地衣素合成酶關(guān)鍵模塊 LchAD 蛋白的性質(zhì)和功能研究

楊偉杰 楊周林 朱浩東 魏煜 劉君，2 劉訓(xùn)

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，宜賓 644000；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜賓 644000）

地衣素（lichenysin）是由7 位氨基酸多肽和羥基脂肪酸形成的環(huán)脂肽化合物，具有一定的抗腫瘤［1］、抗病毒［2］、抗炎［3］、抗癌［4］等活性，對白酒風(fēng)味形成有促進(jìn)作用［5-6］。地衣素可由地衣芽孢桿菌［7］（Bacillus licheniforms）以葡萄糖為底物，經(jīng)過非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase, NRPS）催化合成（圖1?A），NRPS 在地衣素合成途徑中被稱為地衣素合成酶。已發(fā)現(xiàn)的地衣素生物合成過程如圖1?B 所示，腺苷化（adenylation,A）結(jié)構(gòu)域激活氨基酸，各氨基酸在硫酯化（thiolation,T）結(jié)構(gòu)域的運(yùn)輸下，在縮合（condensation, C）結(jié)構(gòu)域上形成肽鍵，形成的多肽鏈-脂肪酸鏈復(fù)合體在硫脂酶（thioesterase, TE）結(jié)構(gòu)域的作用下環(huán)化并釋放出地衣素［8］。地衣素合成酶含有一個(gè)單獨(dú)的模塊，硫酯酶模塊LchAD 蛋白。LchAD 蛋白可作為載體，將β-脂肪酸運(yùn)送到地衣素合成酶的第一個(gè)C結(jié)構(gòu)域［9］，與谷氨酰胺（glutamine, Gln）結(jié)合以保證多肽鏈和脂肪酸鏈的連接，為后續(xù)環(huán)化提供基礎(chǔ)（圖1?B）。LchAD 蛋白可能參與編輯修正錯誤激活的氨基酸，確保地衣素合成酶行使正常功能，從而保證地衣素的正確合成［8］。由此可見，LchAD 蛋白對地衣素的產(chǎn)生和產(chǎn)量具有較大影響。因此，研究LchAD 蛋白的性質(zhì)和功能將對深入解析地衣素生物合成途徑具有重要理論意義，同時(shí)對地衣素的工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用具有一定促進(jìn)作用。

LchAD 蛋白屬于II 型硫酯酶（type II thioester?ase, TE II），該類型硫酯酶屬于α/β 水解酶超家族，含有保守的催化三元件（Ser?His?Asp），具有水解、環(huán)化和釋放的功能［10］。但有文獻(xiàn)指出并不是所有的TE II 都含有同樣的催化三元件，在某些TE II 中Ser殘基會被Cys 殘基所替代，從而導(dǎo)致TE II 酶活降低［11］。NRPS 參與多種微生物次生代謝產(chǎn)物的合成，其關(guān)鍵模塊TE II 影響著多種非核糖體多肽類物質(zhì)的合成和產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，在萬古霉素（vancomycin）生物合成過程中，肽鏈只有在TE II 的氧化修飾下，才能形成生物活性肽［12］。Schneider 等［13］通過刪除編碼表面活性素（surfactin）生物合成酶的TE II，導(dǎo)致表面活性素產(chǎn)量減少84%。Wu 等［14］研究發(fā)現(xiàn)在卡西霉素（calcimycin）生物合成過程中，TE II 的失活能導(dǎo)致其前體物質(zhì)產(chǎn)量下降。同樣，Kotowska等［15］報(bào)道了TE II 的失活導(dǎo)致非核糖體多肽類物質(zhì)Coelimycin 的生物合成無法繼續(xù)。這些研究結(jié)果表明，TE II 直接參與了多種非核糖體多肽類物質(zhì)的生物合成，且能對這些物質(zhì)的生物合成產(chǎn)生不同程度的影響。

