ＬＥＣ１ 等轉(zhuǎn)錄因子基因在花生小種子突變體種子發(fā)育過程中的表達(dá)分析

朱秀瑾 郭鳳丹 夏晗 趙傳志 侯蕾

摘要：花生突變體ｓｓｍ１ 與其對(duì)照親本魯花１１ 號(hào)（ＬＨ１１）相比，種子皺縮變小，百仁重、單株生產(chǎn)力和含油量顯著降低。 為了探究導(dǎo)致該突變體種子變小且含油量降低的原因，本試驗(yàn)研究了種子發(fā)育關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因ＬＣＥ１ 等在突變體ｓｓｍ１ 及其對(duì)照ＬＨ１１ 合子受精及種子發(fā)育不同階段的表達(dá)情況。 結(jié)果表明，ＡｈＬＥＣ１ 在花生未受精子房（ＤＢＰ０）時(shí)期表達(dá)量較低，且在ｓｓｍ１ 和對(duì)照ＬＨ１１ 中無明顯差異，在受精后的子房（ＤＢＰ１）和入土１０ ｄ（ＤＡＰ１０）和２０ ｄ（ＤＡＰ２０）種子中表達(dá)量上調(diào)，并且在ＬＨ１１ 中的表達(dá)量極顯著高于突變體ｓｓｍ１、轉(zhuǎn)錄因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５ 和ＡｈＷＲＩ１ 在ｓｓｍ１ 中表達(dá)均有不同程度下調(diào)。 其中，與脂肪酸合成和糖酵解關(guān)系密切的ＡｈＷＲＩ１ 基因在ｓｓｍ１ 中的表達(dá)量顯著下調(diào)。 因此推測，ｓｓｍ１ 中ＡｈＬＥＣ１ 基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，影響ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 等基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致ｓｓｍ１ 種子胚胎發(fā)育和油脂積累的異常。

關(guān)鍵詞：花生、小種子突變體ｓｓｍ１、轉(zhuǎn)錄因子基因ＬＥＣ１、基因表達(dá)、種子發(fā)育、油脂積累

中圖分類號(hào)：Ｓ５６５.２、Ｑ７８６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：Ａ文章編號(hào)：１００１－４９４２（２０２４）０１－００１０－０７

