柱花草耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選及對其青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善效果

潘俊歆，李雪楓，龍仕和，王 堅

（1.海南大學(xué)動物科技學(xué)院, 海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)林學(xué)院, 海南 ?？?570228）

柱花草(Stylosanthes guianensis)是原產(chǎn)自南美洲的豆科牧草，因在酸性和瘠薄土壤的適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價值豐富，成為熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要飼用牧草[1]。柱花草生長迅速，其地上生物量不但可以直接牧養(yǎng)家畜或刈割用作畜禽青飼料[2]，還可以制成青貯飼料來有效延長儲存時間，提高適口性，以供飼草料短缺時飼用[3]。但以柱花草等豆科牧草作為青貯原料時，因材料本身緩沖能高、所含水溶性碳水化合物低和表面附生的乳酸菌數(shù)量少，導(dǎo)致直接進(jìn)行青貯時無法得到高品質(zhì)的青貯飼料[4-5]。此外，在豆科牧草的青貯過程中經(jīng)常存在梭菌(Clostridiumspp.)發(fā)酵，產(chǎn)生丁酸的同時，導(dǎo)致青貯期間更多的營養(yǎng)成分損失[6-7]。因此，為了獲得高品質(zhì)豆科牧草青貯飼料，需要在青貯時添加相應(yīng)的添加劑以改善其發(fā)酵品質(zhì)。

目前，為改善豆科牧草的發(fā)酵品質(zhì)，青貯生產(chǎn)過程中應(yīng)用較多的是添加乳酸菌[8]，且相關(guān)研究工作主要在溫帶地區(qū)進(jìn)行。李榮榮等[9]在北京將植物乳桿菌(Lactiplantibacillus plantarum)添加至苜蓿(Madicago sativa)青貯飼料中，可有效促進(jìn)乳酸發(fā)酵、抑制梭菌生長，使高水分苜蓿青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)顯著提升；Bao 等[10]在山西調(diào)制苜蓿青貯飼料時，接種戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)也有相同的發(fā)現(xiàn)；Ni 等[11]在北京制作大豆(Glycine max)青貯飼料時，混合接種植物乳桿菌和戊糖片球菌后其發(fā)酵品質(zhì)也有提升。但關(guān)于熱帶地區(qū)青貯飼料制作的研究已發(fā)現(xiàn)，較高的環(huán)境溫度會影響乳酸菌的活性和代謝，抑制其發(fā)酵能力[12]；同時，高溫環(huán)境適宜真菌繁殖[13]，如霉菌的活動會導(dǎo)致產(chǎn)生霉菌毒素，影響青貯飼料的品質(zhì)與安全[14]，酵母菌的活動會與乳酸菌競爭發(fā)酵底物，影響青貯飼料品質(zhì)的同時導(dǎo)致乙醇的產(chǎn)生[15]，使原本常用的乳酸菌菌種添加無法達(dá)到有效改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的目的[12]。柱花草作為熱帶地區(qū)重要的豆科牧草，在青貯生產(chǎn)過程中因為環(huán)境溫度高也導(dǎo)致普通商業(yè)乳酸菌難以有效發(fā)揮作用[16]。因此，篩選適合熱帶地區(qū)青貯發(fā)酵的耐高溫乳酸菌可有效提高該地區(qū)青貯飼料生產(chǎn)水平。本試驗旨在篩選柱花草青貯調(diào)制時的優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌，并探索將其接種至柱花草原料后再青貯發(fā)酵對其青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分的影響，以期發(fā)掘和利用海南省本土優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌資源，為改善柱花草青貯品質(zhì)和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)柱花草青貯飼料提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗對象為熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植的柱花草‘熱研2 號’(S.guianensis‘Reyan No.2’)。2020 年10月下旬將柱花草種子播種于育苗盤，待幼苗生長至株高12～15 cm 時移栽種植于海南大學(xué)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)基地試驗小區(qū)(19°32′ N, 109°35′ E)，株行距為50 cm × 50 cm，小區(qū)內(nèi)均勻施過磷酸鈣230 kg·hm-2翻埋于耕層作基肥。移植后在前2 周內(nèi)每隔3 d 先拔除行間雜草，再澆水一次，同時在未成活植株處及時補(bǔ)栽相似大小的幼苗；全部幼苗成活后，改為每周澆水、除草一次，下雨則不澆水，待柱花草植株封行后，不再澆水和除草。2021 年4 月初柱花草處于旺盛營養(yǎng)生長期時第1 次刈割，用于優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌篩選與鑒定試驗。10 月初柱花草處于初花期時進(jìn)行第2 次刈割，用于篩選出的乳酸菌回接柱花草青貯試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐高溫乳酸菌的分離、初篩、保存與生理生化特性測定

