蘋果GRF基因家族在非生物脅迫下的表達(dá)分析

高明剛 李明 段高飛 王滕飛 馮曉健 許瑞瑞

摘 要 GRF（Growth Regulating Factor）基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，它在調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育、滲透脅迫等方面發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程促進(jìn)植物組織器官的生長(zhǎng)，提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性，因此，研究GRF基因家族在逆境條件下的表達(dá)調(diào)控具有重要意義。利用生物信息學(xué)分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究蘋果中12個(gè) GRF 基因在干旱、鹽害和溫度脅迫條件下的表達(dá)情況。結(jié)果表明：蘋果MdGRFs基因參與響應(yīng)非生物脅迫，干旱、鹽害、高溫和低溫條件下MdGRFs表達(dá)量多數(shù)有明顯變化。分別用干旱、鹽害處理蘋果幼苗后有相同的4 個(gè)MdGRFs基因呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；分別用干旱、低溫處理后也有4 個(gè)基因有相似的誘導(dǎo)表達(dá)；MdGRF05和MdGRF07受到干旱、鹽害和低溫的誘導(dǎo)表達(dá)；鹽脅迫處理后，12 個(gè)MdGRFs基因中有8個(gè)明顯上調(diào)，4個(gè)明顯下調(diào)；高溫條件下，MdGRF04、MdGRF05、MdGRF07、MdGRF09和MdGRF11基因表達(dá)上調(diào)略明顯，MdGRF02、MdGRF03和MdGRF10表達(dá)均下調(diào)，其中高溫12 h 后，幾乎檢測(cè)不到MdGRF10的表達(dá)。

關(guān)鍵詞 蘋果；GRF基因家族；非生物脅迫；表達(dá)分析

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（Growth Regulated Factor，GRF）是一種植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育，也可在不利環(huán)境條件下的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用［1-3］。研究表明，GRF的N端區(qū)域包含兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域：谷氨酰胺Gln、亮氨酸Leu、谷氨酰胺Gln組成的QLQ保守域和色氨酸Trp、精氨酸Arg、半胱氨酸Cys組成的WRC保守域，WRC結(jié)構(gòu)域具有核定位信號(hào)和鋅指結(jié)構(gòu)；除此之外，有些GRF轉(zhuǎn)錄因子的C端區(qū)域還含有TQL、GGPL和FFD共3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域［4-6］。

2000年，水稻 OsGRF1作為第一個(gè)成員被鑒定出在赤霉素（Gibberellic acid，GA）誘導(dǎo)的莖伸長(zhǎng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［2］，隨后，研究者發(fā)現(xiàn)大量GRF基因參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控［7-8］。 AtGRF1和 AtGRF2的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致葉片和子葉增大［1］； AtGRF1、 AtGRF2和 AtGRF3在葉片發(fā)育過(guò)程中起到細(xì)胞增殖的正調(diào)控作用［9］； AtGRF4是葉細(xì)胞增殖、子葉胚胎發(fā)育和莖尖分生組織（SAM）發(fā)育所必需的［10］； AtGRF1調(diào)節(jié)種子的重量和大小［11］； AtGRF7作為滲透脅迫響應(yīng)基因的抑制因子，防止在脅迫條件下的生長(zhǎng)抑制［6］。

甘藍(lán)型油菜 BnGRF2可以通過(guò)提高光合效率促進(jìn)種子質(zhì)量和產(chǎn)油［12］；玉米 GRF10則是通過(guò)降低細(xì)胞增殖來(lái)控制葉片大小和株高［13］；水稻 GRF4是調(diào)控粒質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［14-15］； OsGRF6通過(guò)IAA途徑調(diào)控花序構(gòu)型，通過(guò)GA途徑調(diào)控植株高度［16-17］；此外，在各種非生物脅迫誘導(dǎo)下，miR396負(fù)調(diào)控 AtGRF、 OsGRF和 ZmGRF的表達(dá)［18-22］。然而，目前關(guān)于蘋果MdGRFs在非生物脅迫條件下的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚。