油脂是油料作物種子主要的貯藏物質(zhì)，為種子萌發(fā)和幼苗生長提供能量。 花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙ￣ｐｏｇａｅａ Ｌ.）是我國重要的油料作物之一，我國花生生產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界第一。 我國食用油大量依賴進(jìn)口，提高花生油產(chǎn)量是解決油料短缺的有效途徑[１] ，提高籽仁含油量和產(chǎn)量是花生育種的重要工作。 研究發(fā)現(xiàn)，多種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)種子中油脂積累具有重要的調(diào)控作用。 例如，ＬＥＡＦＹ ＣＯＴ￣ＹＬＥＤＯＮ１（ＬＥＣ１）、ＬＥＣ２、ＡＢＳＣＩＳＩＣ ＡＣＩＤ ＩＮＳＥＮ￣ＳＩＴＩＶＥ ３（ＡＢＩ３）、ＦＵＳＣＡ３（ＦＵＳ３）、ＷＲＩＮＫＬＥＤ１（ＷＲＩ１）和ＡＧＡＭＯＵＳ￣Ｌｉｋｅ１５（ＡＧＬ１５）等轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控胚胎發(fā)育、脂肪酸合成和糖酵解途徑等方面都起著重要作用[２－１４] 。 ＬＥＣ１ 被認(rèn)為是種子發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，屬于核因子Ｙ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃ￣ｔｏｒ－Ｙ， ＮＦ－Ｙ）轉(zhuǎn)錄因子家族，編碼ＨＡＰ３ 復(fù)合體的一個(gè)亞基，通過與ＣＣＡＡＴ 順式作用元件結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)[３] 。 在胚胎發(fā)育早期，ＬＥＣ１ 對(duì)維持胚柄細(xì)胞以及子葉的特性具有重要意義，而在胚胎發(fā)育后期，ＬＥＣ１ 在種子積累儲(chǔ)存脂肪和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)以及種子獲得抗脫水能力過程發(fā)揮重要作用[４－１３] 。 在油菜種子中過量表達(dá)Ｂｎ￣ＬＥＣ１ 基因可使籽粒中的含油量提高２％ ～ ２０％，脂肪酸生物合成、蔗糖合成和運(yùn)輸、糖酵解等途徑相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，這些生物學(xué)途徑所需碳通量增加[１５] 。 在擬南芥幼苗、種子以及大豆種子中，利用芯片分析ＬＥＣ１ 基因的異位表達(dá)和缺失突變體，結(jié)果表明，ＡＢＩ３、ＦＵＳ 和ＬＥＣ２ 都受到ＬＥＣ１ 的調(diào)控[１５] 。 ＷＲＩ１ 在擬南芥種子的油脂積累過程中發(fā)揮著極其重要的作用，擬南芥ｗｒｉ１ 突變體中糖酵解和脂肪酸合成相關(guān)基因的表達(dá)呈下降趨勢[１６] ，種子含油量顯著降低[１７] 。 研究發(fā)現(xiàn)，ＷＲＩ１ 控制著多個(gè)糖酵解途徑關(guān)鍵酶的基因以及參與脂肪酸合成的基因的表達(dá)，包括ＰＫＰ２、乙酰輔酶Ａ 羧化酶（ＡＣＣａｓｅ）、蔗糖合成酶（ＳｕｃｒｏｓｅＳｙｎｔｈａｓｅ ２，ＳＵＳ２）等，而ＷＲＩ１ 的表達(dá)受到ＬＥＣ１和ＬＥＣ２ 的調(diào)控，因此，ＬＥＣ 是調(diào)節(jié)脂肪酸合成代謝的關(guān)鍵基因[１６，１８] 。 ＡＧＬ１５ 編碼一種ＭＡＤＳ 結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在種子發(fā)育過程中調(diào)節(jié)ＬＥＣ２、ＡＢＩ３ 和ＦＵＳ３ 等基因的表達(dá)[１９] 。

油料作物種子的正常生長發(fā)育與種子中油脂的積累密切相關(guān)。 植物種子油脂合成途徑已經(jīng)較為清楚，但是調(diào)控花生種子油脂合成的分子機(jī)理仍不明確，因此闡明花生種子發(fā)育過程中油脂合成的調(diào)控機(jī)理，對(duì)花生高油育種有重要意義。 我們前期研究中獲得一個(gè)種子變小、種皮皺縮的花生突變體ｓｓｍ１，與對(duì)照親本ＬＨ１１ 相比，該突變體種子含油量顯著降低，“球形胚”時(shí)期的胚胎明顯變小，且胚胎數(shù)目變少。 ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 種子發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在糖酵解途徑及脂肪酸生物合成和代謝途徑存在顯著富集，參與脂肪酸合成和代謝以及糖酵解途徑的眾多基因在ｓｓｍ１ 中表達(dá)顯著下調(diào)[２０] 。 為分析種子早期發(fā)育中的關(guān)鍵調(diào)控基因，本研究利用ｑＲＴ－ＰＣＲ 技術(shù)分析了ＬＥＣ１ 等轉(zhuǎn)錄因子基因在突變體合子受精及種子發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化，以期為篩選導(dǎo)致突變表型的候選基因、解析花生發(fā)育和油脂積累的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、深入研究調(diào)控花生油脂合成的分子機(jī)理及培育高含油量花生新品種提供參考。

１ 材料與方法

１.１ 植物材料

以山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所特色作物資源與分子技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的魯花１１ 號(hào)（ＬＨ１１）及其突變體ｓｓｍ１ 作為試驗(yàn)材料。 將ＬＨ１１ 用６０ Ｃｏγ 輻照誘變，對(duì)收獲的Ｍ２ 代種子進(jìn)行調(diào)查，獲得一個(gè)穩(wěn)定遺傳的小種子株系，命名為ｓｓｍ１（ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄ ｍｕｔａｎｔ １）。