分離、初篩與保存：將第1 次刈割后得到的柱花草莖葉用鍘刀切成2～3 cm 的小段，將切短后的柱花草混合均勻后分成為兩部分，一部分直接用于分離鑒定新鮮柱花草莖葉中的乳酸菌，另一部分在裝入青貯袋中，抽真空密封后室溫發(fā)酵60 d。參考付浩等[17]、Dong 等[18]的試驗方法，分別取20 g 樣品和90 mL 無菌生理鹽水混勻恒溫(37 ℃)震蕩后，將上清液梯度稀釋(1 × 10-7～1 × 10-1)后涂布于MRS瓊脂培養(yǎng)基，45 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色和光澤，釣取典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色與過氧化氫觸酶試驗；每個梯度設(shè)5 個重復(fù)。對革蘭氏染色結(jié)果為陽性、過氧化氫觸酶結(jié)果為陰性的菌株純化、富集后放入裝有甘油的保藏管中-80 ℃保存?zhèn)溆肹19]。

生理生化特性測定：將保存?zhèn)溆玫某鹾Y耐高溫乳酸菌菌株復(fù)蘇后在37 ℃培養(yǎng)12 h，參考凌代文和東秀珠[20]的方法，一部分測定各菌株在5～55 ℃下的生長情況；另一部分菌株測定乳酸菌的耐酸能力與耐鹽能力。同時，利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(杭州微生物試劑有限公司)檢測各初選耐高溫乳酸菌對18 種碳源的利用情況[21]。此外，分別在初始pH 6.2 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中接種3%的初篩耐高溫乳酸菌菌株的菌懸液，在45 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，對照組為未添加乳酸菌菌懸液的MRS 肉湯培養(yǎng)基，每隔2 h 取一次樣測定各初篩乳酸菌菌株的OD600值與pH。每個試驗設(shè)置4 個重復(fù)。

1.2.2 初篩耐高溫乳酸菌的16S rRNA 基因鑒定

用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司) 提取初篩純化后的各乳酸菌菌株的全基因組，參考Sharma 等[22]的方法設(shè)計PCR 體系，PCR擴(kuò)增其16S rRNA 基因序列，通用引物(27F: AGAG TTTGATCMTGGCTCAG 1 492R: GGTTACCTTGTTA CGACTT)，將PCR 產(chǎn)物通過瓊脂凝膠電泳檢測其是否為目的條帶，回收產(chǎn)物后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測定的16S rRNA 基因序列提交NCBI 進(jìn)行同源性比對分析，根據(jù)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 篩選出的耐高溫乳酸菌接種柱花草青貯試驗

將第2 次刈割收獲的柱花草用鍘刀切成2～3 cm的小段混合均勻，每300 g 稱取一份接種乳酸菌。共設(shè)3 個接種處理組：接種前述篩選出的耐高溫乳酸菌菌株S1 (簡稱S1 組)，接種前述篩選出的耐高溫乳酸菌菌株S4 (簡稱S4 組)，接種購自上海生工生物工程股份有限公司的植物乳桿菌ATCC8014(簡稱LP 組)，每組接種量均為1.0 × 106cfu·g-1FM；以柱花草中添加相同體積的無菌去離子水為對照組(簡稱CK 組)。每個處理組設(shè)3 個重復(fù)。接種處理后的柱花草裝入青貯袋，抽真空密封，室溫環(huán)境(30～35 ℃)青貯發(fā)酵30 d。

