產(chǎn)胞外多糖多功能促生菌的篩選鑒定及促生評價

常海霞 李明源 麥日艷古·亞生 周茜 王繼蓮

（1.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，喀什 844000；2.新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點實驗室，喀什 844000）

隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，土壤耕作強度逐年增加，土壤板結(jié)、鹽堿化等問題日益嚴(yán)重。如何改善土壤結(jié)構(gòu)，提升土壤肥力是目前亟待解決的重要問題。早期土壤修復(fù)主要通過水利工程、物理化學(xué)改良等措施，但存在一定局限性，難以兼顧土壤改良和植物促生的雙重效果［1］。研究表明，通過化肥施加、地膜覆蓋等方式可改變土壤物理結(jié)構(gòu)、降低水分蒸散量，但極易導(dǎo)致二次污染，影響土壤內(nèi)部環(huán)境營養(yǎng)之間的平衡，對植物生境造成嚴(yán)重破壞［2-3］。在此背景下，對土壤有更好增益效果的微生物改良備受研究者青睞。如Liu 等［4］發(fā)現(xiàn)改變土壤中優(yōu)勢細(xì)菌的豐度，可提高土壤養(yǎng)分有效性；配合施用AM真菌能夠改良鹽漬土壤物理結(jié)構(gòu)，并增加土壤大團聚體的比例，進而促進植物生長［5］?？梢娢⑸镌谥参锎偕巴寥澜Y(jié)構(gòu)改良方面具有一定應(yīng)用潛力，可達(dá)到植物-土壤雙控的目的。

某些微生物在代謝過程中可分泌胞外多糖（exopolysaccharides, EPS），它們在單糖組成、連接方式上呈現(xiàn)出多樣性，這賦予菌株豐富的功能性和獨特的生物學(xué)活性［6］，保護其免受外界損傷［7］。胞外多糖還是一種很好的生物源肥料，外源施加可有效激活植物自身潛在的防御機制，保護其不受環(huán)境波動和干旱、鹽堿、重金屬等非生物脅迫影響［8-9］。如Sun 等［10］發(fā)現(xiàn)駱駝刺（Alhagi sparsifolia）內(nèi)生細(xì)菌NX?11 通過分泌胞外多糖減輕了鹽脅迫對水稻幼苗的損害；Ghazala 等［11］將產(chǎn)胞外多糖混合菌劑接種小麥，顯著提高了其在水分脅迫下的抗氧化能力。可見，挖掘產(chǎn)胞外多糖菌株作為生物接種劑，是提高植物抗逆性的一項有效策略［12-14］。但目前高產(chǎn)胞外多糖的菌種資源相對匱乏，且多數(shù)為非鹽堿環(huán)境下獲得，導(dǎo)致胞外多糖促生菌的開發(fā)應(yīng)用受到極大限制［15］。目前已發(fā)現(xiàn)46 屬76 種微生物能夠分泌胞外多糖，但被廣泛應(yīng)用的卻只有十幾種，科學(xué)家們也試圖用基因工程手段構(gòu)建高產(chǎn)胞外多糖菌株，但收效甚微。因此，進一步開展產(chǎn)胞外多糖菌株資源的篩選，并將其應(yīng)用于鹽堿環(huán)境就顯得尤為重要。

本研究擬從新疆南疆鹽堿植物根際土壤中分離篩選產(chǎn)胞外多糖菌株，并基于單因素和響應(yīng)面實驗對高產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，以進一步提高其多糖產(chǎn)量。通過考察產(chǎn)胞外多糖菌株對鹽堿土中植物的促生效果及土壤團聚體的作用，為鹽堿土壤改良提供優(yōu)良菌種資源，為解析產(chǎn)胞外多糖菌株的促生機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究區(qū)況及樣品采集 研究區(qū)位于新疆喀什地區(qū)鹽堿草地（76°10'92″E，39°44'18″N），該地區(qū)全年干旱少雨，蒸發(fā)強烈，鹽堿面積大。2023 年2 月，在該地區(qū)共采集了鹽節(jié)木（Halocnemum stro?bilaceum）、鹽爪爪（Kalidium foliatum）、旱生蘆葦（Phragmites australis）、駱駝刺（Alhagi sparsifolia）、鹽生草（Halogeton glomeratus）等5 種鹽堿植物根際土壤樣本。采集方法為多點混合采樣法，除去表層浮土，挖出整株根系，抖落根系附著的松散土壤后封裝于自封袋，4℃條件下帶回實驗室用于菌株分離。

