真菌電化學修復除草劑污染土壤：降解動力學探索

郝大程 鄭宇薇 王凡 韓蕾 張賾

（1.大連交通大學環(huán)境與化學工程學院，大連 116028；2.大連環(huán)資科技有限公司，大連 116100）

近幾十年來，集約化農業(yè)越來越多地使用除草劑，從而保持了農作物的質量和數量，提高了世界糧食產量。然而，這些化合物可以通過地表徑流、淋濾、噴霧漂移、土壤侵蝕和沉積進入生態(tài)系統(tǒng)［1-2］。此外，有機污染物通過食物鏈等途徑最終富集到人體內，威脅人類健康，農業(yè)土壤有機污染修復迫在眉睫［3］。電動力（EK）修復技術在環(huán)境保護過程中發(fā)揮著重要的作用，具有多功能性、能量效率高、可自動控制、環(huán)境相容性高等優(yōu)點［4］。微生物修復通過微生物將有機污染物作為碳源，進行生長繁殖，是一種可持續(xù)的降解環(huán)境污染物的方法［5］。微生物燃料電池（MFC）是利用生物電化學技術來完成土壤中污染物的去除，同時還可產電，無需額外供電，其用于污水處理的研究漸多，但用于污染土壤修復的研究甚少［6］。氯氟吡啶酯（florpyrauxifen?benzyl，F(xiàn)，圖1?A）屬于最早開發(fā)的選擇性合成激素類除草劑［7］，易在稻田中代謝遷移污染環(huán)境，影響后茬作物生長；具有強烈刺激性，能麻醉中樞神經系統(tǒng)［8］。弗吉尼亞州明確規(guī)定除非產品標簽允許，否則不要使用氯氟吡啶酯處理過的水進行灌溉［9］。高效氟吡甲禾靈（haloxyfop?P，H，圖1?B）對安氏偽鏢水蚤、牡蠣等13 種海洋生物均具有一定致死率［10］。用紫外/過氧硫酸氫鉀系統(tǒng)降解高效氟吡甲禾靈，獲得最高去除率為56.82%［11］。從大豆田分離的土壤水微菌菌株處理100 mg/L 的高效氟吡甲禾靈，經40 h得到較好的降解效果［12］，但該菌株尚未用于土壤修復，且真菌用于除草劑污染土壤的研究較少［13］。

圖1 除草劑化學結構Fig.1 Chemical structures of herbicides

利用宏基因組測序［14］以及MiSeq 高通量擴增子測序和分離菌鑒定［15］揭示了紅豆杉根際驚人的微生物多樣性。踝節(jié)菌Talaromyces dalianensis DJTU?SJ5［16］與疣孢漆斑菌Myrothecium verrucaria DJTU?sh7［17］均是從矮紫杉、南方紅豆杉等藥用植物根際土壤中分離篩選得到。通過單因素實驗發(fā)現(xiàn)短時間內踝節(jié)菌DJTU?SJ5 對三環(huán)、四環(huán)甚至較難降解的五環(huán)多環(huán)芳烴均有較好的降解效果［18］。高產漆酶的疣孢漆斑菌DJTU?sh7 對活性翠藍和活性綠19 等染料具有良好脫色效果［15,19-20］。但兩種真菌對除草劑類有機污染物去除效果未知。真菌、細菌和其他微型生物均在土壤中廣泛存在，且適應環(huán)境能力強，代謝功能多樣，但真菌降解除草劑的應用研究較少；為了全面挖掘土壤生物用于污染修復的潛力，有必要加強對真菌降解除草劑的研究。