青貯30 d 后開封，對柱花草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)成分進(jìn)行測定。參考龍仕和等[23]的方法，青貯飼料在4 ℃下用去離子水浸提24 h 得到的濾液中加入1 mL 50% H2SO4溶液，一部分用于測定pH(pH 計法)、氨態(tài)氮(苯酚-次氯酸鈉比色法)和有機(jī)酸含量(高效液相色譜法)；另一部分用于微生物計數(shù)，參考Chen 等[24]的方法，乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)用MRS 瓊脂培養(yǎng)基、腸桿菌用紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)在37 ℃下培養(yǎng)2 d 后計數(shù)，酵母菌與霉菌均用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)在25 ℃下培養(yǎng)3 d 后計數(shù)。收集濾液后青貯袋內(nèi)剩余的樣品在65 ℃烘箱中烘72 h 以上至恒重，先測定青貯飼料的干物質(zhì)含量，再將樣品粉碎用于測定柱花草青貯飼料的水溶性碳水化合物含量(硫酸-蒽酮比色法)、粗蛋白含量(凱氏定氮法)和中性洗滌纖維與酸性洗滌纖維(范氏纖維測定法)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2013 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 25 (IBM SPSS Inc., Chicago, USA)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。各耐高溫乳酸菌菌株在相同培養(yǎng)時間下的生長、產(chǎn)酸情況和接種柱花草后青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)各指標(biāo)的差異均在P= 0.05 水平采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和鄧肯法多重比較，所有數(shù)值用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 8.0繪制篩選出的耐高溫乳酸菌菌株的生長速率曲線和產(chǎn)酸速率曲線。耐高溫乳酸菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹采用Neighbor-Joing 法用Mega 7.0 軟件構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫乳酸菌的篩選與生理生化鑒定

2.1.1 耐高溫乳酸菌初篩

從柱花草青貯飼料中初步分離共得到140 株乳酸菌(圖1)。這140 株乳酸菌接種在MRS 液體培養(yǎng)基、45 ℃培養(yǎng)24 h 后，其中有7 株乳酸菌菌株的菌體細(xì)胞密度OD600≥ 1.0 且pH < 5.0，為本研究篩選得到的優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌，將其分別命名為S1、S2、S3、S4、S5、S6 和S7。

圖1 篩選得到的140 株乳酸菌培養(yǎng)24 h 后的OD600 值與pHFigure 1 OD600 and pH values of 140 screened lactic acid bacteria strains after 24 h of culture

圖2 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株在45 ℃時的生長速率曲線(A)和產(chǎn)酸速率曲線(B)Figure 2 Growth rate curve (A) and acid production rate curve (B) of thermotolerant strains at 45 ℃

2.1.2 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)菌株的生理特性

初篩得到的7 株耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株的革蘭氏染色結(jié)果均為陽性，過氧化氫觸酶試驗結(jié)果均為陰性，其中僅S3 菌株為桿狀，其余6 株菌株均為球狀(表1)。初篩所得的7 株乳酸菌均可在NaCl 含量為3.0%的MRS 肉湯培養(yǎng)基中正常生長，在NaCl 含量為7.5%的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，S1、S2、S3、S5 和S6 菌株均能正常生長，S4 和S7 菌株生長微弱。對溫度的適應(yīng)性方面，7 株初篩乳酸菌菌株在15～45 ℃下均可良好生長，但10 ℃低溫下S1、S2、S3、S5 和S6 菌株能正常生長，S4 和S7 菌株不能生長；在50 ℃高溫下，S1、S2、S5 和S6 菌株均不能生長，但S3 和S4 菌株能良好生長，S7 菌株微弱生長。耐酸性能方面，初篩得到的7 株乳酸菌在pH3.5 的MRS 肉湯培養(yǎng)基質(zhì)中均不能生長；在pH 為4.0 的基質(zhì)中，S3 菌株可以正常生長，S4 菌株生長微弱，其他菌株也不能生長；MRS 肉湯培養(yǎng)基質(zhì)的pH 為4.5 時，7 株乳酸菌均可生長，但S1、S2、S5 和S6 菌 株的生長相對微弱；基質(zhì)的pH 5.0 時，7 株乳酸菌均可正常生長。

表1 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株的生理特性比較Table 1 Comparison of physiological characteristics of thermotolerant LAB strains