盆栽試驗所用土壤取自喀什郊區(qū)未開墾鹽堿地，pH 值為8.32，全鹽含量為1.95 g/kg，堿解氮、速效鉀和有效磷含量分別為23.81 mg/kg、96.34 mg/kg、12.06 mg/kg，有機質(zhì)含量為13.58 g/kg。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株分離采用LB 培養(yǎng)基［16］；解磷能力測定采用NBRIP 無機磷培養(yǎng)基和Mongina 有機磷培養(yǎng)基［17］；固氮能力測定采用Ashby 固體培養(yǎng)基［18］；產(chǎn) 吲 哚?3?乙 酸（indole?3?acetic acid, IAA）能力檢測采用King’s B 培養(yǎng)基［19］；產(chǎn)鐵載體能力檢測采用CAS 檢測培養(yǎng)基［20］。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L。

產(chǎn)糖發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油12.5 mL/L，蛋白胨9.0 g/L，酵母粉5.5 g/L，CaCO35.1 g/L。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)胞外多糖菌株的篩選 稱取根際土壤樣品10 g，置于90 mL 無菌水中，30℃、180 r/min 振蕩30 min。將土壤懸液梯度稀釋后涂布LB 平板，37℃倒置培養(yǎng)48 h。菌落黏稠，且用牙簽挑取后呈拉絲狀的初步認(rèn)定為產(chǎn)胞外多糖菌株［21］。將胞外多糖菌株接種至LB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)特征，并多次劃線純化。

1.2.2 菌株鑒定 用裂解液（Lysis Buffer for Mi?croorganism to Direct PCR, TaKaRa）提取產(chǎn)胞外多糖菌株的基因組DNA，采用16S rRNA 通用引物27F（5'?AGAGTTTGATCMTGGCTCAG?3'）和1492R（5'?TACGGYTACCTTGTTACGACTT?3'）對菌株進行PCR 擴增［17］。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由楊凌天潤奧科生物科技有限公司完成測序。將返回序列提交至EzBioCloud 數(shù)據(jù)庫進行同源性比對，選擇同源性較高的同源序列，使用MEGA 11.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 胞外多糖含量測定 將產(chǎn)胞外多糖菌株搖床培養(yǎng)48 h 后，用乙醇沉淀法提取發(fā)酵液粗多糖［22］。將10 mL 發(fā)酵液置于50 mL 離心管中，低溫離心去除菌體后，取上清液加入2 倍體積的預(yù)冷乙醇，4℃靜置12 h 后10 000 r/min 離心10 min。所得沉淀用蒸餾水溶解定容，即為粗多糖溶液，用苯酚-硫酸法測定其OD490吸光值［23］。以不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL）制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線［23］，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌株產(chǎn)多糖含量。

1.2.4 其他促生性能測定

1.2.4.1 固氮能力測定 采用點接法，用無菌牙簽將產(chǎn)胞外多糖菌株接種于Ashby 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h，觀察菌株長勢，能在培養(yǎng)基上正常生長的即為固氮菌［18］。

1.2.4.2 分泌IAA 能力測定 將菌株在King’s B 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，采用Salkowski 比色法進行顯色反應(yīng)，若顏色呈現(xiàn)粉色則表示能分泌IAA［24］。將陽性菌株接種于King’s B 液體培養(yǎng)基，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，12 000 r/min 離心5 min。取一定體積上清液加入Salkowski 顯色劑，以未接菌的King’s B液體培養(yǎng)基為對照，28℃避光放置30 min 測定OD530吸光值［24］。將上述方法以不同濃度的IAA 稀釋液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定發(fā)酵液中IAA 含量。

1.2.4.3 產(chǎn)鐵載體能力測定 將菌株點接在CAS 檢測平板上培養(yǎng)96 h，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈，有橙色暈圈即表示該菌株能夠產(chǎn)鐵載體［20］。

1.2.4.4 溶磷能力測定 將待測菌株分別接種于NBRIP 無機磷培養(yǎng)基和Mongina 有機磷培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察溶磷圈形成情況［25］。將陽性菌株接種于LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)24 h 后，按1%接種量分別接入Mongina 和NBRIP 液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)7 d，用鉬銻抗比色法測定有效磷濃度［25］。

1.2.5 單因素優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基

1.2.5.1 碳源種類優(yōu)化 分別以1%的甘油、甘露醇、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，每個處理3 次重復(fù)。將最高產(chǎn)胞外多糖菌株種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接到置換碳源后的培養(yǎng)基中，25℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h，以胞外多糖產(chǎn)量為評價指標(biāo)，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)糖的最適碳源。