截至目前，已有多種TE II 蛋白晶體被成功解析，例如來自合成利福霉素（rifamycin）途徑中的RifR蛋白晶體［16］、參與合成表面活性素的SrfD 蛋白晶體［9］和靈菌紅素（prodiginine）合成途徑中的RedJ蛋白晶體［17］。研究發(fā)現(xiàn)TE II 蛋白具有多種構(gòu)象，構(gòu)象的變化使其能與其他結(jié)構(gòu)域相互作用，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。此外TE II 蛋白還具有靈活的蓋子結(jié)構(gòu)（lid structure），可以通過改變活性位點(diǎn)的大小和形狀來控制底物的進(jìn)入［18］。然而，對地衣素合成途徑中的關(guān)鍵模塊LchAD蛋白的相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究為探究地衣素合成途徑中關(guān)鍵模塊LchAD 蛋白的性質(zhì)和功能，首先從釀酒大曲中篩選地衣素產(chǎn)生菌，對其進(jìn)行鑒定和命名，并以其基因組DNA 為模板克隆LchAD 基因，隨后探究LchAD蛋白異源表達(dá)及純化的最適條件，最后利用生物信息學(xué)在線軟件分析其性質(zhì)和功能，旨在為地衣素生物合成途徑的進(jìn)一步解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大曲樣品取自于四川某酒廠（2022 年5 月）。蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、明膠、過氧化氫、磷酸二氫鈉、無水乙醇、硝酸鉀、葡萄糖、可溶性淀粉、番紅試劑、溴麝香草酚藍(lán)、α-萘酚、碘、碘化鉀等試劑均為分析純，購自上海源葉生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶Xho I、BamH I、T4 連接酶，購自大連寶生物公司。細(xì)菌DNA 抽提試劑盒購自全氏金生物有限公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0-8.0。明膠液化培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，明膠120，pH 7.2-7.4。V?P 半固體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母浸粉1，葡萄糖10，NaCl 5，瓊脂3，pH 7.0-7.5。葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：酵母浸粉5，蛋白胨10，NaCl 10，葡萄糖10，pH 7.0-8.0。淀粉培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，可溶性淀粉2，瓊脂15-20，pH 7.0-8.0。Cooper 培養(yǎng)基［19］（g/L）：葡萄糖25，NH4NO34，KH2PO44.082 7，Na2HPO45.68，MgSO4·7H2O 0.197 2，CaCl20.000 8，Na2?EDTA 0.001 5，pH 7.2-7.4。

1.2 方法

1.2.1 大曲中芽孢桿菌的篩選 稱取10 g 大曲樣品，加入已滅菌的生理鹽水90 mL，在37℃、180 r/min 條件下富集30 min，隨后在85℃水浴中處理15 min［20］。參照梁慧珍等［21］方法進(jìn)行菌株篩選，獲得純種后，冷藏菌株并編號。

1.2.2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物的檢測 液態(tài)發(fā)酵：制備種子液，使其OD600值為0.8-1.0 時(shí)。將種子液按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種到Cooper 發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床37℃，250 r/min 培養(yǎng)72 h。

發(fā)酵產(chǎn)物的提純：將發(fā)酵液離心20 min（8 000 r/min），收集上清液，用6 mol/L 的HCl 調(diào)節(jié)上清液的pH 至2.0，4℃過夜放置。8 000 r/min 離心20 min收集沉淀，用30 mL 甲醇分3 次浸提沉淀物［22］，均在4℃浸提4 h。收集浸提液用0.22 μm微孔濾膜過濾。保存樣品用于一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的檢測。

發(fā)酵產(chǎn)物的檢測：目標(biāo)物質(zhì)在正級模式下檢測，檢測條件：DP 167 V，EP 6.9 V，CE 40 V，針泵流速0.07 mL/min，掃描范圍：一級質(zhì)譜100-1 100 Da，二級質(zhì)譜100-1 000 Da。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、糖醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、接觸酶測試、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、V?P 實(shí)驗(yàn)和明膠液化實(shí)驗(yàn)采用王成俊等［23］方法。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 使用27F/1492R 通用引物對菌株基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增片段送至成都擎科有限公司進(jìn)行測序。測序序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 比對后，選擇相似度高的菌株序列，采用MEGA 7 軟件的Neighbor?joining 法（bootstrap=1 000）建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株YC7 的種屬［24］。

1.2.5 LchAD 基因的克隆和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

（1）基因克隆。使用primer primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物，送至成都擎科有限公司合成，上游引物：5'?CGGATCCATGAACGAGATCATTAAGCA?3'，下 游引物：5'?CCTCGAGACACACCGATTTTCCGTT?3'。以篩選的地衣素產(chǎn)生菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

