4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分分析

鐘文彬 岳建強(qiáng) 張碧蓉 閆素云 段敏仙 史文斌 羅心平 周先艷

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230446

摘? ? 要：【目的】系統(tǒng)比較4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分并篩選差異特征揮發(fā)性成分，對(duì)利用枸櫞類柑橘種質(zhì)資源及促進(jìn)柑橘精油產(chǎn)業(yè)開發(fā)具有重要意義。【方法】采用溶劑萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬和香櫞果皮的揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定?！窘Y(jié)果】在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬和香櫞果皮中共檢測(cè)出85種揮發(fā)性成分，依次檢測(cè)出72種、57種、58種、58種；從總揮發(fā)性成分含量看，云檸1號(hào)檸檬＞香水檸檬＞紅檸檬＞香櫞。通過偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），可將4種枸櫞類柑橘品種有效區(qū)分；以VIP≥1，p＜0.05為基準(zhǔn)，篩選得到12種差異特征揮發(fā)性成分，其中云檸1號(hào)檸檬果皮中γ-松油烯、β-檜烯、檸檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛的含量顯著積累；紅檸檬果皮中（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合歡烯的含量顯著積累，其中α-金合歡烯是紅檸檬果皮中所特有的；香水檸檬果皮中D-檸檬烯、香茅醛含量顯著積累；香櫞果皮中香葉醇、紫蘇醛含量顯著積累。【結(jié)論】不同枸櫞類柑橘果皮的揮發(fā)性成分種類和含量差異顯著，其中D-檸檬烯、γ-松油烯、β-檜烯、香茅醛、檸檬醛、香葉醇、（Z）-α-佛手柑油烯、β-蒎烯、α-蒎烯、α-合金歡烯、紫蘇醛、橙花醛可作為這4種枸櫞類柑橘果皮的差異特征揮發(fā)性成分。云檸1號(hào)檸檬和香水檸檬香氣成分豐富，可作為優(yōu)異的柑橘香氣資源。

關(guān)鍵詞：枸櫞；果皮；GC-MS；揮發(fā)性成分；分析

中圖分類號(hào)：S666 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2024）02-0266-16

Analysis of volatile substances in peels of four citron varieties

ZHONG Wenbin1， YUE Jianqiang2， ZHANG Birong2， YAN Suyun2， DUAN Minxian2， SHI Wenbin2， LUO Xinping2*， ZHOU Xianyan2*

（1Institute of Plant Resources， Yunnan University， Kunming 650000， Yunnan， China; 2Institute of Tropical and Subtropical Cash Crops， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Baoshan 678000， Yunnan， China）

