輔酶A 脫氫酶（A0A3N5ZT88），該酶的表達(dá)量也呈現(xiàn)下調(diào)，因?yàn)樵趨捬鯒l件初期，基礎(chǔ)的生長代謝仍然不充分，沒有足夠的物質(zhì)準(zhǔn)備，無法進(jìn)行后續(xù)的己酸代謝。酰基輔酶A 硫酯酶（A0A3N6BPG2）可催化己酰輔酶A 生成己酸［31］，該酶在厭氧條件下呈現(xiàn)上調(diào)，在菌株完成相應(yīng)的物質(zhì)準(zhǔn)備后，由此催化己酰輔酶A 生成己酸，從而提高己酸的產(chǎn)量。

圖7 DEPs 在中心代謝和己酸代謝途徑中的分布Fig.7 Distribution of DEPs in the central metabolic and caproic acid metabolic pathways

4 結(jié)論

在厭氧與好氧條件下，在R.suwonensis 3B?1 中共鑒定到810 個(gè)DEPs，其中上調(diào)蛋白423 個(gè)，下調(diào)蛋白387 個(gè)。在厭氧條件下，亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等氨基酸代謝呈現(xiàn)下調(diào)特征，硫胺素結(jié)合蛋白、生物素蛋白連接酶等輔因子表達(dá)下調(diào)，同時(shí)，苯丙氨酸?tRNA 連接酶和核黃素生物合成蛋白的下調(diào)進(jìn)一步表明該菌更適合在好氧環(huán)境中生長。在己酸合成方面，?；o酶A 硫酯酶的表達(dá)量顯著上調(diào)，此外，糖酵解/糖異生途徑、三羧酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑為己酸合成提供了充足的前體物質(zhì)和還原當(dāng)量，共同促進(jìn)了己酸合成。