應(yīng)用ＳＴＲ 熒光標記分析煙臺地區(qū)草莓種質(zhì)資源遺傳多樣性

李愷睿 史慶瑤 樊銘璽 譚浩然 陳曉峰

摘要：本研究以煙臺地區(qū)１ 份野生草莓種質(zhì)和６ 份常規(guī)栽培品種為試材，選取已發(fā)表具有擴增多態(tài)性的１１ 對ＳＴＲ 熒光標記引物進行擴增，采用多重熒光毛細管電泳檢測，分析了該地區(qū)草莓種質(zhì)的遺傳多樣性，并構(gòu)建了其分子身份證。 結(jié)果表明，用這１１ 對引物從７ 份草莓種質(zhì)中共檢測到６０ 個ＳＴＲ 等位基因位點，平均每對引物５.４５ 個，擴增片段長度在９０～２７０ ｂｐ 之間，多態(tài)信息含量平均為０.６７６，可用于草莓種質(zhì)的多態(tài)性檢測。 聚類分析顯示７ 份草莓種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為０.０７７～０.８４２，在遺傳相似系數(shù)為０.２５７時，７ 份種質(zhì)被分為３ 個類群，Ｗ１（野生草莓）與Ｓ２（豐香種質(zhì)）同源性較高。 對７ 份草莓種質(zhì)進行不同等位基因編碼，構(gòu)建了分子身份證。 本研究結(jié)果可為煙臺地區(qū)草莓種質(zhì)資源鑒定、保護和開發(fā)利用提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：ＳＴＲ 熒光標記；草莓；遺傳多樣性；聚類分析；分子身份證；煙臺地區(qū)

中圖分類號：Ｓ６６３.９０３文獻標識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－００４３－０７

草莓（Ｆｒａｇａｒｉａ × ａｎａｎａｓｓａ Ｄｕｃｈ.）為薔薇科草莓屬草本植物，是栽培最多的小漿果，果實酸甜可口，栽培經(jīng)濟效益高，廣泛受到消費者和生產(chǎn)者的青睞[１－３] 。 栽培草莓于２０ 世紀初引入我國，截至２０１８ 年底，種植面積已達１７.３ 萬ｈｍ２，年產(chǎn)量超過５００ 萬ｔ，我國已超越美國成為世界第一草莓生產(chǎn)和消費大國[４] 。 我國的草莓主栽品種多為引進種，存在不適應(yīng)當?shù)卦耘鄺l件的問題，在抗病性、抗寒性方面存在明顯不足，而野生草莓（Ｆｒａ￣ｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ Ｌ.）在抗性方面具有獨特優(yōu)勢，可用作抗性育種的親本。 開展草莓種質(zhì)資源研究具有重要意義， 可為草莓品質(zhì)改良提供豐富的資源庫[５－１０] 。

分子標記法是一種可以在ＤＮＡ 水平上直接體現(xiàn)種質(zhì)資源多態(tài)性的分析方法，具有多態(tài)性高、不受環(huán)境因素影響的優(yōu)點，已成為種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的重要手段[１１－１３] 。 早期應(yīng)用于草莓的擴增片段長度多態(tài)性（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＡＦＬＰ）[１４] 、隨機擴增多態(tài)性ＤＮＡ（ ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡｓ，ＲＡＰＤ）[１５] 分子標記存在技術(shù)繁瑣、重復率差的問題， 而短串聯(lián)重復序列（ ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ），又名簡單重復序列（ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅ￣ｐｅａｔ， ＳＳＲ），具有擴增穩(wěn)定、準確、共顯性、簡單便捷的特點[１６－１８] ，近年來在草莓種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用日益增多。 黃志城等[１９] 篩選出２０ 對多態(tài)性高的引物，基于ＳＳＲ 分子標記技術(shù)構(gòu)建了９６ 份草莓種質(zhì)的ＤＮＡ 指紋圖譜庫；陳堅等[２０] 利用ＳＳＲ 分子標記對福建主栽的以及引進的１１ 個草莓種質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)聚類結(jié)果與種質(zhì)地理來源有高度相關(guān)性；刁霞[２１] 利用ＥＳＴ－ＳＳＲ 分子標記技術(shù)對采自中國西南地區(qū)的野生黃毛草莓種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明１６ 個黃毛草莓群體有較為顯著的遺傳變異。 目前，我國對于草莓種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究多集中于栽培種，對野生種的研究不足。