本研究通過EK、微生物、MFC 技術處理滅菌土壤中兩種除草劑氯氟吡啶酯和高效氟吡甲禾靈，其中在后兩種方法的研究中，均添加踝節(jié)菌DJTU?SJ5 與疣孢漆斑菌DJTU?sh7 單菌株以及混合菌株。本研究開發(fā)了一種添加真菌菌株的微生物強化生物電化學系統(tǒng)，將電化學修復和微生物修復結合起來；對比了3 種方法去除污染物的效果與優(yōu)缺點，確定除草劑降解產物，推測其降解路徑，對實驗過程中除草劑濃度變化規(guī)律進行降解動力學擬合。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤取自大連交通大學環(huán)境與化學工程學院樓前花壇處，去除植物根系和石塊過1.7 mm（10 目）篩，備用。稱取土樣5.00 g，加入25 mL 無二氧化碳水（去離子水122℃滅菌20 min，取出冷卻至室溫），玻璃棒劇烈攪動2 min，靜置30 min，測定pH、電導率。未添加除草劑滅菌土壤pH=7.9，σ=108.6 μS/cm。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜-質譜（GC?MS） 氯氟吡啶酯（F）的色譜條件：色譜柱Agilent HP?5ms 30 m×0.25 mm×0.25 μm，升溫程序：初始180℃，保持1 min，以25℃/min 升溫到280℃保持15 min；以10℃/min升溫到310℃保持10 min。進樣口溫度為250℃，氣質接口溫度280℃。進樣量1 μL，分流比5∶1，載氣流速1.0 mL/min，柱流量：1 mL/min。質譜條件：電離模式，離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，EI 電離70 eV，溶劑延遲3.75 min。掃描方式，選擇離子監(jiān)控，選擇離子為286、344［21］。高效氟吡甲禾靈（H）選擇離子為180、288、316 和375［22］，其他條件同上。

1.2.2 EK 降解實驗 將石墨氈裁剪成1 cm× 0.5 cm×0.5 cm 的長條用作碳纖維，取350 g 土壤122℃滅菌90 min，使土著微生物完全失活，加入20 mL除草劑溶液（F、H 溶液濃度分別為1.7 mg/mL 和4.3 mg/mL），60 mL 模擬電解液（80.75 mg/L Na2SO4、70 mg/L NaHCO3、30.36 mg/L NaNO3）［23］或去離子水，放入6 cm×6 cm×9 cm 電解池中，土壤中除草劑具體濃度同表1。石墨氈（6 cm×9 cm×0.5 cm）為陽極，不銹鋼網（6 cm×9 cm×3 層）為陰極，以電解庫倫法降解7 d（圖2?A、B）。每隔2 cm 取點（圖2?C）測土壤pH、電導率及除草劑去除率。氯氟吡啶酯處理分為6 組，F(xiàn)1（不加碳纖維）、F2（碳纖維2 g）為對照組不加電，F(xiàn)3、F4、F5、F6（碳纖維2 g）施加電壓分別為5 V、10 V、10 V、10 V，其中F5 加去離子水，其他條件不變。高效氟吡甲禾靈（H）分組同F(xiàn)。用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析，比較不同實驗組土壤pH、電導率的差異，用最小顯著差異法（LSD）進行兩兩比較，下同。

表1 真菌與MFC 降解方案設計Table 1 Degradation scheme of fungi and MFC

圖2 EK 降解實驗Fig.2 Methods of EK degradation

1.2.3 真菌降解實驗 80 mL 液體培養(yǎng)基中加10 mL除草劑，分別接種踝節(jié)菌（T）、疣孢漆斑菌（M），即F+T、F+M、H+T、H+M（表1），避光25℃培養(yǎng)14 d。80 mL 無機鹽培養(yǎng)基中加10 mL 液體培養(yǎng)基、10 mL 除草劑，接種上階段10 mL 菌液。每隔7 d 逐漸減少液體培養(yǎng)基的量，保持無機鹽培養(yǎng)基和除草劑量不變，至不加液體培養(yǎng)基，此時，兩菌對F、H的耐受濃度分別為0.18 mg/mL、0.47 mg/mL。取350 g 滅菌土壤，加入20 mL 除草劑溶液，接種相應菌液20 mL，無菌水調節(jié)土壤含水率保持在30%，封口25℃避光60 d，每隔15 d 攪勻土壤后取樣測試。

1.2.4 MFC 降解實驗 400 mL 無機鹽培養(yǎng)基中加10 mL 除草劑溶液、10 mL 液體培養(yǎng)基、20 mL 對應菌液，連接不銹鋼網電極及導線封口，避光25℃培養(yǎng)7 d 后加電馴化。第1 天0.2 V 加電4 h。第2 天0.5 V 加電4 h。第3、4 天0.5 V 加電12 h。第5、6天0.8 V 加電12 h。第7 天1 V 加電12 h，持續(xù)5 d。更換電極方向，繼續(xù)每天1 V 加電12 h，7 d 后將真菌接入MFC。取350 g 滅菌土壤，加入2 g 碳纖維，60 mL 模擬電解液，20 mL 除草劑溶液，20 mL 菌液。MFC 內尺寸6 cm×6 cm×9 cm，底部有9 個d = 9 mm 小孔（圖3?A-C），便于O2進入。空氣陰極采用石墨氈6 cm×6 cm×0.5 cm，陽極選用不銹鋼網（6 cm×6 cm×3 層），接入導線壓實，避免短路，25℃避光30 d。每隔15 d 取近陰陽極1 cm 土壤（圖3?D）測試。方案設計見表1。