（2）重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將克隆的LchAD 基因和載體pET?28a 分別進(jìn)行雙酶切（Xho I 和BamH I），隨后過夜連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，具體參照Ngo 等［25］方法。

1.2.6 LchAD 蛋白的異源表達(dá)與純化 制備含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）菌懸液，OD600在0.6-0.8 時(shí)，加入IPTG（終濃度為100 μg/mL）誘導(dǎo)表達(dá)，20℃，180 r/min 誘導(dǎo)16 h。收集菌體，超聲破碎細(xì)胞壁，收集上清液，用鎳柱進(jìn)行純化。使用不同濃度的咪唑洗脫雜蛋白。具體參照Ngo 等［25］方法。

1.2.7 生物信息學(xué)分析 利用Prot Param 預(yù)測LchAD 蛋白的理化性質(zhì)；NCBI Conserved Domain 在線軟件預(yù)測LchAD 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；Prot Scale在線軟件對LchAD 蛋白進(jìn)行親疏水性的分析；利用在線網(wǎng)站（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP?5.0）對LchAD 蛋 白 進(jìn) 行 信 號 肽 的 預(yù)測；利用SOPMA 進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測；利用SWISS?MOOEL 和Alpfold 開源數(shù)據(jù)庫進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測［26］。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

從大曲樣品中篩選獲得3 株純種菌株，編號為YC1、YC2 和YC7，各菌株的菌落形態(tài)描述見表1。

表1 菌落形態(tài)Table 1 Colony morphology

2.2 質(zhì)譜鑒定

對3 株菌株進(jìn)行質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，只有菌株YC7有地衣素結(jié)構(gòu)離子峰。一級質(zhì)譜結(jié)果（圖2）顯示，圖中出現(xiàn)了m/z 為1 007.4、1 021.5 和1 035.4 的離子峰，分別對應(yīng)地衣素同系物的質(zhì)子化峰。同時(shí)出現(xiàn)了m/z 是1 029.3、1 043.4 和1 057.4 的離子 峰，分別是1 007.4、1 021.5 和1 035.4 相應(yīng)的［M+Na］+峰。因此，推測菌株YC7 發(fā)酵產(chǎn)物中有地衣素的同系物。于是對1 007.4、1 021.5 和1 035.4 離子峰進(jìn)行ms/ms 分析以期確認(rèn)其主成分的結(jié)構(gòu)。

圖2 一級質(zhì)譜圖Fig.2 Primary mass spectrogram

ms/ms 分析圖譜（圖3?A）顯示，m/z 為1 007.4的離子峰有兩種類型的碎片離子，一種是發(fā)生簡單斷裂形成的片段［M+H］+峰，如m/z 是337.2、468.1、581.2 和680.2 等， 這 些 特 征 值 與 圖3?B中［C14?lichenysin+H+］的理論值b2、a3、a4 和a5相吻合；另一種是雙氫轉(zhuǎn)移（double H transfer）斷裂機(jī)制，即脂肽物質(zhì)的內(nèi)酯結(jié)構(gòu)在斷裂時(shí)，脂肪酸鏈上的兩個(gè)氫原子轉(zhuǎn)移到羥基端的氨基酸殘基上（圖3?C），使C 端殘基的分子量比簡單的酰胺鍵斷裂產(chǎn)生的碎片質(zhì)量少18（即少一個(gè)H2O），如m/z為355.3 的離子峰可以表示為［C14?OH?Gln+H+］片段，符合地衣素D 斷裂后的理論值。在圖3 中還有一個(gè)主要的碎片離子是m/z 為671.1，其產(chǎn)生的原因是位于第7 位的Val 發(fā)生雙氫轉(zhuǎn)移斷裂產(chǎn)生的特征碎片離子，且ms/ms 的檢測結(jié)果與圖3?C 中［C14?lichenysin+H+］的理論值相符合，所以推斷此部分是脂肪酸鏈為14 個(gè)C 的地衣素G。從m/z 為1 021.5的離子峰結(jié)果可以看出，有m/z 為685.2 和337.3 的離子峰，符合地衣素A 斷裂產(chǎn)生的特征峰（附圖1）。另外，分析m/z 為1 035.4 的離子峰結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有m/z 為685.0 的特征峰，該值與附圖2 中脂肪酸鏈碳原子為15 的地衣素理論值相符。以上結(jié)果表明菌株YC7 為地衣素產(chǎn)生菌。