２０２２ 年，我們從山東省海陽市招虎山采集到一份耐寒性強的野生草莓種質(zhì)，為了深入開發(fā)利用該種質(zhì)，本研究利用ＳＴＲ 熒光標記法，分析了其與６ 份煙臺地區(qū)主栽草莓品種的遺傳多樣性，并構(gòu)建了它們的分子身份證，以期為煙臺地區(qū)草莓種質(zhì)資源保護和開發(fā)利用提供參考。

１ 材料與方法

１.１ 試驗材料

供試野生草莓種質(zhì)（ Ｆｒａｇａｒｉａ ｖｅｓｃａ Ｌ.） 于２０２２ 年采自海陽市招虎山，該野生種質(zhì)匍匐莖較細，節(jié)間長，葉橢圓形、深綠色、較薄，具有較強耐寒性，果實近球形、紅色、直徑０.５～１.０ ｃｍ。 ６ 份栽培品種為煙臺地區(qū)設(shè)施主栽品種。 ７ 份種質(zhì)均定植在中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院日光溫室中，具體信息見表１。

１.２ 試驗方法

１.２.１ ＤＮＡ 提取 采用Ｅｚｕｐ 柱式植物基因組ＤＮＡ 抽提試劑盒（ＥＺ－１０ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｐｌａｎｔ Ｇｅ￣ｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，上海生工生物工程股份有限公司） 提取草莓葉片ＤＮＡ。 對提取出的ＤＮＡ 樣本用１.２％瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，用超微量分光光度計檢測樣本的濃度和純度，經(jīng)檢測，ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０值為１.９２，在１.８～２.０ 之間，符合實驗要求。 將ＤＮＡ 樣本稀釋至２５ ｎｇ/ μＬ，置于－２０ ℃冰箱保存，用于后續(xù)的擴增實驗。

１.２.２ ＳＴＲ－ＰＣＲ 反應(yīng)體系的建立 從已發(fā)表文獻中選出被證實具有多態(tài)性擴增結(jié)果的１１ 對引物（表２）進行后續(xù)實驗，并使用不同熒光標記對１１ 對引物的正向５′端進行修飾，其中，引物ＳＴ１、ＳＴ３、ＳＴ５、ＳＴ７、ＳＴ８、ＳＴ１０ 使用ＦＡＭ（藍色）熒光標記，引物ＳＴ２、ＳＴ４、ＳＴ６、ＳＴ９、ＳＴ１１ 使用ＨＥＸ（綠色）熒光標記。

ＳＴＲ－ＰＣＲ 反應(yīng)體系為２５ μＬ，包括模板ＤＮＡ１ μＬ，正、反向引物（１０ μｍｏｌ/ Ｌ）各０.５ μＬ，ｄＮＴＰ（５ μｍｏｌ/ Ｌ） ０.５ μＬ，１０ ×Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（ＭｇＣｌ２ ） ２.５μＬ，Ｔａｑ 酶（５ Ｕ/ μＬ）０.２ μＬ，ｄｄＨ２ Ｏ １９.８ μＬ。 反應(yīng)程序：９５ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，６０ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，１０ 個循環(huán)；９４ ℃ 變性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，３０ 個循環(huán)；７２ ℃修復延伸１０ ｍｉｎ。 電泳檢測：加１.５％瓊脂糖于１×ＴＡＥ 溶液中，用４Ｓ Ｒｅｄ Ｐｌｕｓ 染色，點入樣品，在１１０ Ｖ、１００ ｍＡ 條件下電泳２０ ｍｉｎ。