２０２０ 年４ 月底將ＬＨ１１ 與突變體Ｍ４ 代種子種植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地，株距２０ ｃｍ，行距５０ ｃｍ，單粒播種[２１] 。 播種１４０ ｄ 后收獲，對(duì)單株結(jié)果數(shù)、單株幼果數(shù)、百果重和百仁重等性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

于花生開花期和莢果發(fā)育不同階段，采集開花之前未受精的子房（ＤＢＰ０）、受精１ ｄ 的子房（ＤＢＰ１）以及入土１０ ｄ（ＤＡＰ１０）、２０ ｄ（ＤＡＰ２０）、４０ ｄ（ＤＡＰ４０）膨大的未成熟種子。 采集的樣品用液氮速凍后放入－８０ ℃冰箱保存。

１.２ 種子營養(yǎng)成分含量測定

含油量及蛋白質(zhì)、脂肪酸的含量測定分別參照ＮＹ/ Ｔ １２８５—２００７、ＧＢ ５００９.５—２０１６、ＧＢ ５００９.６—２０１６ 規(guī)程進(jìn)行，在中國科學(xué)院油料作物研究所完成。

１.３ ＲＮＡ 提取與ｃＤＮＡ 合成

ＲＮＡ 使用天根公司的ＲＮＡ 提取試劑盒進(jìn)行提取，然后利用艾瑞克生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成ｃＤＮＡ。

１.４ ｑＲＴ－ＰＣＲ 檢測

參照陳娜等[２２] 的方法和條件進(jìn)行ｑＲＴ －ＰＣＲ。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰｒｅＭｉｘ 試劑盒購自艾瑞克生物公司。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 反應(yīng)體系[２３] 為２０μＬ，包括２×ＳＹＢＲ? Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳ Ｐｒｅｍｉｘ １０μＬ，稀釋至８ ｎｇ/ μＬ 的ｃＤＮＡ ２ μＬ，正、反向引物各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６ μＬ。 反應(yīng)程序：９５ ℃ ３０ ｓ、９５ ℃ ５ ｓ，６０ ℃ ３０ ｓ，４０ 個(gè)循環(huán)。 以花生Ａｃｔｉｎ 基因?yàn)閮?nèi)參，每個(gè)時(shí)期的樣品重復(fù)３ 次，采用２－ΔΔＣｔ法[２４] 計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，用ｌｏｇ２ＦＣ[ｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ）] 值表示基因相對(duì)表達(dá)的差異倍數(shù)。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 所用引物見表１。

２ 結(jié)果與分析

２.１ 花生ｓｓｍ１ 突變體表型分析

籽仁大小是影響花生產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一[２５] 。 突變體ｓｓｍ１ 的莢果和種子明顯小于ＬＨ１１，且種皮皺縮、顏色較深（圖１）。 以ＬＨ１１ 作為對(duì)照，對(duì)成熟后的突變體ｓｓｍ１ 的部分農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ｓｓｍ１ 的單株幼果數(shù)增多，單株結(jié)果數(shù)顯著增加，分別較對(duì)照增加３８.４６％和８８.０４％、百果重、百仁重分別較對(duì)照降低６４.９６％、６０.３１％，差異達(dá)極顯著水平、公斤仁數(shù)極顯著增加，約是ＬＨ１１ 的２.５ 倍、雖然突變體ｓｓｍ１ 的結(jié)果數(shù)多，但由于種子變小，幼果數(shù)多，產(chǎn)量大幅度降低，單株生產(chǎn)力較ＬＨ１１ 降低３４.１１％（表２）。

２.２ 種子營養(yǎng)成分含量與脂肪酸的組成

對(duì)ｓｓｍ１ 和ＬＨ１１ 干種子粗蛋白含量、含油量和主要脂肪酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果（表３）表明，ｓｓｍ１ 的含油量顯著降低，比ＬＨ１１ 降低１３.５３％。ｓｓｍ１ 突變體的粗蛋白、棕櫚酸、花生酸含量稍有升高，與ＬＨ１１ 差異較小、硬脂酸、油酸和亞油酸含量略降低，十七碳烷酸、十七碳一烯酸分別比ＬＨ１１ 降低３３.３３％、２５.００％，而亞麻酸、花生一烯酸、山崳酸、芥酸、二十四碳烷酸含量明顯升高。