2.1.3 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)菌株利用碳源的能力

初篩得到的7 株優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌菌株均可以利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、菊糖、松三糖、纖維二糖、七葉苷、果糖、水楊苷、蕈糖和甘露醇這11 種碳源為底物進(jìn)行發(fā)酵，均不能利用木糖、棉子糖和蜜二糖為底物發(fā)酵(表2)，但對乳糖、蔗糖、山梨醇和鼠李糖的利用能力存在差異，其中僅S4 和S7 菌株不能利用乳糖和山梨醇為底物進(jìn)行發(fā)酵，S1、S3、S4 和S7 菌株對蔗糖的發(fā)酵能力相對較弱，S3 菌株對鼠李糖的發(fā)酵能力也相對較弱，而S4 和S7 菌株不能利用鼠李糖進(jìn)行發(fā)酵。

2.1.4 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)菌株的生長特性及產(chǎn)酸速率

7 株乳酸菌在45 ℃下培養(yǎng)時，遲滯期不明顯，接種2 h 后進(jìn)入對數(shù)生長期(圖2A)； 接種6 h 后先是S1、S5 和S6 菌株進(jìn)入生長相對穩(wěn)定期，在8 h 后S3 菌株、10 h 后 S4 和S7 菌株進(jìn)入生長相對穩(wěn)定期，而S2 在接種14 h 后才進(jìn)入生長相對穩(wěn)定期；培養(yǎng)24 h 后，乳酸菌菌株S3 的OD600值高于其余6 株的對應(yīng)值，達(dá)1.462，在45 ℃下的生長能力最強(qiáng)。篩選出的7 株乳酸菌在45 ℃下的產(chǎn)酸速率與生長曲線相對應(yīng)， MRS 肉湯培養(yǎng)基的pH 在接種2 h 后快速降低，在接種12 h 后趨于平穩(wěn)(圖2B)；接種24 h后，乳酸菌菌株S1 與S4 的產(chǎn)酸能力相對最強(qiáng)，分別使培養(yǎng)基的pH 降低至4.75 和4.79，低于與其他5 株乳酸菌菌株接種24 h 后的pH 平均值其中菌株S1 的pH 降低了3.26%，菌株S4 的pH 降低了2.24%(圖2B)。

2.2 初篩耐高溫優(yōu)質(zhì)菌株16S rRNA 基因鑒定

對7 株乳酸菌的測序結(jié)果拼接得到的16S rRNA 基因序列比對發(fā)現(xiàn)，S1、S2、S5 和S6 菌株與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)的相似度均達(dá)到100%，S3 菌株與人參土芽孢桿菌(Weizmannia ginsengihumi)的相似度達(dá)到100%，而S4 與S7 與戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的相似度均為99.79% (表3)。選擇與7 株乳酸菌相似的菌種序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，S1、S2、S5 和S6 菌株與糞腸球菌處于同一進(jìn)化分支，S3 菌株與人參土芽孢桿菌處于同一進(jìn)化分支，S4 和S7 菌株與戊糖片球菌處于同一進(jìn)化分支(圖3)。

表3 初篩優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌菌株的16s rRNA 基因序列分析Table 3 Sequence analysis of 16S rRNA gene of thermotolerant LAB strains

圖3 基于乳酸菌16s rRNA 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 3 Phylogenetic tree of the LAB strains according to 16S rRNA gene sequences

2.3 接種篩選出的耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株對柱花草青貯品質(zhì)的影響