１.２.３ 毛細管電泳檢測 將分子量內(nèi)標（ＬＩＺ５００）和去離子甲酰胺（ＨＩＤＩ）按１∶９９ 的體積比混合，共１ ０００ μＬ；將混合液加到９６ 孔反應(yīng)板中，每孔１０ μＬ；將反應(yīng)板迅速置于平板離心機中，１ ２００ｒ/ ｍｉｎ 離心１５ ｓ；在各孔板中加入１ μＬ 樣品，１ ２００ ｒ/ ｍｉｎ 離心１５ ｓ；使用封板膜密封９６ 孔板，振蕩后置于離心機中，１ ２００ ｒ/ ｍｉｎ 離心３０ ｓ，置于ＰＣＲ 儀中；９８ ℃變性５ ｍｉｎ，ＰＣＲ 反應(yīng)程序結(jié)束后立即置于冰水混合物上急速冷卻，待冷卻后置于平板離心機中，１ ２００ ｒ/ ｍｉｎ 離心１５ ｓ，使用ＡＢＩ３７３０ ＸＬ 型ＤＮＡ 分析儀檢測，進行電泳分析。

１.２.４ 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 根據(jù)毛細管電泳結(jié)果，人工讀取指紋圖譜，并將指紋圖譜轉(zhuǎn)化為０、１ 矩陣，運用ＤａｔｅＦｏｒｍａｔｅｒ 將矩陣轉(zhuǎn)換成相關(guān)軟件可以識別的格式，利用ＰｏｐＧｅｎ３２ 軟件計算觀測等位基因數(shù)（Ｎａ）、有效等位基因數(shù)（Ｎｅ）、Ｓｈａｎｎｏｎｓ信息指數(shù)（Ｉ）、觀測雜合度（Ｈｏ）、期望雜合度（Ｈｅ）、Ｎｅｉｓ 基因多樣性指數(shù)（Ｎｅｉｓ），利用Ｐｏｗ￣ｅｒ Ｍａｒｋｅｒ Ｖ３.２５ 軟件計算多態(tài)信息含量（ＰＩＣ），同時利用ＮＴＳＹＳｐｃ ２.１０ 軟件計算７ 份草莓種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)，最后繪制ＵＰＧＭＡ 聚類圖。

１.２.５ 分子身份證構(gòu)建 參照唐玉娟等[２６] 的方法，將每對引物檢測出的等位基因按ｂｐ 值從小到大順序排列，用阿拉伯數(shù)字１～９ 依次賦值，超過９的從英文字母Ａ 開始賦值，將每份種質(zhì)經(jīng)１１ 對引物檢測出的等位基因按照賦值編碼表賦值并串聯(lián)，得到２２ 位特有的字符串，即為該種質(zhì)的分子身份證。

２ 結(jié)果與分析

２.１ ＳＴＲ 標記結(jié)果多態(tài)性分析

用１１ 對引物對７ 份草莓種質(zhì)進行擴增，共檢測到等位基因６０ 個，各對引物檢出等位基因數(shù)在２～１０ 個之間，平均每對引物５.４５５ 個，其中，引物ＳＴ８ 檢出的等位基因數(shù)最多，ＳＴ１、ＳＴ６、ＳＴ７ 次之，ＳＴ２ 檢出的等位基因數(shù)最少（表３）。 每個引物的有效等位基因數(shù)介于２.０００～８.１６７ 之間，平均為４.２５５；Ｓｈａｎｎｏｎｓ 信息指數(shù)介于０.６９３ ～ ２.２０６ 之間，平均為１.４７３；觀測雜合度介于０.０００ ～ １.０００之間，平均為０.６６４；期望雜合度介于０.６４８～０.９４５之間，平均為０.７９３；Ｎｅｉｓ 基因多樣性指數(shù)介于０.５００～０.８７８ 之間，平均０.７２３；引物多態(tài)信息含量值介于０.３７５～０.８６６ 之間，平均為０.６７６，證明所選引物的多態(tài)性良好，可以用于草莓種質(zhì)的多態(tài)性檢測。 圖２ 為用熒光引物ＳＴ１ 擴增的毛細管電泳圖譜。