Abstract： 【Objective】 Systematic comparative analysis of the volatile components in the peel of four main cultivated citron， screening of the characteristic volatile components in the four citrons and analyzing their differences in aroma substances from the perspective of metabolism are of great significance for better utilization of the germplasm resource of citron citrus and promoting the development of citrus essential oil industry. 【Methods】 The volatile components of YN 1 lemon， Red lemon， Xiangshui lemon and Citron peels were detected by low temperature ultrasonic solvent extraction combined with GC-MS， and compounds were identified with the Xcalibur software and NIST mass spectrometry database for compound matching， combined with artificial spectrum analysis and comparison with relevant literature. The content of volatile components was determined by the internal standard method， and the data were statistically analyzed by WPS Office 2020 software. SPSS 26.0 software was used to analyze the variance and difference significance of means. Origin 2021 software was used for constructing graphs with the data， and Simca14.1 for multivariate statistical analysis to screen the characteristic volatile components. Partial least square discriminant analysis （PLS-DA） was used to predict the stability and reliability of the data. 【Results】 There were significant differences in the types and contents of volatile components in the peel of the four citrons. A total of 85 volatile components were detected in the peels of YN 1 lemon， Red lemon， Xiangshui lemon and Citron， and 72， 57， 58 and 58 were detected respectively， which fell into 11 classes， including monothenes， sesquiterpenes， monoterpene alcohols， sesquiterpene alcohols， monothene aldehydes， aldehydes， esters， alcohols， etc. Monothene substances accumulated significantly， accounting for more than 80% of the total volatile components， among which D-limonene was the highest volatile substance in the peels of the four citrons. Among the 85 volatile components detected， 34 were common to the four varieties and they were the typical volatile components of citrons. The peel of YN 1 lemon contained 9 unique volatile components， and the peel of Red lemon contained 7 unique volatile components， while no unique volatile components were detected in the peels of Xiangshui lemon and Citron. YN 1 lemon peel had the highest total volatile component content （24 554.42 ?g·g^-1）， followed by Xiangshui lemon peel with 22 004.48 ?g·g^-1， Red lemon peel with 9 677.24 ?g·g^-1， and Citron peel with the lowest content （6 671.86 ?g·g^-1）. Further， by partial least square discriminant analysis （PLS-DA）， the established PLS-DA model could effectively distinguish the volatile components of the four citron varieties. The largest contribution to principal component 1 （PC1） was D-limonene， followed by citronellal， citral， neral， etc.， and the largest contribution to principal component 2 （PC2） was β-pinene， followed by γ-perpinene， α-pinene， β-myrcene， etc. With VIP≥1， p＜0.05 as the basis， 12 volatile components with different characteristics were screened. Among them， D-limonene， γ-terpinene， β-pinene， citral， β-myrcene， α-pinene and neral were significantly accumulated in the peel of YN 1 lemon. （Z）-α-bergamotene and α-farnesene accumulated significantly in the peel of Red lemon， in which （Z）-α-bergamotene was 61.14 times that of YN 1 lemon， 5.11 times that of Xiangshui lemon and 281.27 times that of Citron， and α-farnesene was unique to the peel of Red lemon. D-limonene and citronellal accumulated significantly in the peel of Xiangshui lemon， especially citronellal， which was 111.77 times that of YN 1 lemon， 37.35 times that of Red lemon and 814.44 times that of Citron. Geraniol and perillal accumulated significantly in Citron peel， in which geraniol was 10.57 times that of YN 1 lemon， 6.17 times that of Xiangshui lemon， and perillal was 3.66 times that of YN 1 lemon， and 16.01 times that of Xiangshui lemon. The contents of D-limonene， citral and neral in the peel of YN 1 lemon and Xiangshui lemon were significantly higher than those of Red lemon and Citron. 【Conclusion】There were significant differences in the types and contents of volatile components in different citron citrus peel. Monopetene compounds were the most important volatile components in the peel of the four kinds of citron varieties. The content and types of volatile components in the peel of YN 1 lemon were the highest， and the content and types of volatile components in the peel of citron were the least. Based on the PLS-DA result， γ-terpinene， β-pinene， α-pinene and β-myrcene might be the characteristic volatile components of YN 1 lemon peel; （Z）-α-bergamotene and α-farnesene were characteristic volatile components of Red lemon peel; citronellal might be used as the characteristic volatile component of Xiangshui lemon peel， and geraniol and perillal might be used as the distinctive volatile components of Citron peel. YN 1 lemon and Xiangshui lemon had rich aroma components and might be excellent citrus aroma resources.

Key words： Citron; Pericarp; The gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）; Volatile components; Analyze

枸櫞類（citron-like）是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物中的一類，與柚類（cephalocitrus）、蜜柑類（acrumen）和橘亞類（microacrumen）并列為柑橘重要的栽培類型^[1-2]。枸櫞（C. medica L.）又名香櫞，1753年林奈把枸櫞命名為（C. medica L.）、與檸檬（C. limon Burm.）、黎檬（C. limonia Osbeck.）、梾檬（C. qurantifolia Swingle.）以及佛手（C. medica ‘Fingered）共同構(gòu)成枸櫞類（citron-like），主要分布在印度東北部、我國西藏東南部、云南西部、西南部。枸櫞類柑橘原發(fā)中心位于云南的西部和西南部，在我國長(zhǎng)江以南的熱帶亞熱帶氣候類型的地區(qū)均有栽培^[3-4]。枸櫞類柑橘果實(shí)含有豐富的酚類、黃酮類、生物堿類、香豆素類、維生素類等多種功效性成分，具有理氣、舒郁、消痰、利膈等藥用和食用價(jià)值^[5]。氣味物質(zhì)是人們通過嗅覺可以感覺到的揮發(fā)性成分，其果皮揮發(fā)性成分對(duì)果實(shí)香氣有決定作用，是果實(shí)最重要的風(fēng)味指標(biāo)之一^[6]，不同柑橘果實(shí)具有獨(dú)特氣味^[7]。

