γ-氨基丁酸對(duì)綿羊卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及類固醇激素分泌的影響

單新雨 李太春 楊若晨 段香茹 康佳 張英杰 劉月琴

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，保定 071000）

γ-氨基丁酸作為一種具有4 個(gè)碳原子的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛分布于動(dòng)植物和微生物中［1］，同時(shí)，GABA 作為機(jī)體內(nèi)不可或缺的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)情緒、降低血壓、調(diào)節(jié)血糖、改善肥胖、改善肝腎功能、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)胰島素分泌、促進(jìn)生殖等生理功效［2］，并對(duì)癲癇、驚厥、亨廷頓病和帕金森病等多種精神疾病具有一定的療效作用［3-4］。此外，GABA 通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸系影響垂體和性腺生理機(jī)能，從而參與激素的分泌調(diào)節(jié)，影響卵巢、輸卵管的功能［5-6］。GABA 目前是熱門的保健品，以GABA 膠囊、GABA 茶、GABA軟糖等一系列產(chǎn)品的形式在市面上流通，具有抗焦慮，調(diào)節(jié)血壓，鎮(zhèn)靜安神，改善睡眠等功效［7-9］，在動(dòng)物生產(chǎn)中作為添加劑可以促進(jìn)采食、增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和代謝［10-12］，并發(fā)現(xiàn)能夠改善雌性動(dòng)物繁殖性能［13］。因此，GABA 在食品保健、生物制藥、飼料添加劑等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊，近年來(lái)有關(guān)GABA 的研究逐漸成為熱點(diǎn)，人們對(duì)GABA 的了解也逐漸深入、清晰。

調(diào)控動(dòng)物繁殖性能機(jī)制十分復(fù)雜，其中，卵泡的排卵與質(zhì)量至關(guān)重要，卵泡的發(fā)育依賴于卵母細(xì)胞及GCs 間的細(xì)胞通訊［14-15］，GCs 分泌的類固醇激素可以維持卵母細(xì)胞發(fā)育成熟［16-17］，而GCs 凋亡可直接導(dǎo)致卵泡閉鎖［18］。GABA 在30 多種外周組織中表達(dá)，包括下丘腦、垂體、子宮、卵巢、胎盤和輸卵管等。研究表明，在大鼠和人的體外試驗(yàn)中適宜濃度的GABA 可直接作用于GCs，影響GCs類固醇激素的生成［19-22］，高濃度的GABA 可增加人黃體化GCs 凋亡［21］。不同動(dòng)物生殖生理存在差異，GABA 是否對(duì)綿羊GCs 功能有調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)通過(guò)在綿羊卵巢GCs 培養(yǎng)體系中添加不同濃度的GABA，研究其對(duì)GCs 凋亡、類固醇激素的分泌及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期揭示GABA 對(duì)綿羊繁殖機(jī)能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

從河北省保定市唐縣瑞麗食品屠宰場(chǎng)采集體況良好的1-1.5 歲齡體重相似、飼養(yǎng)條件相同的性成熟健康小尾寒羊母羊新鮮卵巢，酒精及生理鹽水清洗后立即放入含37℃生理鹽水、1%雙抗（1%青霉素、1%鏈霉素）的保溫杯中并于2 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 用75%酒精沖洗卵巢3次，37℃的生理鹽水沖洗卵巢3 次，最后用含1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基沖洗1-2 次，放入完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清（FBS）、2%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基）中，用滅菌手術(shù)刀片逐個(gè)割破直徑3-7 mm的卵泡，收取卵泡液于培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中離心（1 500 r/min，10 min）。棄去上清液，留下沉淀，加入完全培養(yǎng)基吹散沉淀使其均勻懸浮后離心（1 500 r/min，10 min），重復(fù)該步驟3 次。重懸浮GCs 并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞。綿羊卵巢GCs 培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)箱中（37℃，5% CO2）松蓋培養(yǎng)，每1-2 d 換液一次，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%再消化傳代。