２.２ 草莓種質(zhì)間遺傳關(guān)系聚類分析

根據(jù)毛細管電泳結(jié)果讀取擴增產(chǎn)物長度，構(gòu)成７ 份草莓種質(zhì)的指紋圖譜（表４），將其轉(zhuǎn)化為０、１ 矩陣，用ＤａｔａＦｏｒｍａｔｅｒ 將０、１ 矩陣轉(zhuǎn)化為ＮＴ￣ＳＹＳｐｃ ２.１０ 軟件可以識別的格式，計算不同種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)（表５），并構(gòu)建遺傳聚類圖（圖２）。

７ 份草莓種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為０.０７７～０.８４２（表５）。 在遺傳相似系數(shù)為０.２５７ 時，７ 份種質(zhì)被分為３ 個類群，Ⅰ類群包括白雪和天使２ 份白草莓種質(zhì)，占總數(shù)的２８.６％；Ⅱ類群包括日本培育的紅顏、寧玉、章姬３ 份種質(zhì)，占總數(shù)的４２.９％；Ⅲ類群包含豐香和野生種２ 份種質(zhì)。 在遺傳相似系數(shù)為０.４４１ 時，Ⅱ類群又可被分為２ 個亞群，Ⅱ－１亞群包括紅顏、章姬２ 份種質(zhì)，其中章姬為紅顏的育種母本，而Ⅱ－２ 亞群僅寧玉１ 份種質(zhì)。 可見，具有相同果實顏色的種質(zhì)被聚到一起，野生種質(zhì)和豐香親緣關(guān)系較近。

２.３ 草莓種質(zhì)分子身份證構(gòu)建

將１１ 對引物按照擴增獲得的等位基因數(shù)量從多到少排列，若有２ 對及以上的引物具有相同的等位基因數(shù)量，則按照最小片段的大小進行排列，如本研究中引物ＳＴ４ 和ＳＴ５ 均檢測出６ 個等位基因，但引物ＳＴ４ 的最小片段為１１１ ｂｐ，小于引物ＳＴ５ 的最小片段１６３ ｂｐ，故引物ＳＴ４ 排在第５位，ＳＴ５ 排在第６ 位。 再將各引物的等位基因按照從小到大的順序排列，并從阿拉伯數(shù)字１ 開始賦值，大于９ 的部分從英文大寫字母Ａ 開始賦值，缺失條帶記為０。 將每份種質(zhì)讀取到的等位基因片段按照表６ 標準進行賦值，以種質(zhì)Ｓ４ 為例，其在１１ 個位點獲得的等位基因分別為１１９/１８９、１４５/１５４、１７７/１８８、２４９/２７０、１１６/１２３、１６３/１６８、１５５/１５７、１３５、１６９、２４８、１３９，對應(yīng)賦值分別為５Ａ、１４、１２、４７、３５、１４、２３、４４、１１、２２、２２，得到其分子身份證為５Ａ１４１２４７３５１４２３４４１１２２２２。 依此類推，獲得每份種質(zhì)的分子身份證，見表７。 可見，１１ 對熒光引物可以完全區(qū)分開７ 份草莓種質(zhì)。

