高寒地區(qū)菊芋青貯物料耐低溫乳酸菌的篩選與鑒定

魏曉強，孫雪梅，張海旺，王麗慧，楊世鵬，司 誠，鐘啟文，蘆光新

（1.青海大學農(nóng)林科學院, 青海 西寧 810016；2.青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實驗室,青海 西寧 810016；3.青海大學農(nóng)牧學院, 青海 西寧 810016）

青海省位于青藏高原東部，是我國四大牧區(qū)之一，平均海拔3 000 m 以上，年均氣溫≤ 5 ℃，屬于典型高寒地區(qū)[1]。目前全省草地載畜量1 608.07 萬羊單位，位于全國前列，但由于冷季缺草等因素使畜牧業(yè)發(fā)展嚴重受阻[2-3]。雖然近年來發(fā)展人工種草來緩解飼草不足問題，但受制于特殊氣候環(huán)境條件，依然無法滿足省內(nèi)龐大的牧草需求[4-5]。種植“食飼兩用”經(jīng)濟作物來補充飼草來源是解決問題的有效途徑之一。菊芋(Helianthus tuberosus)作為一種收獲塊莖的“食飼兩用”經(jīng)濟作物，具有耐寒[6]、抗旱[7]、耐鹽堿[8-9]、耐病、抗逆性強[10]等特點，能適應惡劣的氣候環(huán)境，在荒地、鹽堿地、砂礫等土壤中均可生長。其地上莖葉產(chǎn)量高，營養(yǎng)價值豐富，適口性好，莖葉飼用價值高于馬鈴薯(Solanum tuberosum)和向日葵(Helianthus annuus)，被視為一種優(yōu)質(zhì)粗飼料納入中國飼料原料數(shù)據(jù)庫[11-12]。

青貯作為飼料一種貯藏方式，通過乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)發(fā)酵產(chǎn)生有機酸，保證飼料鮮嫩及營養(yǎng)價值，還能刺激家畜食欲，增加采食量[13-14]。菊芋發(fā)酵后乳酸、干物質(zhì)、氨氮含量均符合優(yōu)等青貯飼料比例[15]。環(huán)境溫度是影響LAB 活性的重要因素[16]。通常菊芋青貯在室溫40～45 d 完成發(fā)酵[17]，但青海省在菊芋收獲期間日平均氣溫10 ℃左右，夜間有時降到0 ℃以下，低溫會延緩發(fā)酵進程，增加發(fā)酵時間，促進有害菌生長[18-19]。研究表明，環(huán)境溫度較低時，添加低溫LAB 可以有效提高青貯質(zhì)量。李平[20]以玉米(Zea mays)和苜蓿(Medicago sativa)為青貯原料，15 ℃下添加3 株低溫LAB 后，物料pH 和NH3-N 含量降低，乳酸含量顯著增加。目前關(guān)于菊芋青貯LAB 添加劑的研究只停留在常溫篩選[17,21-22]，耐低溫LAB 添加劑還未見報道，高寒地區(qū)因其獨特的地理環(huán)境，微生物長期生存會具有耐低溫、耐酸和耐鹽性強等適應環(huán)境的特性[23-24]，從高寒地區(qū)作物源生地采集耐低溫LAB 資源更為有效[25-26]。

因此，本研究從高寒地區(qū)菊芋地上部青貯物料中分離產(chǎn)酸高、生長快、耐低溫的LAB 菌株，通過生理生化鑒定及16S rDNA 測序技術(shù)確定菌株屬種，以篩選出適合菊芋低溫青貯發(fā)酵的LAB 添加菌株，為青海省菊芋產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展及低溫青貯技術(shù)建立提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選取青海大學農(nóng)林科學院自主選育品種‘青芋2 號’菊芋。供試材料‘青芋2 號’于2021 年5 月上旬種植在西寧市青海大學農(nóng)林科學院園藝創(chuàng)新基地試驗田(101°44′57.76″ E， 36°43′8.35″ N，海拔2 266.6 m)及貴南縣茫曲鎮(zhèn)加土乎村(100°46′24.7656″ E，35°33′59.4539″ N，海拔3 084.0 m)農(nóng)田中。