圖3 MFC 降解實驗Fig.3 Methods of MFC degradation

1.2.5 除草劑降解動力學分析 采用Langmuir?Hinshelwood 模型用Origin2018 軟件進行動力學分析，方程為：

式中C0：污染物初始濃度；n：反應級數；K：反應速率常數；t：反應時間（d）。

2 結果

2.1 EK降解

在EK 研究中，F(xiàn)4 和H4 組的模擬電解液含有Na+、SO42-、HCO3-及NO3-，發(fā)現(xiàn)F4、H4 各點去除率均高于F5、H5（去離子水對照），距陽極4 cm 點獲得最高去除率71%（F）、38%（H）。除草劑去除率隨極板兩端外加電壓的升高而提高（圖4?G-H）。F6 和H6 組添加了碳纖維條，各點去除率均高于未加碳纖維的F4、H4，距陽極4 cm 點獲得最高去除率80%、54%（圖4?G-H）。施加5 V 電壓的F3 和H3 組pH 變化不明顯，施加10 V 的F4、H4 組pH降低，2 cm 點下降幅度大于6 cm 點（P ＜ 0.05）（圖4?A-B），原因是電解過程中，陽極產生H+，同時SO42-、HCO3-、NO3-等酸根離子向陽極移動，使2 cm 點pH 減小，而陰極產生OH-，同時Na+向陰極移動，使近陰極的6 cm 點pH 增大。添加碳纖維的F6、H6，其pH 變化比未添加的F4、H4 更劇烈，且距陽極越遠pH 值越高（圖4?A-B）。與0 V 和5 V 相比，施加10V 的各組各點電導率降低（圖4?CD），5 V 和10 V 各組電流密度隨時間增加而下降（圖4?E-F），說明土壤中可移動離子減少，可能是由于土壤中除草劑去除量增加，在電場作用下產生可移動離子量小于遷移出土壤的離子量［22］。各組4 cm點電導率低于2 cm、6 cm 點（P ＜ 0.05），因為在電場作用下，離子向兩極移動，導致兩極中間位置的離子數量減少。

圖4 EK 修復結果Fig.4 Results of EK remediation

2.2 真菌降解

修復30 d后，與單菌相比，混合菌去除效果更佳，兩除草劑去除率分別為100%、37%，60 d 后各組F均被完全去除，疣孢漆斑菌對H 的去除效果最佳，去除率為61%（圖5?E-F）；兩種除草劑的真菌修復效果均比EK 好。60 d 后，F(xiàn)+T、F+M 和F+T+M 組電導率比對照組增加了285%、256%、257%（P ＜0.05），H 組與F 組電導率變化趨勢相似（圖5?C、D），土壤中陰離子和陽離子數量在真菌降解除草劑的過程中明顯增加。這可能與除草劑降解過程中釋放Cl-和F-有關，還可能與真菌新生與死亡的動態(tài)變化有關。與對照組相比，各組在各時點的土壤pH 呈現(xiàn)波動變化（圖5?A、B），但與EK、MFC 相比，pH變化幅度較小，說明真菌修復較溫和。