２.３ ＬＥＣ１ 等轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)

利用ｑＲＴ－ＰＣＲ 分別檢測了ＬＨ１１ 和突變體ｓｓｍ１ 中ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５、ＡｈＷＲＩ１ 基因在花生合子受精及種子發(fā)育不同階段的表達(dá)情況，結(jié)果（圖２） 表明，在ＬＨ１１ 中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＷＲＩ１ 和ＡｈＡＧＬ１５ 在種子發(fā)育早期的表達(dá)總體上均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而ＡｈＡＢＩ３ 的表達(dá)呈一直上升趨勢。 在ｓｓｍ１ 中， 各基因表達(dá)水平明顯低于ＬＨ１１，其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＡＢＩ３ 表達(dá)呈持續(xù)上調(diào)趨勢、ＡｈＷＲＩ１ 在ＤＢＰ０—ＤＡＰ１０ 時(shí)期表達(dá)量升高，之后變化不大，各時(shí)期表達(dá)量均顯著低于ＬＨ１１、其余基因表達(dá)變化趨勢基本與ＬＨ１１ 中一致，且除ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＤＢＰ０ 和ＤＡＰ４０ 以及Ａｈ￣ＦＵＳ３ 在ＤＡＰ４０ 時(shí)期外， 表達(dá)量均顯著低于ＬＨ１１。 ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 的未受精子房（ ＤＢＰ０） 中差異不明顯， 但是在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０ 時(shí)期，即受精后子房以及胚胎發(fā)育早期，在ｓｓｍ１ 中的表達(dá)顯著下調(diào)，且ＡｈＬＥＣ１Ｂ 表達(dá)量的升高具有明顯的延遲性。 其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ在ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０ 時(shí)期表達(dá)量分別比ＬＨ１１ 降低５２.０４％、４５.４４％、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在種子胚胎發(fā)育早期（ＤＡＰ１０）表達(dá)較ＬＨ１１ 大幅下調(diào)，降低７７.８８％。而ＬＥＣ１ 下游調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡ￣ＧＬ１５ 在種子發(fā)育早期（ＤＢＰ０—ＤＡＰ２０ 時(shí)期） 的表達(dá)量逐步升高，但ｓｓｍ１ 的表達(dá)量顯著低于ＬＨ１１、ＡｈＡＢＩ３ 在ｓｓｍ１ 中的表達(dá)量明顯低于ＬＨ１１，且除ＤＢＰ１ 外， 均達(dá)顯著水平。 推測在ｓｓｍ１ 中，ＡｈＬＥＣ１ 可能作為上游關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)下調(diào)引起ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＷＲＩ１ 等下游轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量降低。 例如，ＡｈＷＲＩ１ 在ｓｓｍ１種子發(fā)育過程中表達(dá)量顯著降低，在營養(yǎng)物質(zhì)積累的ＤＡＰ２０ 時(shí)期其在ｓｓｍ１ 中的表達(dá)量比ＬＨ１１下調(diào)８２.９４％。

３ 討論與結(jié)論

ＬＥＣ１ 與植物胚胎發(fā)育和種子成熟密切相關(guān)，作為先驅(qū)轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育早期就被激活表達(dá)，原胚期和整個(gè)胚胎發(fā)生過程中都能檢測到其表達(dá)[２６] ，是調(diào)控胚胎成熟過程的關(guān)鍵因子[２７] 。前期對(duì)ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 的ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０、ＤＡＰ４０時(shí)期種子進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)與脂肪酸合成和代謝以及糖酵解相關(guān)通路中的眾多基因在ｓｓｍ１ 中表達(dá)顯著下調(diào)。 本研究對(duì)ＬＥＣ１ 等轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ｓｓｍ１ 合子受精和種子發(fā)育早期的表達(dá)與ＬＨ１１ 相比大幅度降低且表達(dá)延遲。 另外，在子房受精之前，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 的表達(dá)量在ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 中差異并不明顯，但是受精后開始出現(xiàn)顯著差異，直至ＤＡＰ４０ 時(shí)期兩者之間又無明顯差異，說明ＬＥＣ１ 在合子受精后開始對(duì)早期胚胎發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。