1.2 試驗設計

待菊芋生長至成熟期，2021 年10 月5 日刈割地上部莖葉，粉碎裹包青貯，粉碎長度(2 ± 1) cm，裹包規(guī)格550 mm (直徑) × 520 mm (高)，共3 個裹包；自然環(huán)境發(fā)酵90 d 后開包削去外層10 cm 青貯料，取內(nèi)層青貯材料200 g 放入無菌自封袋密封并加入冰袋，每個裹包3 次重復，共9 次重復，2 h 內(nèi)帶到實驗室開展LAB 分離純化。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 乳酸菌分離純化

稱取20 g 青貯樣品放置于錐形瓶中，加180 mL無菌水充分震蕩1 h 混勻，靜置30 min 后取上清液依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5共5 個梯度，制成菌液稀釋液。取各梯度稀釋液10 μL 涂布于MRS固體培養(yǎng)基，30 ℃倒置培養(yǎng)48 h，綜合菌落形態(tài)特征進行辨別及編號，挑選單菌落劃線擴大培養(yǎng)3 次。編號菌株依次進行革蘭氏染色鏡檢、接觸酶(過氧化氫酶)、葡萄糖產(chǎn)氣試驗，初步判定革蘭氏染色試驗陽性、接觸酶陰性為LAB 菌株，葡萄糖產(chǎn)氣陰性為同型發(fā)酵LAB，陽性為異型發(fā)酵LAB[27]。所篩選的LAB 菌株貯存于NB 培養(yǎng)基(含10%二甲基亞砜)，-80 ℃保存。

1.3.2 乳酸菌耐低溫能力測定

將貯存于-80 ℃的LAB 菌株4 ℃解凍，MRS液體培養(yǎng)基活化24 h，定菌數(shù)到1 × 108cfu·mL-1，按3%接種量接種于新的MRS 液體培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱0、5、10、15 ℃培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)前后測定吸光度(absorbance, OD600)。生長情況按OD600值增長量劃分，增長量0～0.2 為弱生長(W)，0.2～0.4 為正常生長(+)，0.4 以上為強生長(+ +)，0 為不生長(-)，液體MRS 為空白對照。

1.3.3 低溫乳酸菌功能測定

菌種制備：取100 μL 定菌數(shù)到1 × 108cfu·mL-1的活化菌液接種于10 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h 后按3%接種量接種于各試驗管中，液體MRS 為空白對照。

產(chǎn)酸：每2 h 測定pH，設置3 次重復，初始pH為6.5，24 h 后繪制產(chǎn)酸曲線。

生長：每4 h 測定OD600值，設置3 次重復，36 h后繪制生長曲線。

耐酸：用HCl 溶液調(diào)節(jié)管內(nèi)MRS 培養(yǎng)基pH 為3.0、3.5、4.0、6.0、7.0、8.0，接種72 h 后分析耐酸能力。

耐鹽：配置含3.0% 和6.5% NaCl 的MRS 培養(yǎng)基，接種72 h 后分析耐鹽能力[26]。

1.3.4 乳酸菌16S rDNA 測序及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

DNA 制備：菌株活化后于MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收菌體無菌水清洗3 次用于DNA 提取。利用天根細菌基因組DNA 提取試劑盒，參照試劑盒說明書提取各菌株DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

16S rDNA 擴增測序：采用細菌16S rDNA 通用引物F27 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和R1492 (5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′)，引物合成于華大基因科技有限公司。PCR 反應體系：2 ×PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA 模板1 μL，總體積20 μL。反應程序：95 ℃ 5 min 預變性，然后94 ℃ 45 s，退火55 ℃45 s，72 ℃ 45 s，30 個循環(huán)，最后72 ℃ 1 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送四川帕諾米克生物科技有限公司測序。所測得菌株序列上傳至www.ncbi.nlm.nih.gov 數(shù)據(jù)庫。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：將美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)數(shù)據(jù)庫中已知菌株相關(guān)序列與所測得菌株16S rRNA 序列進行比對，確定所測菌株種屬。MEGA 11.0 進行菌株序列比對與系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 軟件對數(shù)據(jù)進行基礎統(tǒng)計；采用Origin 2022 軟件分析菌株生長能力及產(chǎn)酸能力；采用SPSS 21.0 軟件對菌株各時間段內(nèi)生長能力及產(chǎn)酸能力數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用平均值±標準誤表示測定結(jié)果，并對所得數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 分析及Duncan 法多重比較，P< 0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離純化及耐低溫能力鑒定