蘋果是全球廣泛種植的水果作物之一，富含人體所需的多種元素和營(yíng)養(yǎng)成分［23］。中國(guó)是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，種植面積和產(chǎn)量均占世界總量的40%以上，在世界蘋果產(chǎn)業(yè)中占有重要地位［24］。近年來(lái)，非生物脅迫嚴(yán)重影響著蘋果的生理生化反應(yīng)和代謝過(guò)程，對(duì)蘋果果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)造成顯著負(fù)面影響［25-26］。因此，探索蘋果非生物脅迫的基因資源，對(duì)培育耐高溫新品種和蘋果生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。蘋果全基因組共鑒定到12個(gè)GRF基因成員［27］，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別對(duì)12個(gè)MdGRFs基因進(jìn)行表達(dá)檢測(cè)，分析它們?cè)诟珊?、鹽害和溫度脅迫條件下的表達(dá)調(diào)控特點(diǎn)，擬為今后進(jìn)一步探究MdGRFs基因的逆境生物學(xué)功能奠定一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用植物材料由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院提供，‘嘎拉蘋果組培苗每隔30 d繼代培養(yǎng)1次，25 ℃，光照16 h/暗8 h無(wú)菌培養(yǎng)。繼代20 d后，將生長(zhǎng)良好的‘嘎拉組培苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.1 mg/L IAA）中，組培生根生長(zhǎng)45 d后移栽于營(yíng)養(yǎng)土里，置于25 ℃溫室中，光照16 h/暗8 h。生長(zhǎng)2個(gè)月后，選擇發(fā)育均勻的幼苗進(jìn)行脅迫處理后取樣。對(duì)照組置于25 ℃正常培養(yǎng)，用1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌；干旱脅迫和鹽害分別用含有200 mmol/L甘露醇和300?? mmol/L氯化鈉的1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液澆灌3 h、? 12 h；溫度脅迫處理選擇高溫39 ℃和低溫4 ℃進(jìn)行，分別處理3 h、12 h。樣品迅速用液氮冷凍，存放于-80 ℃冰箱，備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索MdGRFs的基因序列，使用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。

1.3 主要試劑

Trizol試劑（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）用于RNA提取；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于Takara公司；甘露醇和NaCl等試劑均為國(guó)藥集團(tuán)藥品。

1.4 蘋果MdGRFs基因啟動(dòng)子序列提取

從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org）下載擬南芥GRF家族的基因序列。蘋果基因組序列從GDR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rosaceae.org）下載。利用hmmer程序［28］搜索蘋果所有潛在的GDR轉(zhuǎn)錄因子家族成員。從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.sanger.ac.uk）下載WRC（PF08879.8）和QLQ（PF08880.9）結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫文件對(duì)蘋果GDR家族進(jìn)行鑒定。提取蘋果所有GDR家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1 500 bp的DNA序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行后續(xù)分析。利用PlantCARE在線程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）對(duì)蘋果MdGRFs基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行響應(yīng)元件預(yù)測(cè)與分析。

1.5 蘋果MdGRFs基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)分析

采用Trizol法提取總RNA，用DNaseI除去基因組DNA后，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，用于qRT-PCR表達(dá)分析。熒光定量PCR使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR反應(yīng)均設(shè)3次重復(fù)。采用Md18S為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：SYBR Green Ⅰ Master 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，加去離子水至20 μL。反應(yīng)條件為94? ℃ 10 min；94? ℃ 10 s，60? ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析，用Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果MdGRFs轉(zhuǎn)錄因子基因上游的啟動(dòng)子序列分析

利用PlantCARE在線程序?qū)?2個(gè)MdGRFs轉(zhuǎn)錄因子基因上游1 500 bp啟動(dòng)子區(qū)域包含的非生物脅迫響應(yīng)元件進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，如表2所示，除MdGRF03外，11個(gè)MdGRFs的啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)響應(yīng)元件，如MBS（MBS binding site involved in drought inducibility）、TC-rich repeat（Defense and stress responsive elements）、HSE（Heat stress responsive elements）、LTR（Low temperature stress）和C-repeat/DRE（Cold- and dehydration-responsiveness）等，非生物脅迫響應(yīng)元件共46個(gè)，其中，MdGRF01、MdGRF02、MdGRF08、MdGRF09和MdGRF11分別含有8、7、7、6和6個(gè)元件，這些元件說(shuō)明以上5個(gè)基因可能響應(yīng)干旱、高溫和低溫等不同脅迫（表2）。