1.2.2 GCs 免疫熒光鑒定 GCs 特異性表達(dá)促卵泡素受體（FSHR），免疫熒光法鑒定分離培養(yǎng)的綿羊卵巢GCs。將綿羊GCs 以1×105個(gè)/孔接種于含10% FBS、1%雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基的六孔板中，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后吸去培養(yǎng)基；每孔加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min；4℃預(yù)冷多聚甲醛固定細(xì)胞20 min；0.2%的Triton X?100室溫通透細(xì)胞10 min；BSA 封閉液室溫孵育30 min；加入稀釋好的一抗（Rabbit Anti?FSH receptor antibody）并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜；加入稀釋好的 熒 光 二 抗（Mouse Anti?rabbit IgG/Bio antibody），37℃孵育90 min；加入DAPI 染液，室溫避光孵育10 min；每次操作完畢試劑反應(yīng)完成后，PBS 浸洗細(xì)胞3 次；放在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 顆粒細(xì)胞增殖檢測(cè) 將綿羊GCs 懸液以5×103個(gè)/孔接種于96 孔板中，分為5 組，每組4個(gè)重復(fù)，添加10 μL 不同濃度的GABA，使5 個(gè)組的濃度分別為0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L，每孔的最終體積為100 μL，于培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）中孵育24 h；向每孔加入10 μL CCK?8 溶液后放入培養(yǎng)箱中孵育3 h；15 min 內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)定各處理組450 nm 處的吸光度。

1.2.4 顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將綿羊GCs 在六孔培養(yǎng)板中以105個(gè)/孔的密度培養(yǎng)，分為5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，添加0、10-8、10-7、10-6和10-5mol/L GABA處理24 h，離心收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞；用1×PBS（4℃）重懸細(xì)胞一次后離心（2 000 r/min，10 min）；加入500 μL 的1×Binding Buffer 懸浮 細(xì)胞；加入5 μL 的Annexin V?FITC 混勻后，室溫避光孵育15 min；加入5 μL 的PI 染色；利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 E2和P4的檢測(cè) 以添加10-6mol/L GABA 為試驗(yàn)組，不添加GABA 為對(duì)照組，試驗(yàn)組和對(duì)照組GCs 在六孔培養(yǎng)板中以105個(gè)/孔的密度培養(yǎng)，每組3 個(gè)重復(fù)，細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心（3 000 r/min，10 min）取上清液，采用ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中E2和P4的濃度。

1.2.6 RT?qPCR 檢測(cè)基因表達(dá) Trizol 法提取試驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞總RNA，并使用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）測(cè)定濃度，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，離心管中加入1 μL cDNA，正義鏈和反義鏈引物各0.4 μL，使其工作濃度為0.2 μmol/mL，2×TransStart?Tip Green qPCR Super mix（+Dye I）10 μL，最后加入8.2 μL 滅菌水補(bǔ)足20 μL 體系。使用Step One Plus 儀 器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA） 對(duì)PCNA、CCNB1、CCND1、Bax、Caspase?3、Bcl?2、StAR、3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1 的 表 達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，條件為95℃預(yù)變性2 min；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段95℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。通過(guò)熔解曲線分析驗(yàn)證每個(gè)PCR 擴(kuò)增的特異性，以GAPDH 為內(nèi)參基因，RT?qPCR 結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.7 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 樣品總蛋白采用總蛋白提取試劑盒（Thermo Pierce）進(jìn)行提取，然后采用BCA 定量試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。在分離膠上對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)膜、封閉，然后于4℃進(jìn)行一抗過(guò)夜孵育及室溫進(jìn)行羊抗兔二抗孵育60 min 后進(jìn)行曝光及顯影和定影并拍攝照片?？贵w信息如表2 所示。

表2 一抗信息Table 2 Primary antibody information

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，單因素方差分析（one?way ANOVA，LSD）用于確定多組之間的差異。兩組間差異采用t 檢驗(yàn)。顯著性水平為P＜0.05 差異顯著，P＞0.05 差異不顯著，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用GraphPad Prism 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 綿羊卵巢GCs鑒定

GCs 特異性表達(dá)FSHR 蛋白，免疫熒光鑒定結(jié)果如圖1 所示。紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞即為表達(dá)FSHR陽(yáng)性的細(xì)胞，藍(lán)色熒光區(qū)域?yàn)镈API 染液標(biāo)記的細(xì)胞核，這表明分離培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞為綿羊卵巢GCs。

圖1 綿羊卵巢顆粒細(xì)胞鑒定（400×）Fig.1 Identification of ovine ovarian granulosa cells（400×）