圖3 m/z 為1 007.4 離子峰的二級質(zhì)譜圖（A）及該離子峰發(fā)生簡單斷裂（B）和發(fā)生雙氫轉(zhuǎn)移斷裂（C）產(chǎn)生的特征離子碎片理論值Fig.3 Secondary mass spectrometry of ion peak with m/z of 1 007.4（A）and theoretical values of characteristic ion fragments generated by simple cleavage（B）and double hydrogen transfer cleavage（C）of this ion peak

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 生理生化鑒定結(jié)果 由表2 可知，菌株YC7為革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓形，兼性厭氧，化能異氧型，葡萄糖產(chǎn)氣陰性，接觸酶、葡萄糖產(chǎn)酸、淀粉分解、V?P 實(shí)驗(yàn)及明膠分解均為陽性。

表2 生理生化結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical results

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 利用通用引物27F/1492R 擴(kuò)增獲得菌株YC7 的16S rDNA，測序比對后發(fā)現(xiàn)，菌株YC7 與Bacillus licheniformis strain DSM13的16S rDNA 序列相似度為99.65%。下載10 株不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列，使用軟件MEGA 7 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖4）顯示，菌株YC7 與Bacilluslicheniformis strain DSM13 的自展值為89，故菌株YC7 被命名為地衣芽孢桿菌YC7 并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 菌株YC7 的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain YC7

2.4 LchAD蛋白的異源表達(dá)及純化結(jié)果

重組質(zhì)粒pET?28a?LchAD 雙酶切后，電泳結(jié)果顯示有兩條清晰條帶（圖5?A）。其中一條條帶的大小為750 bp 左右，與LchAD 基因大小一致；另一條條帶大小為5 000 bp 左右，與pET?28a 載體大小一致，雙酶切結(jié)果說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。在溫度為20℃，IPTG 終濃度為100 μg/mL 的條件下，重組質(zhì)粒pET?28a?LchAD 在E.coli 中的表達(dá)結(jié)果如圖5?B所示，目的蛋白條帶在27.62 kD 左右。同時(shí)，在泳道1 和2 中未見有目的蛋白，而在泳道3、4 和5 中均出現(xiàn)目的蛋白，該結(jié)果說明，在此條件下能成功誘導(dǎo)LchAD 蛋白表達(dá)，且能形成可溶性蛋白。在使用不同濃度咪唑洗脫雜蛋白的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在咪唑濃度為250 mmol/L 時(shí)能最大程度洗脫雜蛋白，獲得比較純的目的蛋白（圖5?C）。

圖5 重組質(zhì)粒pET-28a-LchAD 雙酶切（A）和 LchAD 蛋白表達(dá)（B）及純化（C）結(jié)果Fig.5 Results of double digestion of recombinant plasmid pET-28a-LchAD（A）and LchAD protein expression（B）and purification（C）

2.5 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.5.1 LchAD 蛋白理化性質(zhì)預(yù)測 Prot Param 預(yù)測該蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量約為27.62 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為7.23；氨基酸序列由20 種氨基酸組成，其中丙氨酸（Ala）占比最高達(dá)到10.6%，亮氨酸（Leu）占比次之達(dá)到10.2%，色氨酸（Trp）和半胱氨酸（Cys）占比最少分別是0.8%和1.2%；帶負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)和帶正電荷殘基（Arg+Lys）的總數(shù)相同均為26；其分子式為 C1243H1929N341O345S14，總原子數(shù)是3 872；同時(shí)該蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為36.03，屬于穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)（aliphatic index）為83.01。

2.5.2 LchAD 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、親疏水性和信號肽預(yù)測 使用NCBI Conserved Domain 在線軟件預(yù)測LchAD 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（圖6?A）發(fā)現(xiàn)，LchAD蛋白的氨基酸序列只有一個(gè)GrsT 保守結(jié)構(gòu)域，說明LchAD 屬于GrsT 基因家族；使用Prot Scale 在線軟件對LchAD 基因進(jìn)行親疏水性分析，結(jié)果如圖6?B所示，最大的位點(diǎn)是108 號位點(diǎn)，疏水值是2.156，最小的位點(diǎn)在125 和126 號位點(diǎn)，親水值均為?2.511，其中親水性的位點(diǎn)多于疏水性的位點(diǎn)，所以推測該蛋白是親水性蛋白。根據(jù)在線軟件的預(yù)測，LchAD蛋白存在信號肽的可能性為0.028 4（圖6?C）。

