單寧酸對豌豆蚜谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性與基因表達的影響

王繼祖，劉 磊，王森山，宋麗雯

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院, 甘肅 蘭州 730070）

豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)是豆科作物上的一種害蟲，具有繁殖速度快、環(huán)境適應(yīng)性強等特點，近年來對苜蓿(Medicago sativa)等豆科植物的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴重的威脅。在我國西北苜蓿種植區(qū)，豌豆蚜每年給苜蓿生產(chǎn)造成10%～30%的經(jīng)濟損失[1]。

單寧酸是植物的次生代謝產(chǎn)物，通過影響昆蟲的取食，從而對昆蟲的生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響[2]。邵婭等[3]研究發(fā)現(xiàn)，單寧酸對豌豆蚜的生長發(fā)育及繁殖具有明顯抑制作用。陸宴輝等[4]用單寧酸飼喂蚜蟲發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度在100 mg·kg-1以內(nèi)時，單寧酸對棉蚜(Aphis gossypii)的生長發(fā)育具有抑制作用；當(dāng)單寧酸濃度大于200 mg·kg-1時，棉蚜死亡率高達100%。單寧酸、沒食子酸還明顯抑制麥長管蚜(Sitobion avenae)羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione-S-transferaes, GST)的活力，降低蚜蟲解毒能力[5]。有研究表明，雖然苜蓿中含有單寧酸，但是豌豆蚜可以在苜蓿上正常生長發(fā)育[6]，表明其具有代謝單寧酸的能力。

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是具有多種功能的超基因家族酶系，普遍存在動植物、微生物中。目前研究表明，昆蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因分為Delta、Epsil、Omega、Sigma、Theta和Zeta6 個家族，其中Delta和Epsilon家族是昆蟲特有的GSTs家族[7]?，F(xiàn)已報道的豌豆蚜20 個GST基因主要以Delta和Sigma亞家族為主[8]。GST 主要功能是催化有毒物質(zhì)形成低毒、易溶于水的化合物而排出體外，減少或避免對機體造成損傷[9]。GST 作為昆蟲代謝外源物質(zhì)的主要酶之一，其活性受到植物次生物質(zhì)的誘導(dǎo)。研究表明，肉桂酸、水楊酸、花椒毒素、槲皮素、黃酮、香豆素、單寧酸、沒食子酸和蘆丁等植物次生物質(zhì)均能誘導(dǎo)斜紋夜蛾(Spodoptera litura)體內(nèi)GST 活性[10]。Wang 等[11]的研究結(jié)果表明，取食添加蘆丁、槲皮素、尼古丁、苦參堿、印楝素或魚藤酮的人工飼料后，短星翅蝗(Calliptamus abbreviatus)的GST 活性均顯著增加。亞洲小車蝗(Oedaleus asiaticus)的GST活性與食物中植物次生化合物的含量呈正相關(guān)關(guān)系[12]，類似的結(jié)果也在麥長管蚜中發(fā)現(xiàn)[13]。表明不同的植物次生物質(zhì)均可誘導(dǎo)昆蟲體內(nèi)GST 活性，且在一些昆蟲中存在劑量效應(yīng)。

GST家族基因在昆蟲代謝植物次生物質(zhì)的功能已經(jīng)被證實。斜紋夜蛾8 個GST基因經(jīng)番茄堿處理后上調(diào)，RNA 干擾降低其中一個GST基因GSTS1的表達后，番茄堿對幼蟲的毒性增加[14]?；ń范舅?、單寧酸、沒食子酸或蘆丁等植物次生物質(zhì)均可引起斜紋夜蛾SlGSTE1轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)[15]。此外，降低褐飛虱(Nilaparvata lugens)體內(nèi)NlGSTE1的表達量，導(dǎo)致褐飛虱對阿魏酸的敏感性增加[16]。干擾NlGST1-1的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致褐飛虱對含有蘆竹堿的飼料更加敏感[17]，此外，褐飛虱NlGST1-1的轉(zhuǎn)錄水平被降低后，若蟲的相對增長率和雌蟲繁殖力也顯著降低[18]。這些研究結(jié)果表明一種植物次生物質(zhì)可以誘導(dǎo)多個GST基因的上調(diào)，而且一個GST基因可以參與昆蟲對多種植物次生物質(zhì)的代謝，但豌豆蚜中GST基因的轉(zhuǎn)錄是否受到單寧酸的影響尚不清楚。