筆者課題組前期已在云南129份枸櫞和檸檬種質(zhì)資源果皮中鑒定到49種揮發(fā)性成分，在西藏的50份枸櫞果皮中可鑒定到52種成分，D-檸檬烯含量占總揮發(fā)性物質(zhì)含量50%以上，主要包括單萜、單萜醇、單萜醛、單萜酯、倍半萜、倍半萜醇、醛、酮等物質(zhì)，其中單萜的含量最高^[8]。不同種植區(qū)和不同種質(zhì)資源的柑橘果實(shí)揮發(fā)性成分存在差異。涂勛良等^[9]對(duì)8個(gè)不同檸檬品種果皮香氣成分進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)檸檬品種所含成分種類和相對(duì)含量存在品種間差異；張海朋等^[10]分析了7種柑橘108份材料果皮和汁囊的揮發(fā)性特征，β-蒎烯和檜烯在5個(gè)檸檬種質(zhì)中的4個(gè)中特異積累。此外，不同提取方法、植株不同組織部位及果實(shí)不同成熟度的香氣成分也存在較大差異。莊曉偉等^[11]通過頂空固相微萃?。℉S-SPME）、水蒸氣蒸餾法（SD）與氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）在香櫞果皮中分別檢測(cè)出68種、56種香氣成分，發(fā)現(xiàn)不同提取方法對(duì)揮發(fā)性成分檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響^[12-14]。冼偉光等^[15]對(duì)香櫞葉片和果皮揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，尤桂春等^[16]對(duì)8種檸檬花精油揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，揭示了不同部位的揮發(fā)性成分情況及差異性。李春秀等^[17]對(duì)不同成熟期泰國檸檬和香水檸檬果皮揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同成熟期的香水檸檬和泰國檸檬果實(shí)揮發(fā)性成分存在較大差異。

而枸櫞類柑橘是云南主要栽培或特色的地方柑橘品種，是云南鞏固脫貧攻堅(jiān)成果同鄉(xiāng)村振興有效銜接的主要產(chǎn)業(yè)之一。云南的枸櫞類柑橘由于特殊的香氣越來越受到消費(fèi)者的喜愛，尤其香水檸檬等廣泛應(yīng)用于新興的茶飲行業(yè)。但關(guān)于不同的枸櫞類柑橘果實(shí)果皮揮發(fā)性成分的研究還未見系統(tǒng)的報(bào)道。因此筆者在本研究中以4種枸櫞類柑橘果實(shí)為材料，采用溶劑超聲萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)檢測(cè)云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬及香櫞果皮的揮發(fā)性成分，系統(tǒng)比較4種主要栽培的枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分并篩選差異特征性揮發(fā)成分，從代謝角度解釋4種枸櫞類柑橘果實(shí)香氣差異的原因，對(duì)更好地利用枸櫞類柑橘種質(zhì)資源及柑橘精油產(chǎn)業(yè)開發(fā)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果實(shí)材料均來源于云南檸檬綜合試驗(yàn)站柑橘種質(zhì)資源圃，其中云檸1號(hào)檸檬是從尤力克檸檬芽變中選育的品種，廣泛種植于云南產(chǎn)區(qū)。于2023年1月18日17：00，采集資源圃中處于商品上市期的4種枸櫞類果實(shí)樣品（圖1），每個(gè)品種選擇樹齡相同、長(zhǎng)勢(shì)一致的成年健康掛果樹3株，每株分別從東南西北中5個(gè)方向隨機(jī)采摘成熟度相同、大小均勻、無病蟲害的果實(shí)3個(gè)，每株樹共15個(gè)果，作為1次重復(fù)，隨后帶回實(shí)驗(yàn)室洗凈擦干，削取每個(gè)樣果赤道面黃皮層一圈，立即置于液氮下充分凍干、混勻，封袋標(biāo)記，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及萃取（參考周先艷^[8]的方法略有修改） （1）樣品前處理：將制備好的樣品從-80 ℃低溫冰箱取出，取適量樣品液氮下充分研磨，稱取0.30 g置于2 mL 離心管中，做好標(biāo)記。

（2）萃?。和b好樣品的離心管內(nèi)添加500 ?L純水，500 μL含壬酸甲酯（methyl nonanoate，98%，Sigma-Aldrich）87.50 ?g·mL^-1的MTBE液（甲基叔丁基醚methyl tert-butyl ether，≥99.8%，色譜純，Sigma-Aldrich），蓋好混勻后置于4 ℃低溫下超聲萃取1 h后取出，12 000 r·min^-1離心12 min，小心吸取上清液，過濾膜后置于進(jìn)樣瓶中，使用Thermo TRACE 1600-ISQ 7610GC-MS聯(lián)用儀（購買于美國賽默飛世爾科技有限公司）測(cè)定。

1.2.2 GC-MS條件 色譜柱：TC-5MS石英毛細(xì)柱（30 m×0.32 mm，0.25 ?m）；載氣：高純氦氣（純度＞99.999%），恒流模式，流量2 mL·min^-1；進(jìn)樣口溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 ?L，分流模式，分流比50∶1；升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以2 ℃·min^-1升至160 ℃，保持1 min，以5 ℃·min^-1升至200 ℃，保持1 min，以8 ℃·min^-1升至240 ℃，保持3 min。MS傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃；EI（電子轟擊）為離子源，電子轟擊能量70 eV；Scan正離子全掃描模式，掃描開始時(shí)間為進(jìn)樣后3 min，掃描質(zhì)量范圍45～400 amu。