1.2.5.2 氮源種類優(yōu)化 分別以1.5%的玉米粉、蛋白胨、硫酸銨、尿素、酵母粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨+酵母粉，每個處理3 次重復(fù)。將種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接于置換氮源后的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)糖的最適氮源。

1.2.5.3 無機鹽種類優(yōu)化 分別以0.5%的K2HPO4、MgSO4、MnSO4、CaCO3、K2HPO4+MgSO4替 代 基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NaCl，每個處理3 次重復(fù)。將種子液按1%接種量轉(zhuǎn)接于置換無機鹽后的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)糖的最適無機鹽種類。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株發(fā)酵產(chǎn)糖培養(yǎng)基 根據(jù)單因素結(jié)果，以甘油為最優(yōu)碳源，蛋白胨+酵母粉為最優(yōu)氮源，CaCO3為最優(yōu)無機鹽，運用Design?Expert 8.0.6 軟件設(shè)計4 因素3 水平［L9（34）］響應(yīng)面實驗，確定菌株發(fā)酵產(chǎn)糖的最適培養(yǎng)基。

1.2.7 植物促生實驗 將供試土與基質(zhì)按1∶1 比例均勻混合，置于電熱恒溫箱中，高溫干燥滅菌6 h，自然冷卻后均勻分裝于花盆中。挑取顆粒飽滿、大小均勻的新玉24 號玉米種子常規(guī)消毒后，置于水瓊脂平板上催芽。將發(fā)芽良好的種子移栽至花盆，每盆2 株幼苗，待葉片長至四葉時進行灌根處理。處理組分別接種粗多糖提取液（A）和發(fā)酵液（B），對照（CK）接種等量液體培養(yǎng)基，每個處理6 個重復(fù)。統(tǒng)一管理20 d 后收獲，測量相關(guān)指標(biāo)，并用乙醇浸泡法測定葉綠素含量［26］。

1.2.8 高產(chǎn)胞外多糖菌株對土壤團聚體影響 分別將發(fā)酵液及粗多糖提取液按5%接種量接入到稱取50 g 過0.25 mm 篩的土樣平皿中，30℃培養(yǎng)20 d。以等量液體培養(yǎng)基為對照，定時補充無菌水保持土壤表面濕潤，分別用干篩法［27］和濕篩法［28］測定土壤中大團聚體的組成，分析胞外多糖對土壤團聚體的影響。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)胞外多糖菌株分子生物學(xué)鑒定

從鹽堿植物根際共篩選到19 株產(chǎn)胞外多糖菌株，對這些菌株進行16S rRNA 基因測序，結(jié)果如圖1 所示。所有菌株分屬7 個屬，假單胞菌屬（Pseudomonas）有8 株，為絕對優(yōu)勢屬，占總菌數(shù)的42.1%；腸桿菌屬（Enterobacter）為3 株，占總菌數(shù)的15.8%；芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、克錫勒氏菌屬（Kushneria）均有2 株，占總菌數(shù)的10.5%；泛菌屬（Pantoea）、歐文氏菌屬（Erwinia）各1 株，占總菌數(shù)的5.3%。

圖1 基于16S rRNA 基因的產(chǎn)胞外多糖菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of bacterial 16S rRNA gene sequences revealing exopolysaccharides-producing strains evolutionary divergence

2.2 促生性能評價

將初篩得到的產(chǎn)胞外多糖菌株發(fā)酵培養(yǎng)，測定其多糖含量及其他促生性能，結(jié)果如表1 所示。19株產(chǎn)胞外多糖菌株搖床培養(yǎng)48 h 后，多糖含量為236-1 544 mg/L，尤以泛菌屬MQ A0 產(chǎn)量最高，且兼具固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體和溶磷能力，在植物促生和土壤改良方面潛力較大，作為目的菌株進行后續(xù)培養(yǎng)基組分優(yōu)化。

表1 胞外多糖產(chǎn)量及其他促生能力測定Table 1 Determination of exopolysaccharide yield and other growth-promoting characteristics

2.3 單因素實驗

2.3.1 碳源種類對MQ A0 產(chǎn)胞外多糖的影響 碳源是微生物生長過程中必不可少的元素，其種類和濃度會影響菌株生長及產(chǎn)物合成。不同碳源對MQ A0 胞外多糖產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖2 所示，在以甘油為碳源時多糖產(chǎn)量可達(dá)2 147 mg/L，顯著高于其他碳源（P＜0.05）；甘露醇次之，多糖產(chǎn)量為1 516 mg/L；其他碳源的促進效果并不明顯，因此確定甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳源。