為明確單寧酸對豌豆蚜體內(nèi)GST 活性的影響，解析豌豆蚜不同組織GST基因在單寧酸處理前后轉(zhuǎn)錄水平的差異及變化規(guī)律，本研究以綠色型豌豆蚜為供試材料，測定豌豆蚜在單寧酸處理48 h 后GST 活性變化；通過分析文獻與豌豆蚜基因組數(shù)據(jù)，確定豌豆蚜體內(nèi)存在22 條GST基因；利用qPCR 解析豌豆蚜不同組織GST基因轉(zhuǎn)錄水平對單寧酸的響應(yīng)，旨為探究GST基因在豌豆蚜代謝單寧酸中的功能奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

挑選發(fā)育健康的綠色型豌豆蚜成蚜于離體蠶豆(Vicia faba)葉片上，在光照培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)[溫度：25 ℃，光周期：16 h/8 h (光/暗)]，待產(chǎn)蚜后剔除成蚜，培育至3 齡若蚜?xí)r用于試驗。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標儀(BioTek Instruments, Inc)、高速冷凍離心機、HQH-H300 智能人工氣候箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)、熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems 公司)、Eppendorf 型移液槍和水浴鍋等。

主要試劑：異丙醇(甘肅中瑞化工有限公司)、氯仿(成都市科隆化學(xué)品有限公司)、無水乙醇(成都市科隆化學(xué)品有限公司)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性檢測試劑盒(上海優(yōu)選生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒試劑盒(寶生物工程Takara 有限公司)、qPCR試劑盒(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司)等。

1.3 研究方法

1.3.1 單寧酸對豌豆蚜GST 活性的影響測定

試驗設(shè)置對照和處理兩組。采用離體葉片植物介導(dǎo)法[19]，將蠶豆苗插入1.5 mL 離心管中，再加入2 g·L-1單寧酸1 000 μL。然后將離心管轉(zhuǎn)移至一個覆蓋著紗布的透明塑料杯中，之后將3 齡若蚜挑取至塑料杯中的蠶豆苗上。讓其攝入單寧酸48 h，對照為清水。每個處理40 只蚜蟲，48 h 后每個處理收集0.02 g 蚜蟲鮮重，用于GST 活性測定，3 個生物重復(fù)。收集的蚜蟲經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用，測定時加入緩沖液研磨，制成酶液。

GST 活性測定方法：使用GST 活性檢測試劑盒，參照說明書測定并計算出豌豆蚜的酶比活力。

1.3.2 單寧酸對豌豆蚜GST基因表達的測定

1)樣品收集

試驗設(shè)置同1.3.1，每處理設(shè)4 個重復(fù)，每個重復(fù)50 只蚜蟲，48 h 后進行解剖，分別收集頭、胸、腹、中腸。收集的蚜蟲組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用。

2) cDNA 的制備

將樣品在低溫環(huán)境下研磨，用Trizol 法提取各組織總RNA，ScanDrop 微量核酸蛋白測定儀測定總RNA 濃度，選擇A260/A280> 1.8 且A260/A230> 1.8的樣品，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA 保存于-20 ℃作為qPCR 模板備用。

3)引物設(shè)計

豌豆蚜GTS基因的引物序列如表1 所列。

表1 豌豆蚜GST 基因qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequence from qRT-PCR for the GST genes of pea aphids

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016 統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)，整理后的數(shù)據(jù)根據(jù)2-ΔΔCt法計算相對表達量[20]。使用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，用獨立樣本t檢驗進行基因表達量顯著性分析，以P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，使用Origin 2018 軟件進行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 單寧酸對豌豆蚜GST 活性的影響

豌豆蚜取食2 g·L-1單寧酸48 h 后，其GSTs 活性為7.598 nmol·(min·g)-1，對照組GSTs 活性為11.036 nmol·(min·g)-1。測定結(jié)果表明，GST 活性有所下降，但與對照組相比差異不顯著(P> 0.05)。

2.2 單寧酸對豌豆蚜GST 基因qRT-PCR 分析

2.2.1 豌豆蚜頭部GST基因qRT-PCR 分析

通過對豌豆蚜頭部GST基因表達量測定分析，結(jié)果顯示，蚜蟲取食單寧酸后，其頭部有11 個基因表達水平變化顯著(P< 0.05) (圖1)，其中ApGST101、ApGST102、ApGST104、ApGST109、ApGST2、ApGSTX1、ApGSTD6顯著上調(diào)表達(圖1A)，ApGST101表達量上調(diào)2.5 倍；ApGST104、ApGSTX1上調(diào)表達3 倍左右；ApGST103、ApGST108、ApGSCD、ApGSTomega表達量下調(diào)(圖1B)，其中ApGST108、ApGSTCD下調(diào)表達3 倍左右；ApGST103、ApGSTomega下調(diào)表達1.4 倍左右。有11 個基因表達水平不顯著(P> 0.05) (圖1C)。