1.2.3 定性定量分析 定性方法為揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)氣相色譜分離，形成由各成分色譜峰組成的總離子流色譜圖，通過Xcalibur軟件處理及NIST質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的化合物匹配，結(jié)合人工圖譜解析及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，確定揮發(fā)性成分。

定量方法：采用內(nèi)標(biāo)法^[18]進(jìn)行定量，以壬酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)。計(jì)算公式如下：

其中C_i表示樣品中該揮發(fā)性成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（?g·g^-1），A_i表示該揮發(fā)性成分在質(zhì)譜圖上的峰面積，A_is表示內(nèi)標(biāo)物（壬酸甲酯）在質(zhì)譜圖上的峰面積，C_is表示內(nèi)標(biāo)物（壬酸甲酯）的質(zhì)量濃度（87.50 ?g·mL^-1），M_i表示稱取樣品質(zhì)量（g），V表示加入MTBE液的體積（mL）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及分析 利用WPS Office 2020軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析整理；采用SPSS 26.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差、差異顯著性分析；利用Origin 2021軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖；利用Simca14.1進(jìn)行PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖

4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分經(jīng)過提取、GC-MS測(cè)定，得到GC-MS總離子流圖譜，如圖2所示。從圖上可以看出，香櫞和紅檸檬的峰相對(duì)較少，檢測(cè)出的物質(zhì)較少，同一出峰時(shí)間點(diǎn)峰面積較小，同一成分的含量較低，說明這4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分的種類以及含量存在較大差異。

2.2 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分種類與總含量分析

從云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中共檢出85種揮發(fā)性成分（表1），其中依次檢出72、57、58、58種，可分為單萜烯、倍半萜烯、單萜烯醇、倍半萜烯醇、單萜烯醛、醛類、酯類、酮類等共十一大類。根據(jù)這85種揮發(fā)性成分作upset圖（圖3），發(fā)現(xiàn)4種枸櫞柑橘果皮中含有共有揮發(fā)性成分34種，是枸櫞類柑橘果皮典型揮發(fā)性成分；云檸1號(hào)檸檬果皮中含有9種特有揮發(fā)性成分，分別為三環(huán)烯、α-檀香烯、對(duì)薄荷^-1（7），8（10）-二烯-9-醇、白菖醇、庚醛、異胡薄荷酯、異丁酸芳樟酯、樟腦、胡椒酮，其含量（w，后同）累計(jì)為21.01 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分的0.086%，所占比例非常低；紅檸檬果皮中含有7種特有揮發(fā)性成分，分別為α-畢澄茄烯、β-畢澄茄烯、α-金合歡烯、δ-杜松烯、己醛、5-乙基-2（5H）-呋喃酮、5，8-二乙基十二烷，其含量累計(jì)為52.74 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分的0.54%；而在香水檸檬和香櫞兩種枸櫞類柑橘果皮中并未檢測(cè)到特有揮發(fā)性成分。

在果皮揮發(fā)性成分的總含量方面，云檸1號(hào)檸檬果皮檢出揮發(fā)性成分總含量最高，為24 554.42 ?g·g^-1；香櫞果皮中總含量最低，為6 671.86 ?g·g^-1；紅檸檬果皮中為9 677.24 ?g·g^-1、香水檸檬果皮中為22 004.48 ?g·g^-1。4種枸櫞類柑橘品種間差異顯著（p＜0.05），變異系數(shù)為56.39%，云檸1號(hào)檸檬含量最高，其次為香水檸檬，香櫞的含量最低。

2.3 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分含量分析

通過對(duì)在4種枸櫞類柑橘果皮檢出的85種揮發(fā)性成分進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，可分為11類（表1），其類別數(shù)量及相對(duì)含量如圖4和圖5所示。