圖6 LchAD 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（A）、親疏水性（B）和信號肽（C）預(yù)測Fig.6 Prediction of conserved domain（A）, hydrophilicity and hydrophobicity（B）and signal peptide（C）of LchAD protein

2.5.3 LchAD 蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA 軟件預(yù)測LchAD 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖7?A）。LchAD 蛋白中α-螺旋（Hh）占比43.5%，β-折疊（Ee）占比13.82%，β-轉(zhuǎn)角（Tt）占比5.69%，無規(guī)則卷曲（Cc）占比36.99%。在該蛋白中α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角總量占比63.01%，由此說明該蛋白可能比較穩(wěn)定。

圖7 LchAD 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（A）和三級結(jié)構(gòu)（B）預(yù)測結(jié)果Fig.7 Predicted results of secondary structure（A）and tertiary structure（B）of LchAD protein

采用SWISS?MODEL 服務(wù)器和Alaphfold 開源數(shù)據(jù)庫對LchAD 蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，SWISS?MODEL 服務(wù)器共預(yù)測出一致度大于30%的模型有6種，最高的一致度為94.31%，但是該UniProtKB 條目未知，很可能已過時(shí)，其次是一致度為63.52%的模型，該模型來自于表面活性素合成酶的硫脂酶模塊（surfactin synthetase thioesterase subunit），此結(jié)果與Alaphfold 開源數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果一致，該蛋白預(yù)測的模型如圖7?B 所示。在預(yù)測模型圖中可觀察到較多的α-螺旋與β-折疊，說明該預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。

3 討論

TE II 蛋白在非核糖體多肽類物質(zhì)的生物合成中發(fā)揮著重要的生理功能［18］。研究表明，TE II 的失活將影響多種非核糖體多肽類物質(zhì)的生物合成量，例如TE II 失活導(dǎo)致卡西霉素生物合成的前體物質(zhì)產(chǎn)量下降［14］；在非核糖體多肽類物質(zhì)Coelimycin 的生物合成過程中，TE II 失活直接導(dǎo)致其合成無法繼續(xù)［15］。

地衣素生物合成酶的關(guān)鍵模塊LchAD 蛋白屬于TE II 家族［27-28］，在地衣素生物合成中發(fā)揮著重要作用［8-9］。截至目前，對LchAD 蛋白的研究還相對較少。為探究該蛋白的性質(zhì)和功能，本研究參照鐘桂芳等［20］方法從釀酒大曲中篩選目標(biāo)菌株，篩菌處理?xiàng)l件為85℃水浴15 min，最終獲得3 株菌株。所獲得的菌株數(shù)量與已報(bào)道的多數(shù)篩菌實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有差異［29-31］。但該結(jié)果與明紅梅等［32］報(bào)道的結(jié)果相似，其篩菌處理?xiàng)l件為80℃水浴10 min，獲得4 株菌株。本研究所采用的水浴處理溫度和時(shí)間對于多數(shù)微生物來說相對苛刻，但有利于獲得目標(biāo)菌株。篩選菌株的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜串聯(lián)方法檢測，在菌株YC7 的發(fā)酵產(chǎn)物中出現(xiàn)m/z 為1 007.4、1 021.5 和1 035.4 的離子峰。該檢測結(jié)果與R?nning 等［33］的結(jié)果相比，缺少m/z 為996.3 的離子峰，但二者所使用的菌株不同，可能是導(dǎo)致最終發(fā)酵產(chǎn)物中所含地衣素同系物不完全一致的原因。因此，確認(rèn)菌株YC7 為地衣素產(chǎn)生菌。

研究發(fā)現(xiàn)TE II 蛋白在大腸桿菌中異源表達(dá)較易形成可溶性蛋白，但不同的TE II 蛋白所需的誘導(dǎo)條件不盡相同［34-35］。Suharti 等［34］發(fā)現(xiàn)硫酯酶TESITB 蛋白能在溫度為37℃，IPTG 濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)4 h 后形成可溶性蛋白。陳維斌［35］在納他霉素（natamycin）工業(yè)生產(chǎn)菌株Streptomycetes chattanoogensis L10 中發(fā)現(xiàn)了硫酯酶ScnI 蛋白，在0.4 mmol/L IPTG，37℃條件下誘導(dǎo)6 h 后獲得可溶性蛋白。本研究在IPTG 濃度為100 μg/mL，20℃條件下，誘導(dǎo)16 h，獲得分子量為27.62 kD 的可溶性蛋白。本研究首次探索了LchAD 蛋白異源表達(dá)及純化的條件，在相對較低的溫度條件下，成功獲得在大腸桿菌中異源表達(dá)的LchAD 蛋白，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