圖2 不同碳源對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on exopolysaccharide yield

2.3.2 氮源種類對MQ A0 產(chǎn)胞外多糖的影響 氮源主要用于菌體細(xì)胞和含氮代謝物的合成，在培養(yǎng)基中碳源不足時也可作為補充碳源。由圖3 可知，以蛋白胨和酵母粉為氮源時，MQ A0 胞外多糖的產(chǎn)量較高，兩者配合使用多糖產(chǎn)量可達(dá)1 645 mg/L。發(fā)酵過程中，蛋白胨和酵母粉的搭配使用既能促進菌體吸收，又有利于產(chǎn)物穩(wěn)定期的延長，因此確定蛋白胨+酵母粉為最優(yōu)氮源。

圖3 不同氮源對胞外多糖產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on exopolysaccharide yield

2.3.3 不同無機鹽對MQ A0 產(chǎn)胞外多糖的影響 無機鹽可維持細(xì)胞滲透壓，為菌體提供穩(wěn)定的外界環(huán)境。如圖4 所示，以CaCO3作為無機鹽時，MQ A0的產(chǎn)糖量顯著高于其他無機鹽（P＜0.05），K2HPO4+MgSO4次之；以NaCl 作為無機鹽時產(chǎn)糖量最差，僅620 mg/L，因此確定CaCO3為MQ A0 發(fā)酵產(chǎn)糖的最優(yōu)無機鹽。

圖4 不同無機鹽對MQ A0 產(chǎn)胞外多糖的影響Fig.4 Effects of different inorganic salts sources on exopolysaccharide yield

2.4 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.4.1 試驗方案及方差分析 基于單因素實驗結(jié)果，以甘油（A）、蛋白胨（B）、酵母粉（C）和CaCO3為主要因素，采用4 因素3 水平Box?Behnk?en 響應(yīng)面優(yōu)化法，結(jié)果見表2。通過實驗設(shè)計得到產(chǎn)糖量（Y）與甘油（A）、蛋白胨（B）、酵母粉（C）、CaCO3（D）編碼水平下的二次響應(yīng)面回歸模型Y=2367.80+288.67A-0.25B+101.92C+20.33D-324.50AB-61.50AC-3.00AD-13.50BC-133.25BD+106.75CD-348.90A2-420.52B2-429.27C2-358.90D2。

表2 BOX-Behnken 實驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of BOX-Behnken

由方差分析（表3）可得F（回歸）=41.5，P＜0.000 1，表明該模型高度顯著；決定系數(shù)R2＝0.976 5，表明該方程能夠較好地模擬胞外多糖的產(chǎn)量變化。校正系數(shù)R2Adj＝0.951 5，表明該模型能夠解釋95.15%的響應(yīng)值變化，可用于預(yù)測菌株發(fā)酵產(chǎn)糖。綜合F值大小可知，各因素對胞外多糖產(chǎn)量影響順序依次為：甘油＞酵母粉＞CaCO3＞蛋白胨。

表3 Box-Behnken 設(shè)計方差分析Table 3 Box-Behnken design variance analysis

2.4.2 響應(yīng)面分析 利用Design?Expert.8.05 軟件對表2 中實驗數(shù)據(jù)進行二元多次回歸，得到方程的響應(yīng)曲面及等高線如圖5 所示。曲面越陡斜表明該因素的影響越顯著，反之影響不顯著。甘油（A）的曲面較蛋白胨（B）、酵母粉（C）、CaCO3（D）陡斜，表明甘油對胞外多糖產(chǎn)量的影響更大（圖5?a、c、e）；酵母粉（C）的曲面較蛋白胨（B）、CaCO3（D）陡斜，表明酵母粉對多糖產(chǎn)量的影響次之（圖5?g、i）；CaCO3（D）的曲面較蛋白胨（B）陡斜，表明蛋白胨對胞外多糖產(chǎn)量的影響最?。▓D5?k）。

圖5 各因素間對胞外多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surfaces and contours of the influences of various factors on exopolysaccharide yield