2.3.1 單萜烯類 單萜烯類是這4種枸櫞類柑橘果皮中最主要的揮發(fā)性成分。在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)出15種；在紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中檢測(cè)出13種。其中4個(gè)品種共有揮發(fā)性成分12種，分別為α-側(cè)柏烯、α-蒎烯、莰烯、檜烯、β-月桂烯、α-松油烯、D-檸檬烯、（E）-β-羅勒烯、羅勒烯、γ-松油烯、異松油烯、波斯菊萜；三環(huán)烯只在云檸1號(hào)檸檬中檢測(cè)到；紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中未檢測(cè)出特有成分。4種枸櫞類柑橘果皮中單萜烯類中最主要的成分都是D-檸檬烯，都占總揮發(fā)性成分含量的50%以上。從含量方面看，云檸1號(hào)檸檬果皮中單萜烯含量最高，為22 742.09 ?g·g^-1，其次是香水檸檬果皮中為18 013.41 ?g·g^-1，紅檸檬果皮中為9 171.61 ?g·g^-1，最少是香櫞果皮中為6 304.05 ?g·g^-1。從占總揮發(fā)性成分含量的比例上看，紅檸檬（94.78%）＞香櫞（94.49%）＞云檸1號(hào)檸檬（92.62%）＞香水檸檬（81.86%），品種間變異系數(shù)為54.34%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.2 倍半萜烯類 在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)出13種倍半萜烯類揮發(fā)性成分；在紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中均檢測(cè)出16種。其中4個(gè)品種共有揮發(fā)性成分有9種，為石竹烯、（Z）-α-佛手柑油烯、葫蘆烯、β-檀香烯、（Z）-β-金合歡烯、（E）-β-金合歡烯、γ-欖香烯、α-雪松烯、β-紅沒藥烯；α-檀香烯僅在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)到；α-畢澄茄烯、β-畢澄茄烯、α-金合歡烯、δ-杜松烯僅在紅檸檬果皮中檢測(cè)到；香櫞、香水檸檬果皮中并未檢測(cè)出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，倍半萜烯類在香水檸檬果皮中的含量最高，為637.83 ?g·g^-1，是其第三大類別成分；其次是在云檸1號(hào)檸檬果皮中為462.24 ?g·g^-1，是其第三大類別成分；紅檸檬果皮中為226.19 ?g·g^-1，是其第二大類別成分；最低的是香櫞果皮中為71.67 ?g·g^-1，是其第四大類別成分。從占總揮發(fā)性成分含量的比例上看，香水檸檬（2.90%）＞紅檸檬（2.33%）＞云檸1號(hào)檸檬（1.88%）＞香櫞（1.07%）。變異系數(shù)為71.68%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.3 單萜烯醇類 在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中依次檢測(cè)出13、8、9、11種單萜烯醇類揮發(fā)性成分。其中4個(gè)品種共有成分有4種，為（Z）-β-松油醇、芳樟醇、α-松油醇、（E）-驅(qū)蛔腦二醇；對(duì)薄荷-1（7），8（10）-二烯-9-醇僅在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)到；紅檸檬、香櫞、香水檸檬果皮中未檢測(cè)出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，單萜烯醇類在云檸1號(hào)檸檬果皮中含量最多，為225.46 ?g·g^-1，是其第四大類別成分；其次是香水檸檬果皮中為141.53 ?g·g^-1，是其第四大類別成分；香櫞果皮中為130.17 ?g·g^-1，是其第三大類別成分；最少是紅檸檬果皮中為84.74 ?g·g^-1，是其第三大類別成分。從占總揮發(fā)性成分含量的比例上看，香櫞（1.95%）＞云檸1號(hào)檸檬（0.92%）＞紅檸檬（0.88%）＞香水檸檬（0.64%）。變異系數(shù)為40.35%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.4 倍半萜烯醇類 4種枸櫞類柑橘果皮中含倍半萜烯醇較少，占揮發(fā)性成分總量的0.03%～0.11%。在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中依次檢測(cè)出6、2、4、3種倍半萜烯醇類。其中4個(gè)品種共有成分1種，為異長(zhǎng)葉醇；白菖醇只在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)到；紅檸檬、香櫞、香水檸檬果皮中并未檢出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，倍半萜烯醇類在香水檸檬果皮中含量最高，為24.04 ?g·g^-1；其次是云檸1號(hào)檸檬果皮中為22.58 ?g·g^-1；紅檸檬果皮中為3.72 ?g·g^-1；最低是香櫞果皮中為1.96 ?g·g^-1。從占總揮發(fā)性成分含量的比例上看，香水檸檬（0.11%）＞云檸1號(hào)檸檬（0.09%）＞紅檸檬（0.04%）＞香櫞（0.03%）。變異系數(shù)為90.68%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.5 單萜烯醛類 單萜烯醛類在這4種枸櫞類柑橘果皮中含量較多，占揮發(fā)性成分總量的0.74%～13.87%。在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中依次檢測(cè)出4、3、4、3種單萜烯醛類。