通過觀察菌落形態(tài)特征，從MRS 培養(yǎng)基中挑選出298 株LAB 菌株，經(jīng)革蘭氏染色、過氧化氫酶和葡萄糖產(chǎn)氣試驗，最終篩選出34 株LAB 菌株，其中同型發(fā)酵LAB 26 株、異型發(fā)酵LAB 8 株(表1)；將篩選出的34 株LAB 菌株在0、5、10、15 ℃下培養(yǎng)3 d后進行篩選，發(fā)現(xiàn)在0 ℃下菌株均不能生長；5 ℃下有13 株能生長，分別為菌株XN07、XN25、GN02、XN01、XN09、XN11、XN16、XN18、XN24、XN30、XN33、GN10、GN12；10 ℃下13 株能生長；15 ℃下均能生長。根據(jù)菌株在低溫下的生長能力，選取在5 ℃下能生長的13 株菌株進行后續(xù)試驗。

表1 LAB 特征及耐低溫能力鑒定Table 1 Characteristics of LAB and identification of low temperature resistance

2.2 耐低溫乳酸菌糖酵解及生理生化特性

所篩選菌株XN18、XN25 為異型發(fā)酵LAB，其余均為同型發(fā)酵LAB。糖酵解試驗中同型發(fā)酵LAB 菌株能共同發(fā)酵的糖有葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維二糖、果聚糖、棉籽糖、山梨醇、水楊苷、七葉靈、甘露醇，菌株GN10 能發(fā)酵鼠李糖，所有同型發(fā)酵LAB 菌株均不能發(fā)酵淀粉；異型發(fā)酵LAB 菌株中，菌株XN18 不能發(fā)酵纖維二糖、果聚糖、淀粉，菌株XN25 不能發(fā)酵纖維二糖、淀粉、鼠李糖、山梨醇、水楊苷、甘露醇(表2)。

表2 耐低溫LAB 糖酵解及生理生化特性Table 2 Glycolytic mode and physiological and biochemical characteristics of low-temperature-tolerant LAB

13 株耐低溫LAB 菌株中，菌株XN01、XN07、XN09、XN24、XN30、GN02、GN10 能在pH 3.0 條件下生長，且均為同型發(fā)酵LAB，對低pH 耐受性較強；除異型發(fā)酵LAB 菌株XN18、XN25 外，其余菌株均能在pH 3.5 條件下生長；pH 4.0～8.0、NaCl 3%～6.5%條件下，所有菌株都能生長，表現(xiàn)出了較強的耐酸性及耐鹽性(表2)。

2.3 耐低溫乳酸菌生長及產(chǎn)酸能力分析

所得菌株生長曲線均呈先上升后下降的趨勢(圖1)。其中菌株XN09、XN24、GN02、GN10 生長8 h后進入對數(shù)生長期，OD600值迅速上升，菌株GN02 在24 h 時OD600值為2.63，最早達到生長峰值，且高于其余菌株，菌株XN09、GN10 于28 h 時達到生長峰值；菌株XN01、XN07、XN16、XN25、XN30、XN33、GN12 在12 h 后開始迅速生長，于28、32 h 相繼達到生長峰值，菌株XN33 在20 h 時生長速率變緩；菌株XN11、XN18 最晚進入對數(shù)生長期，32 h 達到峰值；36 h 后，菌株GN02、GN10、GN12 生長趨于平穩(wěn)，OD600值分別為2.23、2.26、2.23，高于其余菌株。

圖1 耐低溫LAB 菌株生長情況Figure 1 Growth of low-temperature-tolerant LAB strains

所有菌株的產(chǎn)酸曲線均呈下降趨勢(圖2)。0～8 h 內(nèi)菌株產(chǎn)酸較慢，僅有菌株GN12 產(chǎn)酸較快(pH 5.23)，最終pH 為4.29；菌株XN25 在8 h 時降幅開始增大，12 h 時趨于平穩(wěn)，最終pH 為4.69；10～16 h 時多數(shù)菌株都開始迅速產(chǎn)酸，菌株GN02在10 h 時降幅變大，菌株XN01、XN07、XN24、XN33在12 h 時降幅變大，菌株XN09、GN10 在16 h 時降幅變大，并始終保持下降趨勢；20～24 h內(nèi)，所有菌株產(chǎn)酸速率基本趨于平緩；全部產(chǎn)酸過程中，菌株XN11、XN16、XN18、XN30、GN12 降幅較為穩(wěn)定；24 h 時，所有同型發(fā)酵LAB pH 均在4.3 以下，高于異型發(fā)酵LAB，菌株XN07、XN09、XN24、GN02、GN10 pH 均在3.8 以下，分別為3.72、3.65、3.72、3.64、3.59，高于其余菌株。