圖5 真菌修復Fig.5 Fungal remediation

2.3 MFC降解

接入真菌穩(wěn)定2 d 后，與空白對照和單菌相比，混合菌MFC 電性能最好（圖6?A、D），F(xiàn)+T+M 組電流密度稍高于H+T+M，但電壓以及功率密度低于H 組；由于真菌適應MFC 系統(tǒng)和除草劑需要一定時間，F(xiàn) 組與H 組在修復初期差異不明顯。修復15 d，與其他組相比，疣孢漆斑菌MFC 電性能最好（圖6?B、E），且H+M 組的電流密度和功率密度明顯高于F+M 組，可能由于投加高效氟吡甲禾靈濃度高于氯氟吡啶酯，H 組真菌代謝及氧化還原反應更加活躍，產生電子多。修復30 d，與混合菌和踝節(jié)菌組相比，疣孢漆斑菌MFC 組電性能仍然更好（圖6?C、F），且H+M 組仍優(yōu)于F+M 組，推測由于F 較易降解（圖6?K、L），殘余量更少，氧化還原反應弱于H 組。相比其他組，疣孢漆斑菌MFC 對兩種除草劑去除效果最好，30 d 后去除率分別為100%、62%，且陽極去除率略高于陰極（圖6?K、L）。隨著時間的增加，各組陰極pH 越來越高于陽極，第30 天更加明顯，如H+T+M 組陰極pH 達到8.34（P ＜ 0.05）（圖6?G、H），這是由于陰極表面反應消耗H+而導致陰極pH 升高，同時陽極附近會產生H+降低pH［24］。第30 天，F(xiàn)+T、F+M 與F+T+M 組 電 導 率相比對照組增加了38%、136%、120%（P ＜ 0.05），H 組趨勢相似（圖6?I、J），說明在修復過程中，土壤中陰離子及陽離子數量明顯增加；且陽極電導率大于陰極，如第30 天F+M 組陽極電導率比陰極高20.6%（P＜ 0.05），原因是鹽離子隨著水分的蒸發(fā)而向上擴散至土壤表層。

圖6 MFC 修復Fig.6 Results of MFC remediation

2.4 降解路徑推測

對除草劑降解產物進行了GC?MS 檢測，質譜圖見圖7?A、B。氯氟吡啶酯降解產物為氟氯吡啶酸（halauxifen，C13H9Cl2FN2O3），離子碎片信息見圖7?C，降解路徑推測如圖7?F，C?F 鍵斷裂，隨后連接苯酚的C?O 鍵斷裂，得到降解產物。由于氟原子比氧原子半徑大、金屬性差距大，所以其極性差距較大，C?F比C?O 鍵極性強、鍵長較長、鍵能較小、更容易斷裂［25］。高效氟吡甲禾靈降解產物/中間體為乙酸大茴香酯（4?methoxybenzyl acetate，C10H12O3）、氟吡甲禾靈（haloxyfop?methyl，C16H13ClF3NO4），離子碎片信息分別見圖7?D、E，降解路徑推測如圖7?G，先斷裂配位鍵得到氟吡甲禾靈，再斷裂C?O、C?C 鍵得到乙酸大茴香酯，鹵族元素F、Cl 得到有效去除。

圖7 除草劑降解產物Fig.7 Degradation products of herbicides

2.5 動力學分析

對除草劑降解變化規(guī)律進行零級、一級、二級反應動力學方程擬合（表2）。電動力、微生物、MFC 處理時，氯氟吡啶酯濃度的變化規(guī)律均符合一級動力學反應，高效氟吡甲禾靈濃度的變化規(guī)律分別符合一級、二級、二級動力學反應。一級反應是指反應速率與底物濃度的一次方成正比，反映的多為基元反應［26］，而微生物參與的降解高效氟吡甲禾靈的過程包含眾多復合反應，因此二級反應方程更好地模擬了這一過程。兩種除草劑的降解速率常數為：微生物＜ MFC ＜ EK，由降解速率常數求出兩種除草劑的降解半衰期：微生物＞ MFC ＞ EK。

表2 除草劑降解動力學擬合Table 2 Degradation kinetics of herbicides

3 討論

除草劑不止會造成環(huán)境污染，也會間接對人體造成傷害，例如長時間接觸除草劑可能誘發(fā)中樞神經系統(tǒng)腫瘤［27］。微生物修復技術是利用微生物對污染物的代謝作用轉化、降解污染物，是處理土壤、沉積物、水和廢水中各種有機污染物的常用方法［28］，包括生物刺激、生物強化技術等［5,29］。與細菌相比，真菌的代謝功能同樣十分多樣化，對各種環(huán)境和脅迫因素的適應能力同樣非常強［13,30］，但是在生物強化中的應用較少，尤其是在生物強化MFC 中的應用尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌與踝節(jié)菌對兩種除草劑均有良好的去除效果，尤其疣孢漆斑菌。微生物修復效果優(yōu)于EK，且成本低，對環(huán)境友好，但處理60 d 才能達到MFC 30 d 的去除效果，耗時較長。