其中4個(gè)品種共有成分2種，為香茅醛和檸檬醛；云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香櫞、香水檸檬果皮并未檢出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，單萜烯醛類在香水檸檬果皮中含量最高，為3 051.16 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的13.87%，是香水檸檬區(qū)別于其他3個(gè)品種的主要揮發(fā)性成分，是其第二大類別成分；其次是云檸1號(hào)檸檬果皮中為834.79 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的3.40%，是其第二大類別成分；香櫞果皮中為133.78 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的2.01%，是其第二大類別成分；最低是紅檸檬果皮中為71.66 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.74%，是其第五大類別成分；其中香茅醛在香水檸檬果皮中含量特異性累積，高達(dá)2 466.85 ?g·g^-1，占香水檸檬果皮總揮發(fā)性成分含量的11.21%，屬于第二大揮發(fā)性成分，遠(yuǎn)超于云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香櫞果皮中的含量，是云檸1號(hào)檸檬的111.77倍、紅檸檬的37.35倍、香櫞的814.44倍。變異系數(shù)為136.46%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.6 醛類 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分中含醛類物質(zhì)較少，占揮發(fā)性成分總量的0.06%～0.78%。在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中依次檢測(cè)出8、7、4、4種醛類。其中4個(gè)品種共有揮發(fā)性成分3種，為壬醛、葵醛、十一醛；庚醛只在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)到；己醛只在紅檸檬果皮中檢測(cè)到；香櫞、香水檸檬果皮中并未檢測(cè)出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，醛類在紅檸檬果皮中含量最高，為75.39 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.78%；其次是在香水檸檬果皮中為69.64 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.32%；在云檸1號(hào)檸檬果皮中為60.38 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分的0.25%；最低是在香櫞果皮中為3.69 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.06%。變異系數(shù)為60.08%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.7 酸類 香葉酸是唯一檢測(cè)出來的揮發(fā)性有機(jī)酸，僅在香水檸檬、香櫞果皮中檢出，含量微少。在香水檸檬果皮中為0.76 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.003 5%；在香櫞果皮中為2.40 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.036%。變異系數(shù)為143.44%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.8 酚類 麝香草酚是唯一檢測(cè)出來的揮發(fā)性有機(jī)酚，只在云檸1號(hào)檸檬、香櫞果皮中檢出，含量微少。在云檸1號(hào)檸檬果皮中為0.84 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.003 4%；在香櫞果皮中為0.77 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.012%。變異系數(shù)為115.71%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.9 酯類 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分中含酯類較少，占揮發(fā)性成分總量的0.09%～0.71%。在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中依次檢測(cè)出6、2、4、3種酯類。其中4個(gè)品種共有成分1種，為2-甲基辛酸甲酯；異胡薄荷酯、異丁酸芳樟酯只在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢出；紅檸檬、香櫞、香水檸檬果皮中未檢出特有揮發(fā)性成分。從含量方面看，酯類在云檸1號(hào)檸檬果皮中含量最高，為174.91 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.71%；其次在香水檸檬果皮中為53.50 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.24%；在香櫞果皮中為16.10 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.24%；最低是在紅檸檬果皮中為8.49 ?g·g^-1，占總揮發(fā)性成分含量的0.09%。變異系數(shù)為121.73%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.10 酮類 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分中含酮類較少，占揮發(fā)性成分總量的0.01%～0.06%。在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢測(cè)出樟腦、胡椒酮、7-甲氧基香豆素3種，含量為8.99 ?g·g^-1；在紅檸檬果皮中檢測(cè)出5-乙基-2（5H）-呋喃酮和7-甲氧基香豆素2種，含量為5.70 ?g·g^-1；在香水檸檬、香櫞果皮中只檢測(cè)出7-甲氧基香豆素1種，含量分別為5.20 ?g·g^-1、0.86 ?g·g^-1。變異系數(shù)為64.34%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.3.11 其他 4種枸櫞類柑橘果皮中還檢測(cè)到其他的揮發(fā)性物質(zhì)，占總量的0.03%～0.31%。在云檸1號(hào)檸檬果皮中檢出鄰-傘花烴、6-甲基十八烷、2-甲基十九烷3種，含量為22.14 ?g·g^-1；在紅檸檬果皮中檢出鄰-傘花烴、5，8-二乙基十二烷、6-甲基十八烷、2-甲基十九烷4種，含量為29.75 ?g·g^-1；在香水檸檬果皮中檢出鄰-傘花烴、6-甲基十八烷2種，含量為7.41 ?g·g^-1；在香櫞果皮中只檢出6-甲基十八烷、2-甲基十九烷2種，含量為6.40 ?g·g^-1。變異系數(shù)為69.59%，品種間差異顯著（p＜0.05）。