2.2.2 豌豆蚜胸部GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲取食單寧酸后，其胸部有15 個基因表達水平變化顯著(P< 0.05) (圖2)，其中ApGST101、ApGST102、ApGST103、ApGST104、ApGST109、ApGST2、ApGSTX4、ApGSTD5、ApGSTD6、ApGSTthet均上調(diào)表達，ApGSTD6相對表達量為對照組的6.4 倍；ApGST107、ApGST108、ApGST3、ApGSTX3、ApGSTomega被單寧酸抑制，呈下調(diào)表達(圖2B)，其中ApGST107、ApGSTomega下調(diào)表達5 倍左右；ApGST108、ApGST3、下調(diào)表達3.5倍；ApGSTX3下調(diào)表達1.6 倍。有7 個基因表達差異不顯著(P> 0.05) (圖2C)。

圖2 豌豆蚜取食單寧酸48 h 胸部GST 基因表達量的變化Figure 2 Changes in GST genes expression in the thorax of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

2.2.3 豌豆蚜腹部GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲取食單寧酸后，其腹部有16 個基因表達水平變化顯著(P< 0.05) (圖3)，ApGST101、ApGST103、ApGST104、ApGST105、ApGST107、ApGST702、ApGSTX1、ApGSTX5、ApGSTD6、ApGSTthet顯著上調(diào)表達，其中ApGST101、ApGST105表達量達到對照的5 倍；在單寧酸誘導(dǎo)下，ApGST108、ApGST109、ApGSTD5和ApGSTomega下調(diào)表達2 倍左右(圖3B)；ApGST3、ApGSTX3分別下調(diào)表達3.9 倍和6.2 倍。有6 個基因表達量差異不顯著(P> 0.05) (圖3C)。

圖3 豌豆蚜取食單寧酸48 h 腹部GSTs 基因表達量的變化Figure 3 Changes in GST gene expression in the abdomen of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

2.2.4 豌豆蚜中腸GST基因qRT-PCR 分析

蚜蟲取食單寧酸后，其中腸有13 個基因表達水平具顯著性差異(P< 0.05) (圖4)，其中ApGST104、ApGST105、ApGST107、ApGST2、ApGST3、ApGSTD6、ApGSTX4、ApGSTX6、ApGSTCD顯著上調(diào)表達(圖4A)，APGST105表達量上調(diào)最高，為對照的3.2 倍；有4 個基因下調(diào)表達(圖4B)，ApGSTomega下調(diào)表達最高，為7 倍左右；ApGST102和ApGST701下調(diào)表達2 倍左右；ApGSTthet下調(diào)表達3.3 倍。有9 個基因表達量差異不顯著(P> 0.05) (圖4C)。

圖4 豌豆蚜取食單寧酸48 h 中腸GST 基因表達量的變化Figure 4 Changes in GST gene expression in the midgut of pea aphids treated with tannic acid for 48 hours

3 討論

單寧酸是植物次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物中，對許多害蟲物種的生長具有內(nèi)源性抑制作用[21]。研究表明，單寧酸在昆蟲腸道中會與葉蛋白或消化酶形成復(fù)合物，降低昆蟲對食物的利用率并延緩昆蟲生長發(fā)育[22-23]。解毒酶在昆蟲代謝外源物質(zhì)中發(fā)揮重要的作用，是維持昆蟲正常生理功能的重要物質(zhì)[24]。昆蟲的主要解毒酶包括細胞色素P450 酶(Cytochrome P450, CYP450)、GST、羧酸酯酶(CarE)等。昆蟲在代謝外源物質(zhì)的過程中，GST 將其底物與谷胱甘肽分子結(jié)合，使底物更易溶于水；CYP450氧化其底物使其對偶聯(lián)酶具有反應(yīng)性；CarE 可水解許多含有內(nèi)源性和外源性酯的化合物[25]。解毒酶在昆蟲與寄主植物之間的相互作用中具有重要作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)單寧酸可影響GST 的活性并且在不同組織中對GST基因表達有一定的影響。