2.3.1 接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌后柱花草青貯飼料的營養(yǎng)成分

柱花草接種植物乳桿菌青貯30 d 后，青貯飼料的干物質(zhì)(dry matter，DM)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量比CK 組分別提高了14.40%、5.52%、12.94% (P< 0.05)，而水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC) 和粗蛋白(crude protein，CP)含量比CK 組分別降低了26.34%和24.85% (P<0.05) (表4)。柱花草接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S1 青貯30 d 后，青貯飼料的DM 和NDF 含量分別較CK 組的顯著提高了11.83%和7.51%；WSC 含量比CK 組顯著降低了22.66% (P< 0.05)，與LP 組無顯著差異(P> 0.05)；CP含量和ADF 含量均與CK 組無顯著差異，但前者比LP 組顯著增加了31.74% (P<0.05)，后者比LP 組顯著降低了11.66% (P< 0.05)。接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S4 后，青貯原料的DM 含量分別比CK 組和S1 組顯著提高了18.92%和6.33% (P< 0.05)，但與LP 組相比無顯著差異；WSC含量顯著低于CK 組，但與S1 組和LP 組相比顯著提高了14.29%和20.00% (P< 0.05)；CP 含量顯著低于CK 組和S1 組(P< 0.05)，與LP 組相比無差異顯著；NDF 含量顯著高于CK組(P< 0.05)，與S1 和LP 組相比無差異顯著；ADF含量顯著高于CK 組和S1 組2.10% 和2.34% (P< 0.05)，而比LP 組顯著降低了9.59% (P< 0.05)。

表4 接種耐高溫乳酸菌菌株后柱花草青貯飼料營養(yǎng)成分的變化Table 4 Changes in nutrient composition of stylo silage inoculated with thermotolerant LAB strains

2.3.2 接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌后柱花草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)

柱花草接種植物乳桿菌青貯30 d 后，青貯飼料的pH、乳酸(lactic acid，LA) 含量、乙酸(acetic acid，AA)含量和丁酸(butyric acid，BA) 含量分別比CK組顯著降低了6.40%、51.09%、29.11%和46.70% (P<0.05) (表5)。柱花草接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S1 青貯30 d 后，青貯飼料的PA 含量與CK 組無顯著差異；pH、AA 含量、BA 含量和氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量分別較CK組顯著降低了12.05%、66.46%、81.87% 和35.73% (P< 0.05)；LA 的含量組CK 組無顯著差異(P> 0.05)，但與LP 組相比顯著提高了76.54% (P< 0.05) (表5)。柱花草接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S4 青貯30 d 后，青貯飼料的pH、BA 含量和NH3-N 含量較CK 組顯著降低了11.86%、84.62%和32.99% (P< 0.05)；LA 含量與CK 組相比顯著降低了21.31% (P< 0.05)，但與LP 組相比顯著提高了60.89% (P< 0.05)，與S1 組無顯著差異；AA 含量與CK 組相比顯著降低了42.72% (P< 0.05)，與S1 組相比顯著提高了70.75%，與LP 組無顯著差異；丙酸(propionic acid，PA)含量與CK 組相比顯著降低44.40% (P< 0.05)，與S1 組和LP 組無顯著差異(表5)。

表5 接種耐高溫乳酸菌對柱花草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響Table 5 Effects of inoculation thermotolerant LAB strains on the fermentation quality of stylo silage

2.3.3 接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌后柱花草青貯飼料的微生物組成

柱花草原料接種植物乳桿菌青貯30 d 后，青貯飼料的LAB 數(shù)量較CK 組顯著提高了2.60% (P<0.05)，接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S1 后，青貯飼料的LAB 數(shù)量較CK 組顯著降低了3.10% (P< 0.05)，接種耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S4 后，青貯飼料的LAB數(shù)量與CK 組相比無顯著差異(表6)。接種植物乳桿菌和耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株S1 與S4 對腸桿菌科的數(shù)量均無顯著影響，4 個試驗組均未檢測到酵母菌和霉菌的存在。

表6 接種耐高溫乳酸菌對柱花草青貯飼料微生物組成的影響Table 6 Effects of inoculation thermotolerant LAB strains on microbial composition of stylo silage lg cfu·g-1