圖2 耐低溫LAB 菌株產(chǎn)酸情況Figure 2 Acid production by low temperature-tolerant LAB strains

2.4 菊芋青貯耐低溫乳酸菌16SrRNA 序列分析

通過16SrRNA 測序分析測得13 株耐低溫LAB 序列并上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得登錄號(表3)。結(jié)合圖3 可知，菌株GN12 與植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarumc10 歸為同一族群，進化親緣度74%，序列相似度98.95%；菌株XN09 與植物乳桿菌L.plantarumKB-7 歸為同一族群，進化親緣度93%，序列相似度98.40%；菌株GN02 與植物乳桿菌L.plantarumHBUAS59622 歸為同一族群，進化親緣度73%，序列相似度99.44%；菌株XN33 與植物乳桿菌L.plantarum2652 歸為同一族群，進化親緣度70%，序列相似度98.75%；菌株XN16 與植物乳桿菌L.plantarumAR113 歸為同一族群，進化親緣度84%，序列相似度97.72%；菌株XN25 與短乳桿菌L.brevis2033 歸為同一族群，進化親緣度100%，序列相似度99.30%；菌株XN18 與棒狀乳桿菌L.coryniformisHBUAS56116 歸為同一族群，進化親緣度100%，序列相似度99.23%。菌株XN07、XN11、XN30 與植物乳桿菌L.plantarum3334、L.plantarum8276、L.plantarum1417 歸為同一族群，進化親緣度84%，序列相似度分別為99.09%、98.68%、99.16%。菌株XN01、GN10 與植物乳桿菌L.plantarumHBUAS67128、L.plantarumUIWO2，戊糖乳桿菌L.pentosusHBUAS68361、L.pentosusc18、L.pentosusMRKAK3 歸為同一族群，進化親緣度82%，兩種菌株與植物乳桿菌、戊糖乳桿菌的序列相似度均相同。菌株XN24 與植物乳桿菌L.plantarumHBUAS53364、戊糖乳桿菌L.pentosusHBUAS68361 的序列相似度都為95.25%。

圖3 耐低溫LAB 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of low temperature-tolerant LAB strains

表3 耐低溫LAB 菌株相似序列比對Table 3 Comparison of similar sequences of low temperature-tolerant LAB strains

3 討論與結(jié)論

低溫是延緩青貯發(fā)酵進程的主要因素之一，尤其在常年氣溫較低的高寒地區(qū)，低溫延長了青貯飼料的發(fā)酵時間，導致青貯飼料中的可溶性物質(zhì)大量流失，降低了飼料整體營養(yǎng)水平[28]。有研究表明，低溫青貯時添加耐低溫LAB 可以有效改善發(fā)酵進程，調(diào)控低溫對青貯造成的負面影響，提升青貯品質(zhì)[29]。Zhu 等[30]在燕麥(Avena sativa)青貯中添加耐低溫LAB FO3，5 ℃青貯60 d 后pH、NH3-N 含量均顯著降低，乳球菌(Lactococcus schleifer)比例增加，腸桿菌(Enterobacter hormaeche and Edwards)比例減少，顯著提高發(fā)酵質(zhì)量，同時調(diào)節(jié)細菌群落。因此低溫青貯中篩選可供添加的耐低溫LAB 顯得尤為重要。在高寒地區(qū)，微生物為應對低溫、低氧、低氣壓等惡劣環(huán)境，其功能基因發(fā)生突變，形成獨特的生理機能和抗逆能力[27]。趙繼麗[31]從青海省農(nóng)牧交錯區(qū)燕麥 + 箭筈豌豆(Vicia sativa)混播種植方式中篩選得到7 株LAB 在4 ℃培養(yǎng)條件下均可正常生長，菌株GN3 可耐受2 ℃低溫條件，并通過基因功能分析發(fā)現(xiàn)屎腸球菌(Enterococcus faecalis)GN3 菌株在極端環(huán)境下具備與生存能力相關(guān)的基因，低溫下將其接入4 種燕麥青貯種植方式中均有很好的效果。因此本研究從高寒地區(qū)菊芋青貯物料中篩選出13 株耐低溫LAB，后續(xù)添加到菊芋青貯過程中抵御低溫對青貯造成的影響具有很強的可操作性。