不同蛋白的結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致功能的多樣性。本研究預(yù)測LchAD 蛋白為親水性蛋白，無信號肽，含有一個(gè)GrsT 保守結(jié)構(gòu)域。研究表明，TE II 蛋白具有GrsT 保守結(jié)構(gòu)域［36］，目前已報(bào)道的TE II 的功能包括可作為啟動單元控制物質(zhì)的合成、水解釋放產(chǎn)物、提供或者去除異常中間體以及去除非活性?；鶜埢?8］。GrsT 是一種由短桿菌環(huán)肽素（gramicidin S）生物合成基因簇編碼形成的蛋白酶［37］，盡管目前對短桿菌環(huán)肽素的NRPS 進(jìn)行了大量的研究，但是GrsT 蛋白的功能依舊未知［38］。Berditsch 等［39］推測GrsT 蛋白可能參與催化酰基載體蛋白（acyl carrier protein, ACP）中脂肪?；湹乃饧傲姿峄?。LchAD 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白主要由α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角組成，且在其三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果中也可觀察到許多α-螺旋和β-折疊。LchAD 蛋白的三級結(jié)構(gòu)與表面活性素合成酶中硫酯酶模塊相似。地衣素和表面活性素同屬于表面活性素家族（surfactin family）［40］。研究表明表面活性素合成酶和地衣素合成酶極為相似，二者之間只存在細(xì)微的差別［41］。這與本研究中LchAD 蛋白的三級結(jié)構(gòu)類似于表面活性素合成酶中硫酯酶模塊的結(jié)果一致。研究發(fā)現(xiàn)含有α/β 水解酶折疊結(jié)構(gòu)的蛋白具有水解和釋放產(chǎn)物的功能［10,28,42］。Koglin 等［9］分析了表面活性素合成酶中硫酯酶模塊的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該蛋白呈現(xiàn)典型的α/β 水解酶折疊，位于中間的7 個(gè)β-折疊被8 個(gè)α-螺旋包圍。LchAD 蛋白與表面活性素合成酶中硫酯酶模塊的結(jié)構(gòu)相似，推測LchAD 蛋白可能具有與之相似的功能，但不同蛋白在結(jié)構(gòu)上的微小差異仍能導(dǎo)致其功能的不同。Whicher 等［17］對 RifR 和 RedJ 的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，二者的“l(fā)id” 結(jié)構(gòu)具有相同的折疊，但仍存在細(xì)微的差別，這些差異導(dǎo)致RedJ 的疏水口袋比RifR 大，最終使二者的功能存在一定差異。因此，想要揭示LchAD 蛋白的生物學(xué)功能，尚需進(jìn)一步解析其結(jié)構(gòu)特征。

綜上所述，本研究通過對LchAD 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測分析，為該蛋白的結(jié)晶條件篩選提供了理論依據(jù)，也為利用X 射線衍射解析其結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。但對LchAD 蛋白如何發(fā)揮作用及其如何與其他模塊相互作用還有待進(jìn)一步明確，以便全面認(rèn)識LchAD 蛋白的生物學(xué)功能，進(jìn)而促進(jìn)對地衣素生物合成機(jī)制的深入解析。研究結(jié)果將為深入探究LchAD 蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為解析地衣素生物合成途徑的相關(guān)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從釀酒大曲中篩選出地衣素產(chǎn)生菌，鑒定并命名為地衣芽孢桿菌YC7。從該菌株中成功克隆LchAD 基因，在IPTG 終濃度為100 μg/mL，溫度為20℃條件下獲得可溶性LchAD 蛋白，其分子量約為27.62 kD。在咪唑濃度為250 mmol/L 時(shí)，獲得較高純度的LchAD 蛋白。預(yù)測LchAD 蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白，無信號肽，含有一個(gè)GrsT 保守結(jié)構(gòu)域，其三級結(jié)構(gòu)與表面活性素合成酶的硫脂酶模塊相似。

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