2.2 GABA對(duì)綿羊卵巢GCs增殖的影響

不同濃度GABA 處理GCs 24 h 后的細(xì)胞增殖活力結(jié)果見圖2。由圖2 可見，添加GABA 處理組的細(xì)胞增殖活力均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），其中，10-6mol/L GABA 處理的細(xì)胞增殖活力顯著高于其他添加組（P＜0.05）。

圖2 不同濃度GABA 對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GABA on proliferation in ovine granulosa cells

2.3 GABA對(duì)綿羊卵巢GCs凋亡的影響

不同濃度GABA 對(duì)GCs 凋亡影響如圖3 和表3所示。添加GABA 處理組的GCs 凋亡率均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中，10-6mol/L 組的凋亡率顯著低于其他添加組（P＜0.05）。

圖3 GABA 處理綿羊顆粒細(xì)胞凋亡結(jié)果圖Fig.3 Results of apoptosis in ovine granulosa cells treated with GABA

表3 不同濃度GABA 對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞凋亡率的影響Table 3 Effect of different concentrations of GABA on apoptosis rate in ovine granulosa cells

2.4 GABA對(duì)綿羊卵巢GCs增殖和凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

RT?qPCR 及Western blot 檢 測(cè)10-6mol/L 的GABA 處理綿羊卵巢GCs 24 h 后增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)情況如圖4 所示，GABA 添加組CCNB1、CCND1 和PCNA mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)情況如圖5 所示，GABA 添 加 組Caspase?3、Bax mRNA 及 蛋 白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Bcl?2 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），Bax/Bcl?2 比值顯著降低（P＜0.05）。

圖4 GABA 對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of GABA on the expressions of proliferation-related genes mRNA and proteins in ovine granulosa cells

圖5 GABA 對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of GABA on the expressions of apoptosis-related genes mRNA and proteins in ovine granulosa cells

2.5 GABA對(duì)綿羊卵巢GCs E2和P4分泌的影響

10-6mol/L 的GABA 處理綿羊卵巢GCs 24 h 后，E2和P4的濃度見表4。由表4 可知，添加10-6mol/L的GABA 顯著促進(jìn)P4分泌（P＜0.05）且顯著抑制E2分泌（P＜0.05）。

表4 10-6 mol/L GABA 對(duì)綿羊GCs 類固醇激素分泌的影響Table 4 Effects of 10-6 mol/L GABA on steroid hormone secretion of GCs in ovine granulosa cells

2.6 GABA對(duì)綿羊卵巢GCs類固醇激素合成關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)的影響

10-6mol/L GABA 處理GCs 后類固醇激素合成相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖6 所示，與對(duì)照 組 相 比， 處 理 組StAR、3β?HSD、CYP11A1 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著上升（P＜0.05），且試驗(yàn)組CYP19A1 的mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。

3 討論

3.1 GABA對(duì)GCs增殖和凋亡的影響

卵巢GCs 凋亡可導(dǎo)致卵泡的閉鎖［23］。研究表明GABA 能夠有效減少活性氧（ROS）含量，從而抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［24］。給熱應(yīng)激雛雞灌服50 mg/kg BW GABA 水溶液能夠減少胰腺細(xì)胞凋亡［25］。有研究發(fā)現(xiàn)100 μmol/L GABA 處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞（MAC?T）12 h 能促進(jìn)脂多糖（LPS）介導(dǎo)的MAC?T 細(xì)胞增殖，并可能通過(guò)PI3K/AKT 通路抑制內(nèi)源性LPS 誘導(dǎo)的MAC?T 細(xì)胞凋亡［26］。GABA可能通過(guò)調(diào)節(jié)蛻膜細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖，從而參與小鼠胎盤的形成過(guò)程［27］。在肺上皮細(xì)胞，GABA 通過(guò)細(xì)胞膜上的GABAA受體引起細(xì)胞膜去極化，從而使膜上電壓依賴性鈣通道開放，胞漿鈣濃度升高，促進(jìn)細(xì)胞增殖［28］。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊卵巢GCs 中添加GABA 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，與前人在其他細(xì)胞類型的研究結(jié)果一致。