2.4 4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分含量的差異分析

以檢出的85種揮發(fā)性成分含量作為因變量參數(shù)，4種枸櫞類柑橘品種作為自變量，通過SIMCA.14.1作偏最小二乘法判別分析（PLS-DA，圖6）。本次分析中自變量擬合指數(shù)（Rx2）為1，因變量擬合指數(shù)（Ry2）為0.999，模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.999。Rx2、Ry2、Q2均大于0.9，表明該模型對(duì)自變量X及因變量Y均具有較好的解釋能力，也表明該模型具有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力，該模型擬合結(jié)果可接受^[19]。經(jīng)過200次置換檢驗(yàn)，如圖6-A所示，Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于0，說明模型不存在過擬合，模型驗(yàn)證有效，認(rèn)為該結(jié)果可用于這4種枸櫞類的鑒別分析。

所建立模型中主成分1（PC1）的方差貢獻(xiàn)率為69.1%，主成分2（PC2）的方差貢獻(xiàn)率為28.4%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為97.50%，其能夠代表數(shù)據(jù)整體。以第一主成分和第二主成分為橫縱坐標(biāo)建立樣品和揮發(fā)性化合物的相關(guān)性得分圖和載荷圖（圖6-B～C），發(fā)現(xiàn)樣品的相似度在95%的置信區(qū)間內(nèi)，各樣品表現(xiàn)出明顯的聚類趨勢(shì)，未發(fā)現(xiàn)離群樣本點(diǎn)，說明建立的PLS-DA模型可對(duì)4個(gè)品種進(jìn)行分類。由圖6-B可以看出，4個(gè)枸櫞類柑橘品種的得分圖散點(diǎn)在不同的象限，同一個(gè)品種的主成分得分散點(diǎn)重復(fù)性良好。在PC1上，4個(gè)枸櫞類柑橘品種可以明顯區(qū)分；在PC2上，云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬和香櫞具有一定的區(qū)分度，香水檸檬和香櫞不能完全進(jìn)行區(qū)分。說明4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分存在一定區(qū)別，可以實(shí)現(xiàn)4個(gè)枸櫞類柑橘品種樣品的有效區(qū)分。主成分中某一組分的載荷值越高，說明該組分對(duì)該主成分所起作用越大。由圖6-C可以看出，對(duì)PC1貢獻(xiàn)最大的是D-檸檬烯，依次是香茅醛、檸檬醛、橙花醛等，可以認(rèn)為PC1代表的是D-檸檬烯、香茅醛、檸檬醛、橙花醛等為組合的揮發(fā)性成分；對(duì)PC2貢獻(xiàn)最大的是檜烯，依次是γ-松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯等，因此PC2代表了以檜烯、γ-松油烯、α-蒎烯、β-蒎烯等為組合的揮發(fā)性成分。

通過PLS-DA的變量投影重要度（VIP）分析不同揮發(fā)性成分對(duì)4種枸櫞類柑橘果皮香味的貢獻(xiàn)率（表1）。根據(jù)p＜0.05且VIP≥1的標(biāo)準(zhǔn)，篩選云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮揮發(fā)性成分差異特征揮發(fā)性成分，共篩選到12種差異特征揮發(fā)性成分（表2），分別是D-檸檬烯、γ-松油烯、檜烯、β-蒎烯、α-蒎烯、（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合歡烯、香葉醇、香茅醛、檸檬醛、紫蘇醛、橙花醛，并根據(jù)其含量作熱圖分析。如圖7所示，云檸1號(hào)檸檬果皮中D-檸檬烯、γ-松油烯、檜烯、檸檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛含量顯著積累，而不含α-金合歡烯，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的柑橘、檸檬香味；紅檸檬果皮中（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合歡烯含量顯著積累，特含有α-金合歡烯而不含香葉醇、紫蘇醛，表現(xiàn)出柑橘清新淡雅、花香、果香；香水檸檬果皮中D-檸檬烯、香茅醛含量顯著積累，而不含β-蒎烯、α-金合歡烯，表現(xiàn)出檸檬、香茅氣味；香櫞果皮中香葉醇、紫蘇醛含量顯著積累，而不含α-金合歡烯，表現(xiàn)為溫和玫瑰、辛香氣味。其中D-檸檬烯、檸檬醛、橙花醛在云檸1號(hào)檸檬和香水檸檬果皮中含量顯著高于紅檸檬和香櫞；γ-松油烯在云檸1號(hào)檸檬和香櫞果皮中含量顯著高于紅檸檬和香水檸檬。上述各品種果皮中的差異特征揮發(fā)性成分對(duì)構(gòu)成這4個(gè)品種果實(shí)獨(dú)特香味的差異有一定的影響。

3 討 論

云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果實(shí)果皮中依次檢出72、57、58、58種揮發(fā)性成分。這一結(jié)果與筆者課題組前期研究^[8]、王小柯等^[24]、涂勛良等^[9]前人研究結(jié)果存在差異，這與所使用的提取和檢測(cè)方法不同有關(guān)。筆者在本研究中也發(fā)現(xiàn)4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分中單萜烯類都是最主要的成分，占總揮發(fā)性成分含量的80%以上，且云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香櫞果皮中單萜烯類含量占總揮發(fā)性物質(zhì)含量的90%以上，說明單萜烯類物質(zhì)在枸櫞類柑橘果皮中高含量累積，與張海朋等^[7]研究結(jié)果一致。云檸1號(hào)檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中單萜醛類含量較高，紅檸檬果皮中單萜醛類物質(zhì)含量較低，說明單萜醛類物質(zhì)在枸櫞類柑橘果皮中特異性積累，與筆者課題組前期研究結(jié)果一致^[8]。其中在香水檸檬果皮中單萜烯醛含量較高，占總揮發(fā)性成分含量的13.87%，主要是香茅醛、檸檬醛、橙花醛的含量較高，尤其是香茅醛極顯著累積，而在其他3種枸櫞類柑橘果皮中含量較低，分別是云檸1號(hào)檸檬的111.77倍、紅檸檬的37.35倍、香櫞的814.44倍，因此可選擇研究果皮中單萜醛（尤其香茅醛）含量累積情況作為香水檸檬區(qū)別于其他3種枸櫞類柑橘的主要特異揮發(fā)性成分。在4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性組分中D-檸檬烯的含量都是第一大成分，占總揮發(fā)性物質(zhì)含量50%以上，與DI Rauso Simeone等^[25]研究結(jié)果一致。