等高線形狀反映出兩因素間交互作用的強弱，橢圓形說明二者交互作用較強，圓形則無交互作用。AB、AC、BD、CD 等高線形狀均為橢圓，表明各因素間交互作用較強（圖5?b、d、i、l）。而AD、BC等高線形狀為圓形，表明甘油與碳酸鈣、蛋白胨與酵母粉之間交互作用較弱（圖5?f、h）。綜上，各因素對胞外多糖產(chǎn)量對影響顯著性順序為：甘油＞酵母粉＞碳酸鈣＞蛋白胨，與方差分析結(jié)果一致。

通過分析，預(yù)測最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：甘油12.52 mL/L、蛋白胨9.04 g/L、酵母粉5.12 g/L、CaCO35.09 g/L，在此條件下產(chǎn)糖量為2 445 mg/L。結(jié)合操作可行性修正參數(shù)后（調(diào)整為甘油12.5 mL/L、蛋白胨9.0 g/L、酵母粉5.5 g/L、CaCO35.1 g/L），進行3 次重復(fù)試驗。結(jié)果顯示，平均產(chǎn)糖量為2 436 mg/L，與預(yù)測值偏差0.37%，可知該響應(yīng)面模型優(yōu)化MQ A0 產(chǎn)胞外多糖培養(yǎng)基組分配比可行。

2.5 盆栽促生效應(yīng)評價

將玉米幼苗分別進行不同的接種處理，培養(yǎng)20 d 后的生理指標(biāo)見表4。與對照相比，接種MQ A0 顯著促進了幼苗生長，尤以鮮重和根長增幅較大，分別增加了203.0%和99.7%。接種粗多糖提取液也顯著增加了玉米植株各項生理指標(biāo)，與發(fā)酵液相比，植株的株高、須根數(shù)、莖粗、鮮重以及葉綠素含量差異并不顯著。總體而言，接種優(yōu)化后的MQ A0 發(fā)酵液對鹽堿土壤中玉米的促生效果更優(yōu)。

表4 不同處理對玉米幼苗生長的影響Table 4 Effects of different treatments on the growth of maize seedlings

2.6 胞外多糖對土壤團聚體的影響

接種20 d 后測定不同處理的土樣團聚體含量，結(jié)果如表5 所示。以直徑＞0.25 mm 的團聚體作為評價指標(biāo)，團聚體質(zhì)量分?jǐn)?shù)與平均重量直徑均按照粗多糖提取液、發(fā)酵液、對照的順序依次遞減，表明粗多糖提取液和發(fā)酵液都能促進土壤團聚體形成，尤以粗多糖提取液影響更大。PAD 是反映土壤水穩(wěn)性的指標(biāo)，與對照相比，接種發(fā)酵液與粗多糖都能降低團聚體破壞率，分別降低了10.8%與8.4%，表明二者均對提高土壤水穩(wěn)性有積極作用。

表5 不同處理對土壤團聚體的影響Table 5 Effects of different treatments on soil aggregates

3 討論

不同地理環(huán)境和宿主植物根際產(chǎn)胞外多糖菌株的類群差異較大，如Niu 等［29］從谷子（Setaria italica）根系分離的產(chǎn)胞外多糖菌株分別隸屬于假單胞菌屬和腸桿菌屬，尤以熒光假單胞菌產(chǎn)糖量較高；分離自擬南芥（Arabidopsis thaliana）根際的產(chǎn)胞外多糖菌株分別隸屬于假單胞菌和芽孢桿菌屬［30］。本研究從南疆鹽堿植物根際分離的產(chǎn)胞外多糖菌株以假單胞菌占絕對優(yōu)勢，進一步證實假單胞菌是植物根系普遍存在，并可能發(fā)揮重要作用的微生物類群，但最高產(chǎn)多糖菌株以泛菌屬MQ A0 最為顯著。泛菌屬作為一種革蘭氏陰性菌，能夠利用D?葡萄糖和其他糖類產(chǎn)酸，多數(shù)能夠增強宿主植物抵御病原體的功能，同時還能有效抵抗鹽脅迫，降低細(xì)胞膜損傷［31-32］。但當(dāng)前泛菌屬在胞外多糖促生方面的研究尚未見報道，本研究進一步拓寬了產(chǎn)胞外多糖的菌株資源。