空氣陰極MFC 是一種生物刺激手段［31］，在有機污染物去除方面潛力巨大。在MFC 的陽極，產電微生物將污染物被氧化時產生的電子通過外電路傳輸到陰極，最終以O2作為電子受體，同時與質子結合形成水［6］。趙曉東等［24］以四環(huán)素為研究對象構建土壤MFC，58 d 后四環(huán)素降解率為70%。黃陽天等［32］從海泥中篩選到高產脂肪酶的假單胞菌屬Pseudomonas putida 和芽孢桿菌屬Bacillus substills 菌株，用其構建的MFC 具有產電性能。本研究發(fā)現(xiàn)疣孢漆斑菌生物強化可以輔助MFC 修復污染土壤，它既能降解有機污染物又具有良好持久的產電特性。經馴化后，F(xiàn)、H 在30 d 內去除率分別為100%、62%，均高于EK 與微生物修復。本研究整個試驗過程均在避光條件下進行，且未添加任何氧化劑，理論上各處理對除草劑的水解能力一致，因此非生物降解并非去除除草劑的主要途徑。對照組的氯氟吡啶酯去除率約50%，推測可能發(fā)生吸附和非生物介導的水解等反應。對照組的高效氟吡甲禾靈去除率在10%左右，而實驗組去除率遠遠高于對照組，提示吸附對于污染物去除的貢獻遠低于降解。在微生物電場刺激下，污染物降解速率提高，電場對微生物表現(xiàn)出定向篩選作用［33］，促進具有異質降解功能的菌在陽極定殖生長；它們以及外加菌株能夠適應以除草劑和土壤有機質為營養(yǎng)源，貧營養(yǎng)環(huán)境可能更有利于污染物的MFC 降解。

本研究的EK、微生物、MFC 處理均能完全去除氯氟吡啶酯，而高效氟吡甲禾靈不易被去除，原因可能是：（1）雖然各組等體積添加除草劑溶液，但氯氟吡啶酯濃度（1.7 mg/mL）遠低于高效氟吡甲禾靈（4.3 mg/mL）。（2）氯氟吡啶酯為激素類除草劑，相對易降解［7］，例如其在稻田中半衰期＜1 個月［34］；而高效氟吡甲禾靈為芳氧苯氧丙酸酯類除草劑［35］，性質較穩(wěn)定。（3）兩種除草劑的物理化學性質相差較大，經微生物轉化產生的代謝中間體迥異，這些因素對降解難易程度的影響十分復雜，有待深入研究。還應注意實驗室估算的半衰期不能真實反映除草劑在田間的去除情況；土壤理化性質的復雜性對除草劑在土壤中的動態(tài)變化影響很大，如電導率、pH 等［36］。與細菌相比，真菌結構更復雜，對外界環(huán)境變化有較強的抵抗力，本研究的真菌修復和真菌強化MFC 修復提示了真菌在相關領域的應用潛力。相比踝節(jié)菌，疣孢漆斑菌對實驗修復條件適應性更強，另外不同真菌對不同除草劑的親和性和耐受性差異較大，以及兩種菌株轉化產生中間體的差異，均需進一步研究。EK、MFC 處理中添加了碳纖維條。未添加碳纖維的EK 組污染物轉化率明顯低于添加組，這是因為土壤的巨大內阻嚴重限制了土壤內離子的移動，致使電流密度小，除草劑去除率較低；導電碳纖維的加入有效降低土壤內阻，若外加電壓相同，則電流密度有所提高，從而提高污染物去除率。土壤的巨大內阻也會限制MFC 的發(fā)電量以及修復效率，而碳纖維的加入有效地輔助陽極收集電子，可能是碳纖維產生一個導電網絡，促進電子在土壤內的轉移［37］。碳纖維很容易從修復后的土壤中分離出來，循環(huán)利用。

4 結論

EK 修復中，添加模擬電解液、碳纖維條、加電10 V 的處理組7 d 后氯氟吡啶酯和高效氟吡甲禾靈去除率分別為71%和38%。真菌修復中，添加疣孢漆斑菌實驗組60 d 后兩種除草劑去除率分別為100%和61%。MFC 修復中，由疣孢漆斑菌構建的MFC 30 d 后兩種除草劑去除率分別為100%和62%，且陽極去除率略高于陰極。氯氟吡啶酯降解產物為氟氯吡啶酸，高效氟吡甲禾靈降解產物為乙酸大茴香酯，三種方法均能有效去除兩種除草劑中的鹵族元素F 和Cl。三種處理方法中氯氟吡啶酯濃度的變化均符合一級動力學反應，而真菌與MFC 修復中高效氟吡甲禾靈濃度變化均符合二級動力學反應。將電化學修復與微生物修復耦合的MFC 既可以修復污染土壤又能產生電能，是一種經濟有效的修復策略，有望應用于多種場景的土壤修復。