PLS-DA根據(jù)給定的樣品分組信息，對(duì)樣品結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，常用于區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，篩選組間的差異代謝物。高歌等^[26]通過PLS-DA實(shí)現(xiàn)了國內(nèi)各種類型的柚子品種的香氣特征差異分析。目前并未有人系統(tǒng)地比較多種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分的差異，而筆者在本研究中通過PLS-DA分析將4種枸櫞類柑橘種質(zhì)資源分開，篩選得到12個(gè)差異特征揮發(fā)性成分。其中D-檸檬烯、γ-松油烯、檜烯、檸檬醛、β-蒎烯、α-蒎烯、橙花醛在云檸1號(hào)檸檬果皮中顯著積累；（Z）-α-佛手柑油烯、α-金合歡烯在紅檸檬果皮中顯著積累；D-檸檬烯、香茅醛在香水檸檬果皮中顯著積累；香葉醇、紫蘇醛在香櫞果皮中顯著積累。這12個(gè)特征揮發(fā)性成分對(duì)4種枸櫞類柑橘果皮揮發(fā)性成分的區(qū)分具有較大的貢獻(xiàn)，這4個(gè)品種枸櫞類柑橘果皮特異性的顯著累積導(dǎo)致其果實(shí)獨(dú)特的風(fēng)味。

以上結(jié)果也與前人研究的結(jié)果存在差異，這與檢測(cè)技術(shù)方法^[11-14]、品種遺傳差異性^[27-28]、種植環(huán)境因素^[29]、管理水平^[30]，砧木種類^[31]、果實(shí)成熟度^[22]、采后操作^[23]等因素有關(guān)，后續(xù)研究將加大樣本量、擴(kuò)大揮發(fā)性成分的研究范圍，進(jìn)一步分析枸櫞類柑橘果皮中各特征揮發(fā)性成分。而4種枸櫞類柑橘果實(shí)表現(xiàn)出來的不同芳香氣味類型，是果皮揮發(fā)性成分在種類和含量上的差異，以及某些特有成分、共有成分共同作用的結(jié)果，要探明這4種枸櫞類柑橘果實(shí)獨(dú)特的香味來源，不但要研究不同揮發(fā)性物質(zhì)在不同含量條件下互配的混合效果，還要結(jié)合研究人員對(duì)不同揮發(fā)性成分的氣味閾值進(jìn)行判斷，這有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

4種枸櫞類柑橘果皮的揮發(fā)性成分種類和含量差異顯著。在云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬、香水檸檬、香櫞果皮中共檢出85種揮發(fā)性成分，依次檢出72、57、58、58種，共有揮發(fā)性成分有34種，云檸1號(hào)檸檬、紅檸檬果皮中含有特有揮發(fā)性成分，香水檸檬和香櫞果皮中未檢出特有揮發(fā)性成分。通過PLS-DA分析，可將4種枸櫞類柑橘品種有效區(qū)分，其中D-檸檬烯、γ-松油烯、檜烯、香茅醛、檸檬醛、香葉醇、（Z）-α-佛手柑油烯、β-蒎烯、α-蒎烯、α-合金歡烯、紫蘇醛、橙花醛可以作為這4種枸櫞類柑橘果皮的差異特征揮發(fā)性成分。云檸1號(hào)檸檬和香水檸檬香氣成分豐富，可作為優(yōu)異的柑橘香氣資源。

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收稿日期：2023-10-26 接受日期：2023-12-19

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32060563）；云南省科技廳科技人才與平臺(tái)計(jì)劃（202105AD160049）；云南省科技廳重大科技專項(xiàng)（202102AE090054）；德宏州英才興邊計(jì)劃（2022RC010）

作者簡(jiǎn)介：鐘文彬，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)椴珊笊飳W(xué)與技術(shù)。E-mail：2913930878@qq.com

*通信作者 Author for correspondence. E-mail：rjslxp@126.com；E-mail：lyfzhouxianyan@163.com