細(xì)胞核抗原PCNA 作為細(xì)胞增殖標(biāo)志物，通過(guò)結(jié)合DNA 聚合酶促進(jìn)DNA 復(fù)制，對(duì)細(xì)胞的增殖水平起正向調(diào)控［29］；而細(xì)胞周期蛋白B1（Cyclin B1，CCNB1）是有絲分裂開始的主要調(diào)節(jié)因子之一，細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）控制細(xì)胞周期從G1 期進(jìn)入S 期［30］，是細(xì)胞增殖的重要調(diào)控因子。本研究中，GABA 處理GCs 后PCNA、CCND1、CCNB1 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著上升，表明GABA可促進(jìn)GCs 增殖。細(xì)胞凋亡與B 細(xì)胞淋巴瘤蛋白2（B cell lymphoma protein 2，Bcl?2）和半胱天冬酶家族（Caspase）有關(guān)［31-33］，Bcl?2 能夠抑制細(xì)胞色素c 從線粒體釋放，從而抑制內(nèi)源性細(xì)胞凋亡［34-35］，Caspase?3 參與了細(xì)胞最終凋亡過(guò)程［36-37］。而Bcl?2相關(guān)X 蛋白（Bcl?2?associated X protein，Bax）/Bcl?2比值作為反映細(xì)胞凋亡敏感性的分子標(biāo)志物［38］，其比值上升時(shí)，Bax 容易形成同源二聚體，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而當(dāng)其比值降低時(shí)，Bcl?2 將發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的功能［39］。本研究中，GABA 處理GCs 后上調(diào)Bcl?2 mRNA 及蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase?3 mRNA 及蛋白表達(dá)，且Bax/Bcl?2 比值降低。這表明GABA 處理GCs，可抑制其凋亡。

3.2 GABA對(duì)GCs的E2和P4分泌水平的影響

GCs 可通過(guò)分泌E2和P4類固醇激素來(lái)維持卵巢正常的生理功能［40］。E2協(xié)同F(xiàn)SH 促進(jìn)卵泡發(fā)育，誘導(dǎo)排卵前LH 峰的出現(xiàn)，促進(jìn)排卵［41-42］。P4的重要作用是維持動(dòng)物妊娠生理，利于胚胎著床［43］。此外，P4還能調(diào)控卵母細(xì)胞排卵及GCs 黃體化［44］。姜杰等［20,22］發(fā)現(xiàn)GABA 通過(guò)與其受體結(jié)合促進(jìn)大鼠黃體化GCs 的P4分泌，抑制E2的生成，可能與細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致，GABA 促進(jìn)綿羊卵巢GCs P4的分泌，抑制E2的生成。急性調(diào)節(jié)蛋白（StAR）在類固醇激素合成過(guò)程中將細(xì)胞質(zhì)中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，是類固醇激素合成的重要限速酶［45］，參與P4分泌［46］。本試驗(yàn)中，GABA 處理GCs 后StAR 表達(dá)顯著上升，與P4分泌變化趨勢(shì)一致。CYP11 編碼的細(xì)胞色素P450 膽固醇側(cè)鏈裂解酶（CYP11A1）是類固醇激素合成中從膽固醇到孕烯醇酮的關(guān)鍵酶［47-48］，3β-羥化類固醇脫氫酶（3β-HSD）催化孕烯醇酮或脫氫表雄酮生成有活性的P4和雄烯二酮，其編碼基因3β-HSD 表達(dá)量與卵泡液中P4含量呈正相關(guān)［49］。本 試 驗(yàn) 中，經(jīng)GABA 處 理 的GCs 基 因3β-HSD、CYP11A1 mRNA 及蛋白表達(dá)量上調(diào)，這與P4分泌變化趨勢(shì)一致。由CYP19 編碼的芳香化酶可以催化雄烯二酮及睪酮生成E2和雌酮［50-51］。本文中，GABA處理GCs 后CYP19A1 mRNA 及蛋白表達(dá)量顯著下降，與E2分泌變化趨勢(shì)一致。

4 結(jié)論

GABA 通 過(guò) 上 調(diào)CCNB1、CCND1、PCNA、Bcl?2 基 因 表 達(dá)，下 調(diào)Caspase?3、Bax 基 因 表 達(dá)，從而促進(jìn)GCs 的增殖，抑制其凋亡；通過(guò)上調(diào)CYP11A1、StAR、3β-HSD 基因表達(dá)，下調(diào)CYP19A1基因表達(dá)，從而促進(jìn)GCs 的P4分泌，抑制E2生成。