3 討論與結(jié)論

3.1 耐高溫乳酸菌的篩選及鑒定

本研究從柱花草青貯飼料中篩選出了7 株能夠耐受45 ℃高溫的乳酸菌菌株，其中S3、S4 和S7 菌株還可以耐受50 ℃高溫。這7 株菌株能耐受基質(zhì)7.5%的NaCl 含量，也能耐受pH 4.5 的酸度，但S4 和S7 菌株在NaCl 含量7.5%的基質(zhì)中生長相對較弱，S3 和S4 菌株還可以耐受pH 4.0 的酸度。根據(jù)不同微生物對碳源的利用性差異鑒定發(fā)現(xiàn)，18 種碳源中，7 株菌株均不能利用木糖、棉子糖和蜜二糖，這與糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的特性一致[20]；其中S2、S5 和S6 菌株對碳源的利用情況相一致，可初步判定它們?yōu)橥痪?，而S1 菌株對蔗糖的利用能力比S2、S5 和S6 菌株弱，可能是新菌株；S3 菌株對蔗糖和鼠李糖的利用性均較差，且其形狀為桿狀，這與Nguyen 等[25]的研究結(jié)果一致，因而將菌株S3初步鑒定為人參土芽孢桿菌；而S4 和S7 菌株不能利用乳糖和鼠李糖、對蔗糖的利用性較差這一特性與戊糖片球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對碳源的利用能力高度相似，唯一的區(qū)別在于戊糖片球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株對甘露醇有一定的利用能力[20]。因為傳統(tǒng)的微生物鑒定法存在難以精確區(qū)分界限模糊的相似菌株這一缺陷[18]，本研究采用分子生物學(xué)分析通常選擇的16S rRNA基因技術(shù)對7 株優(yōu)質(zhì)耐高溫乳酸菌進(jìn)行了綜合分析，確定S1、S2、S5 和S6 菌株同為糞腸球菌，S3 菌株為人參土芽孢桿菌，S4 和S7 菌株為戊糖片球菌。本研究與關(guān)皓等[19]從西南高溫高濕地區(qū)篩選乳酸菌的研究相比，均篩選得到戊糖片球菌，不同的是本研究還篩選得到了糞腸球菌與人參土芽孢桿菌，這可能是因為本研究同樣以新鮮牧草作為原料進(jìn)行篩菌導(dǎo)致的。S1 和S2、S5 和S6 菌株之所以在蔗糖利用能力上出現(xiàn)微弱差異的原因可能是試驗操作誤差造成的。

乳酸菌的生長動態(tài)曲線與產(chǎn)酸動態(tài)曲線是反映乳酸菌發(fā)酵能力的重要依據(jù)[26]，Cai[27]的研究指出片球菌屬(Pediococcus) 與腸球菌(Enterococcus)是發(fā)酵的啟動乳酸菌，可以在青貯發(fā)酵前期迅速建立酸性環(huán)境，使青貯發(fā)酵前期的pH 快速降低。本研究分離得到的7 株乳酸菌在45 ℃下均能快速繁殖，接種后2 h 就開始降低MRS 肉湯培養(yǎng)基的pH，12 h 使基質(zhì)的pH 降至最低水平，說明它們在高溫條件下依然具有良好的產(chǎn)酸能力。這7 株乳酸菌中，接種S1 和S4 菌株的基質(zhì)在接種后12 h 時的pH 顯著低于接種其余5 株乳酸菌的pH，因此本研究從初篩得到的7 株乳酸菌菌株中選取S1 和S4 菌株(即糞腸球菌和戊糖片球菌)進(jìn)行接種柱花草青貯試驗，探索這兩種乳酸菌對柱花草青貯品質(zhì)的影響。

3.2 篩選得到的優(yōu)質(zhì)乳酸菌菌株接種對柱花草青貯品質(zhì)的影響

柱花草因粗蛋白含量較高且水溶性碳水化合物含量較低與禾本科牧草有不同的發(fā)酵特性[3-4]，且熱帶地區(qū)未凋萎豆科牧草常因發(fā)酵中丁酸梭菌分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生丁酸而使青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)變差，飼喂家畜時甚至?xí)绊憚游锷a(chǎn)性能與奶產(chǎn)品的質(zhì)量[28]，因而成為熱帶地區(qū)豆科植物調(diào)制青貯飼料的主要限制因素之一。本研究將篩選出的耐高溫乳酸菌菌株S1 (糞腸球菌)和S4 (戊糖片球菌)分別接種至柱花草進(jìn)行青貯，在接種量相同的情況下，青貯飼料的pH 降低至4.67 和4.68，符合豆科牧草制作青貯飼料可接受的pH(4.3～5.0) 標(biāo)準(zhǔn)[29]；耐高溫菌株接種組青貯飼料的pH、氨態(tài)氮和丁酸含量均顯著低于對照組和植物乳桿菌接種組，乳酸含量雖比對照稍有降低，但均顯著高于植物乳桿菌接種組，充分說明溫帶地區(qū)等常用的植物乳桿菌在熱帶溫度條件下的接種效果降低[12,16]，在發(fā)酵前期的競爭能力弱于球菌，篩選出的耐高溫乳酸菌S1 和S4 可以快速建立酸性環(huán)境，有效抑制柱花草青貯飼料中丁酸梭菌等的活性，改善柱花草青貯發(fā)酵品質(zhì)。