植物次生物質(zhì)對不同昆蟲的作用效果也不同。辣椒素對煙青蟲(Helicoverpa assulta) GST 有顯著的誘導(dǎo)作用，番茄苷則抑制其活性。而番茄苷、辣椒素對棉鈴蟲(Helicoverpa armigera) GST 并無顯著影響[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜取食2 g·L-1單寧酸48 h后，GST 活性下降，可能是由于豌豆蚜吸收單寧酸含量超過了自身解毒代謝的極限，導(dǎo)致解毒代謝功能下降，GST 活性降低。單寧酸對GST 活性的影響取決于劑量和時間，低劑量或短時間用單寧酸處理，GST 活性升高，反之，GST 活性降低或沒有影響[28]。如單寧酸對楊小舟蛾(Micromelalopha troglodyta) GST誘導(dǎo)具有明顯的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系[29]。通過對馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaea operculella)進行含煙堿飼料飼喂，發(fā)現(xiàn)煙堿處理后其體內(nèi)解毒酶CarE和GST 的含量呈逐漸降低的趨勢，可能是馬鈴薯塊莖蛾為了適應(yīng)煙堿而作出的響應(yīng)[30]。

研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素等可以誘導(dǎo)棉鈴蟲GST基因的上調(diào)表達，表明GST基因可能參與了棉鈴蟲對槲皮素的代謝過程[31]。此外，番茄堿可以誘導(dǎo)斜紋夜蛾GST基因的上調(diào)表達，利用RNA 干擾降低其中一個GST基因的表達后，番茄堿對幼蟲的毒性增加[32]。本研究通過實時熒光定量RT-qPCR 分析了蚜蟲中腸、頭部、胸部和腹部中22 個條GST基因的mRNA 相對表達水平。結(jié)果顯示，GST基因在蚜蟲不同組織中具有多樣化的表達模式。其中ApGST101在頭部的表達量上調(diào)了2.5 倍，ApGSTD6在胸部中的相對表達水平上調(diào)6.4 倍。這可能是由于唾液腺在解剖過程中并未分離的原因。昆蟲唾液腺具有排毒、抵抗植物次生物質(zhì)和外源有毒物質(zhì)的作用[33]。不同組織中，桃蛀螟(Dichocrocis punctiferalis)CYP4G113基因在唾液腺中的表達量最高。CYP4G113基因被干擾后，幼蟲在玉米(Zea mays)上的存活率、化蛹率等生命參數(shù)顯著降低。這可能是CYP4G113基因被干擾后影響了桃蛀螟對寄主次生物質(zhì)的代謝，有毒物質(zhì)大量積累，導(dǎo)致死亡[34]。當(dāng)桃蚜(Myzus persicae)取食含有茉莉酸和水楊酸的人工飼料后，唾液腺特異表達基因C002和sigma GST基因表達量顯著升高，表明桃蚜利用寄主植物次生代謝產(chǎn)物，提高相關(guān)解毒酶或唾液蛋白基因表達量，增強對寄主防御的適應(yīng)性[35]。

本研究中，ApGST105在中腸組織中表達水平最高。中腸是外源化合物解毒的重要部位，含有高水平表達的GST基因[36]。所以推測ApGST105基因可能參與了豌豆蚜對單寧酸的代謝過程。在對其他昆蟲的研究中也有類似結(jié)果，如美國白蛾(Hyphantria cunea)取食添加綠原酸的人工飼料后，中腸中1 個GST基因的mRNA 水平被顯著誘綠原酸誘導(dǎo)[37]。此外，昆蟲的脂肪體在其對植物次生代謝物和外源毒素解毒代謝的過程中也有重要作用[38]。如斜紋夜蛾進食0.01%單寧酸、0.5%單寧酸后，脂肪體SlGSTe1的表達量顯著上升，說明在一定濃度范圍內(nèi)，單寧酸可以使脂肪體的SlGSTe1表達上調(diào)[14]。而本研究中ApGST105在腹部中表達量上調(diào)5 倍，可能是因為脂肪體參與了豌豆蚜代謝單寧酸的過程。

經(jīng)單寧酸處理48 h 后，豌豆蚜體內(nèi)GST 活性降低，但部分GST基因顯著上調(diào)表達。這可能與豌豆蚜部分GST基因下調(diào)倍數(shù)較高有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，單寧酸對GST 活性以及GST基因的轉(zhuǎn)錄都產(chǎn)生了影響。后期將根據(jù)定量分析GST基因表達量的結(jié)果，篩選出關(guān)鍵基因，用RNAi技術(shù)驗證關(guān)鍵基因的基因功能，進一步闡釋豌豆蚜對單寧酸代謝機制。