LAB 根據(jù)糖發(fā)酵模式分為3 個代謝類群：不發(fā)酵戊糖或葡糖糖酸鹽的專性同型發(fā)酵LAB，發(fā)酵戊糖或葡萄糖酸鹽的同型發(fā)酵LAB，從葡萄糖產(chǎn)生等量乳酸、CO2、乙酸(或乙醇) 的異型發(fā)酵LAB[32]。本研究從高寒地區(qū)青貯90 d 的菊芋青貯材料中篩選出13 株能在5 ℃條件下生長的耐低溫LAB，其中11 株同型發(fā)酵LAB，2 株異型發(fā)酵LAB，同型發(fā)酵LAB 表現(xiàn)出更強的耐酸性。有研究表明玉米、燕麥等作物在青貯60 d 后優(yōu)勢菌群為異型發(fā)酵LAB[30,33]，但在本研究篩選菌種中占比更高的是同型發(fā)酵LAB，異型發(fā)酵LAB 僅有2 株，這可能是因為在發(fā)酵初期，外界環(huán)境溫度比發(fā)酵中后期要高，青貯環(huán)境中的耐低溫同型發(fā)酵LAB 逐漸成為優(yōu)勢菌群，抑制了異型發(fā)酵LAB 的繁殖；隨著發(fā)酵時間的推進，異型發(fā)酵LAB 一般在發(fā)酵后期45～60 d 后開始出現(xiàn)[34]，但由于環(huán)境溫度逐漸降低，低溫抑制了異型發(fā)酵LAB 的繁殖，最終導致在青貯90 d 后同型發(fā)酵LAB 依然是青貯環(huán)境中的優(yōu)勢菌群，此情況下同型發(fā)酵LAB 會不斷消耗材料中的可溶性糖，加速營養(yǎng)物質(zhì)流失。

青貯生產(chǎn)中一般選用生長能力快、產(chǎn)酸能力強的LAB 添加劑，在青貯發(fā)酵起始階段能快速繁殖產(chǎn)酸，使青貯環(huán)境pH 迅速下降，有效抑制有害微生物，保證優(yōu)良的青貯品質(zhì)。本研究中，各菌株生長曲線呈先上升后下降的趨勢，產(chǎn)酸曲線呈下降趨勢，與前人研究結(jié)果一致[35]，菌株GN02、GN10 表現(xiàn)出更強的生長能力及產(chǎn)酸能力。這也是前人研究中同型發(fā)酵LAB 適合作為低溫發(fā)酵添加劑的依據(jù)之一[14,36]，但也有研究表明異型發(fā)酵LAB 能提升青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[37]。本研究中，異型發(fā)酵LAB 菌株XN25 產(chǎn)酸能力與生長能力均高于XN18，在5 ℃條件下能正常生長，具有作為低溫青貯發(fā)酵添加劑的潛力，這與李海萍等[38]的研究結(jié)果相似，但相關(guān)研究較少，需進一步挖掘菌株的特異性功能。

基于16S rRNA 編碼基因測序技術(shù)是目前劃分細菌種類最常用的技術(shù)之一[39]，一般細菌種間進化親緣度高于70%，序列相似度大于97%可以判定為同種細菌[40]。本研究中，菌株XN01、GN10 與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌進化親緣度為82%，且植物乳桿菌和戊糖乳桿菌在序列上的差異僅有2 bp；依據(jù)《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》[41]，植物乳桿菌不能發(fā)酵鼠李糖，戊糖乳桿菌能發(fā)酵鼠李糖；因此結(jié)合糖酵解結(jié)果鑒定出菌株XN01 為植物乳桿菌，菌株GN10 為戊糖乳桿菌；菌株XN24 序列相似度為95.25%，小于97%，不滿足鑒定條件，無法判定其種別。

綜上，本研究從高寒地區(qū)菊芋青貯材料中篩選出12 株耐低溫LAB，分別為植物乳桿菌XN01、XN07、XN09、XN11、XN16、XN30、XN33、GN02、GN12，戊糖乳桿菌GN10，棒狀乳桿菌XN18，短乳桿菌XN25。綜合產(chǎn)酸及生長能力，優(yōu)選出植物乳桿菌GN02、戊糖乳桿菌GN10、短乳桿菌XN25 適合作為青海高原菊芋青貯發(fā)酵LAB 添加劑。