微生物組成動態(tài)分析也表明，對照組和植物乳桿菌接種組在發(fā)酵前14 d 內(nèi)、S1 和S4 接種組在發(fā)酵前3 d 內(nèi)均有少量霉菌和酵母菌，但之后直至30 d發(fā)酵結(jié)束均不再有霉菌和酵母菌被檢出，進(jìn)一步說明篩選出的耐高溫乳酸菌菌株的確快速降低了青貯飼料的pH，抑制了發(fā)酵前期有害微生物的活動與蛋白水解酶的活性，使青貯過程中蛋白質(zhì)的分解程度降低[30]，特別是S1 接種組的粗蛋白含量與CK 無顯著差異；S4 接種組中氨態(tài)氮的含量與pH 都相對較低，但粗蛋白含量降低的原因可能是戊糖片球菌能產(chǎn)生蛋白酶[31]，導(dǎo)致了部分粗蛋白的分解，尚需要進(jìn)一步試驗驗證。接種耐高溫乳酸菌菌株后，柱花草青貯飼料的干物質(zhì)損失，乙酸、丙酸含量也顯著降低，這一結(jié)果與Pitiwittayakul 等[32]在泰國將耐高溫戊糖片球菌接種于柱花草后的青貯試驗結(jié)果基本一致，與Bai 等[33]在安徽蚌埠將糞腸球菌接種于苜蓿后的青貯試驗結(jié)果卻趨于相反。據(jù)此本研究推測，同種乳酸菌在青貯發(fā)酵中的作用效果不但取決于乳酸菌菌株與原料之間的親和性，還與發(fā)酵環(huán)境條件、特別是發(fā)酵溫度有極大的關(guān)系。但到底是原料與乳酸菌菌株的親和性起決定性作用，還是乳酸菌活性對發(fā)酵溫度的耐受能力更關(guān)鍵還需要進(jìn)一步試驗驗證。青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)與乳酸菌的具體接種量也有非常顯著的相關(guān)性[34]，本研究僅考察了單一接種量下的青貯發(fā)酵品質(zhì)，因此，今后還需要試驗驗證篩選出的耐高溫優(yōu)質(zhì)乳酸菌不同接種量對發(fā)酵品質(zhì)的影響差異，以期篩選出最佳接種量來指導(dǎo)實際生產(chǎn)應(yīng)用。

綜上所述，從柱花草青貯飼料中共篩選得到7 株可以耐受45 ℃、甚至50 ℃高溫的乳酸菌菌株，它們可利用11 種碳源為底物發(fā)酵，均具有較好的耐鹽性和耐酸性，具有在高溫條件下良好的產(chǎn)酸能力；經(jīng)16S rRNA 基因技術(shù)檢測表明，這7 株菌株中，S1、S2、S5 和S6 菌株是糞腸球菌，S3 是人參土芽孢桿菌，S4 和S7 菌株是戊糖片球菌。選擇45 ℃下的產(chǎn)酸能力與生長能力較強(qiáng)的S1 菌株和S4 菌株進(jìn)行接種柱花草青貯試驗，結(jié)果表明， S1 和S4 菌株均能有效提升柱花草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)，特別是S1 菌株接種能保留更多的營養(yǎng)成分。今后需要查明篩選出的耐高溫菌株的最佳接種量及在實際生產(chǎn)調(diào)制環(huán)境條件下的具體表現(xiàn)，以構(gòu)建優(yōu)質(zhì)高效的柱花草青貯飼料調(diào)制方案，在柱花草青貯飼料調(diào)制中推廣利用。