在ＬＥＣ１ 過表達(dá)的油菜和擬南芥中發(fā)現(xiàn)脂肪酸種類和脂質(zhì)水平顯著增加[１５] 、甘藍(lán)型油菜ｌｅｃ１突變體中種子含油量下降，與糖酵解和脂肪酸修飾的相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)[２８] 。 ＷＲＩ１ 控制著多個(gè)糖酵解途徑關(guān)鍵酶的基因以及參與脂肪酸合成的基因的表達(dá)。 擬南芥ｗｒｉ１ 突變體中關(guān)于糖酵解和脂肪酸代謝相關(guān)酶活性降低，ｗｒｉ１ 種子的含油量降低８０％[２９] 。 這些轉(zhuǎn)錄因子基因在胚胎和種子發(fā)育時(shí)期特異性表達(dá)，過量表達(dá)或抑制表達(dá)這些基因能提高含油量，證明了它們?cè)谡{(diào)控種子脂肪合成方面的重要作用[１５，２８] 。 在本研究中，ＡｈＬ￣ＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 正常表達(dá)的ＬＨ１１ 中其下游轉(zhuǎn)錄因子基因ＡｈＦＵＳ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 在ＤＡＰ１０ 時(shí)期后大幅度升高、但是在ｓｓｍ１ 中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０ 時(shí)期表達(dá)下調(diào)且顯著低于ＬＨ１１，ＡｈＦＵＳ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 的表達(dá)量同樣顯著下調(diào)且表達(dá)量的升高出現(xiàn)延遲性，同時(shí)，受到ＬＥＣ１ 調(diào)控的ＡＢＩ３ 和調(diào)節(jié)ＦＵＳ３ 等基因表達(dá)的ＡＧＬ１５ 轉(zhuǎn)錄因子基因在ｓｓｍ１ 中的表達(dá)量也降低。 ＤＡＰ１０—ＤＡＰ２０ 時(shí)期是養(yǎng)分物質(zhì)積累的重要時(shí)期， 在ＬＨ１１ 中ＬＥＣ１ 以及下游轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)趨勢與油脂合成相關(guān)基因表達(dá)趨勢一致，都呈上升趨勢，與油脂積累同步、而在ｓｓｍ１ 中，ＬＥＣ１ 及其下游轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)與ＬＨ１１ 相比在同時(shí)期顯著下調(diào)，油脂合成相關(guān)基因表達(dá)也顯著下調(diào)。 作為ＬＥＣ１ 靶基因的ＷＲＩ１ 轉(zhuǎn)錄因子在花生小種子突變體ｓｓｍ１ 中表達(dá)顯著降低，而受ＷＲＩ１ 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的ＰＫｐ２Ｂ（丙酮酸激酶）在ｓｓｍ１ 種子中表達(dá)量幾乎為零，糖酵解途徑中ＦＢＰＢ（果糖－１，６－二磷酸酶）和ＰＦＫＢ（磷酸果糖激酶）基因在ｓｓｍ１中表達(dá)也顯著下調(diào)[２０] ，影響了脂肪酸從頭合成所需原料乙酰ＣｏＡ 的正常合成。

ｓｓｍ１ 表現(xiàn)出種子皺縮、種皮顏色較深以及含油量下降的表型，這與擬南芥ｗｒｉ１ 突變體[２９] 和甘藍(lán)型油菜ｌｅｃ１ 突變體[２８] 表型基本一致。 可以推測，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 作為上游轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)量的顯著下調(diào)影響了ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３ 和Ａｈ￣ＷＲＩ１ 等下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而影響了脂肪酸合成和代謝以及糖酵解途徑中基因的表達(dá)，導(dǎo)致種子含油量明顯降低。 因此推測ＬＥＣ１ 基因參與了早期胚胎的發(fā)育調(diào)控，并且激活了下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，共同參與脂肪合成和糖酵解途徑。但是關(guān)于ＬＥＣ１ 及其下游轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控脂肪合成通路還有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)：

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