微生物胞外多糖的產(chǎn)量隨介質(zhì)成分的不同而變化，包括但不限于碳、氮、無機鹽種類和其他環(huán)境因素［33］。目前已有諸多采用單因素、響應(yīng)面優(yōu)化菌株產(chǎn)糖量的報道，但不同于本研究確定的最適培養(yǎng)基組分，王琪等［34］對產(chǎn)羅漢果內(nèi)生菌的單因素分析表明，蔗糖、尿素比甘油、蛋白胨更利于菌株發(fā)酵產(chǎn)糖。喬新榮等［35］發(fā)現(xiàn)木賊鐮孢菌（Fusarium equiseti）在以葡萄糖為碳源時，多糖產(chǎn)量更高。培養(yǎng)基組分對多糖產(chǎn)量影響較大，一方面與菌株種屬特性有關(guān)，另一方面還可能與其多糖結(jié)構(gòu)有關(guān)。胞外多糖類型多樣，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其物理性質(zhì)、功能特性都存在一定差異，同一菌株也可能產(chǎn)生不同組分的多糖。如陳海燕等［36］從嗜熱鏈球菌MGD1?4 中分離到EPS?1a 和EPS?3a 兩個不同組分的多糖，其理化特性存在明顯差異。因此，為更好地探究胞外多糖不同組分的結(jié)構(gòu)與生物活性間的相關(guān)性，本研究后期將進一步開展對胞外多糖的分離、純化與結(jié)構(gòu)分析研究。

糖是一種類似于植物激素的信號分子，在植物的生命周期中具有重要作用，可以調(diào)節(jié)植物的營養(yǎng)傳輸、生長發(fā)育［37］。本研究中，接種MQ A0 菌株發(fā)酵液對鹽堿土壤中的玉米植株具有更好的促進效果，推測是由于發(fā)酵液中存在大量活菌體，能夠與植物根系互作，較大程度地幫助植物根系建立有益的微生物群落結(jié)構(gòu)，提高其對鹽堿脅迫的耐受性。另一方面，MQ A0 兼具固氮、解磷、產(chǎn)IAA 和鐵載體等多種促生特性，再次表明了產(chǎn)胞外多糖菌株的功能多樣性，這可能也是接種發(fā)酵液比粗多糖提取液更能促進植株生長的重要原因。但本研究尚未探究胞外多糖對植物生長的調(diào)節(jié)機制。研究表明，胞外多糖濃度的增加對植物的促生作用呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢［38］，推測可能與胞外多糖的調(diào)節(jié)機制和土壤微環(huán)境有關(guān)。因此有必要結(jié)合不同宿主植物和脅迫條件，探究胞外多糖用量與土壤肥力間的平衡點，以更好地緩解植物鹽堿脅迫。當(dāng)前研究僅限于室內(nèi)條件，尚未開展大田實驗，后續(xù)需結(jié)合田間復(fù)雜多變的環(huán)境因素，進一步考察產(chǎn)胞外多糖菌株的大田應(yīng)用效果，為胞外多糖菌肥的制備提供更多數(shù)據(jù)支撐。

土壤團聚體是土壤結(jié)構(gòu)的基本組分，也是反映土壤結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，影響著土壤肥力和微生物多樣性［39］。研究證實，胞外多糖與土壤結(jié)皮、土壤團聚體穩(wěn)定性等性質(zhì)密切相關(guān)［9］。本研究接種胞外多糖粗提液顯著增強了土壤團聚體水穩(wěn)性，降低土壤PAD 值，與以往報道相符［12,39］。目前普遍認(rèn)為胞外多糖對土壤的改良機制主要是通過靜電引力和范德華力，以膠膜形式包被在土壤顆粒外表，通過增加土壤顆粒的黏結(jié)性來促進團粒結(jié)構(gòu)的形成［40-41］。推測本研究中土壤團聚體穩(wěn)定性的提高也與多糖獨特的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體還需進一步解析。胞外多糖對土壤環(huán)境的調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，已有學(xué)者從不同角度闡述了胞外多糖的作用機制，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用也逐步受到關(guān)注。但總體來看，胞外多糖的結(jié)構(gòu)與功能、生理代謝及其對微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響等仍需系統(tǒng)性分析。

4 結(jié)論

分離自新疆喀什鹽堿草地植物根際土壤的19 株產(chǎn)胞外多糖菌株隸屬于7 個菌屬，以Pseudomonas占絕對優(yōu)勢，其中泛菌屬Pantoea MQ A0產(chǎn)糖量最高，且兼具固氮、產(chǎn)IAA、產(chǎn)鐵載體和溶磷能力。優(yōu)化后的MQ A0 發(fā)酵培養(yǎng)基組多糖產(chǎn)量增加57.8%，接種優(yōu)化后的MQ A0 發(fā)酵液顯著增加了鹽堿土栽培的玉米植株生物量，其胞外多糖粗提液對土壤團聚體改良也有積極影響。