３ 討論與結(jié)論

物種遺傳多樣性的開發(fā)是改良現(xiàn)有種質(zhì)的基礎(chǔ)，研究技術(shù)和手段對遺傳多樣性評價的準確性有很大影響。 相較于表型性狀研究，分子標記在基因水平上反映了不同種質(zhì)的遺傳差異。 ＳＴＲ 熒光標記檢測技術(shù)結(jié)合了ＳＴＲ 技術(shù)和熒光檢測技術(shù)的特點，解決了傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測精度低和效率低的問題[２３] ，近年來該技術(shù)在蘋果[２７] 、梨[２８] 、歐李[２９] 等植物上得到了廣泛應(yīng)用。 本研究選?。保?對ＳＴＲ 引物對煙臺地區(qū)１ 份野生種質(zhì)和６ 份栽培品種進行分子標記，平均各對引物檢測位點５.４５ 個，引物的多態(tài)性良好，該結(jié)果與李靜[２３] 的研究結(jié)果相符，檢測位點數(shù)符合實驗預期。 多態(tài)信息含量（ＰＩＣ）是衡量標記多態(tài)性的指標，可用于反映基因的多樣性，高度多態(tài)基因座的標準為ＰＩＣ>０.５[３０] 。 本研究選取的１１ 對熒光引物中，１０ 對熒光引物的ＰＩＣ>０.５，即９０.９％的引物為高度多態(tài)性位點。

分子身份證可以將指紋圖譜轉(zhuǎn)化為由數(shù)字和字母組成的字符串，并根據(jù)字符串生成可供快速識別的條形碼或二維碼，可以快速便捷地鑒別種質(zhì)[３１] 。 目前國內(nèi)尚未見有關(guān)草莓分子身份證的研究，本研究根據(jù)毛細管電泳結(jié)果人工讀取指紋圖譜并編碼賦值，構(gòu)建了煙臺地區(qū)７ 份草莓種質(zhì)的分子身份證，為草莓種質(zhì)的準確鑒別提供了依據(jù)。

本研究建立了７ 份草莓種質(zhì)的聚類分析圖，種質(zhì)遺傳相似系數(shù)范圍為０.０７７～０.８４２，低于韓柏明等[３２] 研究中草莓種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)（０.６２ ～１.００），說明這７ 份草莓種質(zhì)間的親緣關(guān)系相對較遠，這可能與所選引物數(shù)量較少且針對單一性狀有關(guān)。 從聚類結(jié)果來看，具有相似性狀的種質(zhì)（白雪、天使）被聚到一類，引自日本的３ 份種質(zhì)（寧玉、紅顏、章姬）被聚到一類，但具有同樣親本的種質(zhì)（紅顏、寧玉）遺傳相似系數(shù)較?。ǎ?４７１），沒有歸到同一亞類中。 該結(jié)果可能與栽培草莓遺傳基礎(chǔ)狹窄、栽培發(fā)展時間較短、人工選擇因素有關(guān)[３３] 。 野生種質(zhì)雖然與豐香聚到一類，但兩者遺傳相似系數(shù)（０.２９６）較小，說明該野生種質(zhì)具有獨特于栽培種質(zhì)的遺傳特性。

煙臺市是我國重要的果蔬生產(chǎn)基地，草莓種植面積約０.６６７ 萬公頃，占山東省草莓種植面積的１/５[３４－３６] 。 但目前對煙臺地區(qū)草莓種質(zhì)的相關(guān)研究不足，尤其對當?shù)匾吧葺N質(zhì)資源的研究尚屬空白。 野生種質(zhì)資源中往往存在大量抗性基因，可通過遠緣雜交用于培育抗性強的新品種，對草莓栽培種質(zhì)改良和新品種選育有重要意義[３７－４０] 。 本研究首次對煙臺地區(qū)１ 份野生種質(zhì)和６ 份栽培種質(zhì)進行ＳＴＲ 分子標記分析，構(gòu)建了各種質(zhì)的分子身份證，有助于當?shù)夭葺贩N鑒定和拓寬草莓遺傳基礎(chǔ)[４１] 。 煙臺地區(qū)野生草莓具有抗性強、遺傳特性獨立的特點，可為培育更多優(yōu)質(zhì)的草莓新品種提供優(yōu)良的種質(zhì)資源。

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