2.2 蘋果MdGRFs在干旱脅迫條件下的表達(dá)? 分析

12個(gè)MdGRFs基因的表達(dá)量均有不同程度變化，但是干旱脅迫條件下基因下調(diào)的情況并沒有檢測(cè)到。結(jié)果表明，MdGRF05、MdGRF06、MdGRF07、MdGRF08、MdGRF11和MdGRF12 6 個(gè)基因的表達(dá)明顯上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)為2.39～4.64（圖1），其中，5個(gè)基因的啟動(dòng)子預(yù)測(cè)分析均包含相關(guān)響應(yīng)元件，只有MdGRF06的啟動(dòng)子中無(wú)干旱相關(guān)響應(yīng)元件（表2），MdGRF05經(jīng)過(guò)12 h甘露醇處理后表達(dá)量升高至對(duì)照的4.64倍，表明該基因明顯受到干旱誘導(dǎo)（圖1）。

2.3 蘋果MdGRFs在鹽脅迫條件下的表達(dá)分析

由圖2可知，蘋果MdGRF02、MdGRF03、MdGRF05、MdGRF07、MdGRF11和MdGRF12共6個(gè)基因的表達(dá)明顯上調(diào)，基因表達(dá)量均達(dá)到對(duì)照的2.0倍以上，最高的達(dá)到4.15倍，同時(shí)MdGRF01、MdGRF08和MdGRF09的表達(dá)量變化也很明顯，鹽脅迫處理后，表達(dá)量降低至不足對(duì)照的1/2。

2.4 蘋果MdGRFs在高溫條件下的表達(dá)分析

近年來(lái)，全球溫室效應(yīng)導(dǎo)致極端天氣增加，氣候反常，尤其是高溫天氣嚴(yán)重影響著蘋果的生理生化反應(yīng)和代謝過(guò)程，對(duì)蘋果果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)造成顯著負(fù)面影響［23］。由圖3可知，MdGRF04和MdGRF11的表達(dá)量明顯增加，高溫處理3 h后MdGRF11的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的3.33倍；檢測(cè)到基因表達(dá)量下調(diào)的有4個(gè)基因，包括MdGRF01、MdGRF02、MdGRF03和MdGRF10，高溫處理12 h后，MdGRF10的表達(dá)量降至對(duì)照的1/20，表明以上6個(gè)基因的表達(dá)量均不同程度響應(yīng)高溫脅迫。MdGRF01、MdGRF02、MdGRF10和MdGRF11均含有1～3個(gè)HSE元件（表2）。

2.5 蘋果MdGRFs在低溫條件下的表達(dá)分析

MdGRF01、MdGRF02和MdGRF04的表達(dá)有明顯下降趨勢(shì)，該趨勢(shì)在低溫處理12 h時(shí)顯現(xiàn)；MdGRF05～MdGRF10 6 個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)只有MdGRF08包含1個(gè)LTR元件，但是6 個(gè)基因經(jīng)過(guò)低溫處理后表達(dá)均有明顯上調(diào)，最高達(dá)5.47倍（表2和圖4），說(shuō)明低溫處理時(shí)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)與基因內(nèi)的LTR響應(yīng)元件數(shù)量相關(guān)性不大。

3 討? 論

植物GRFs基因在根和地上部組織中有不同程度的表達(dá)，在細(xì)胞增殖的組織部位的表達(dá)較高［1，9，12］。蘋果MdGRFs基因在根、莖、葉、花和果實(shí)等多種組織中表達(dá)，但在幼苗葉片中的表達(dá)水平高于成熟葉片，也符合GRF在不同組織生長(zhǎng)發(fā)育早期發(fā)揮作用的結(jié)果［27］；NtGRFs和BnGRFs在不同的器官或組織中存在差異表達(dá)［3，29-30］，很多GRF基因也具有組織特異性的表達(dá)模式，表明它們可能在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面具有不同的功能。

研究表明，響應(yīng)非生物脅迫和激素處理的GRF基因通常包含脅迫相關(guān)的順式響應(yīng)元件［3，22，31］。本研究分析得知11個(gè)蘋果MdGRFs基因的啟動(dòng)子區(qū)域分別包含1～8個(gè)非生物脅迫響應(yīng)順式元件（表2），因此，初步預(yù)測(cè)蘋果MdGRFs基因可能參與非生物脅迫信號(hào)通路。結(jié)合qRT-PCR分析得知，干旱和高溫脅迫處理后，基因表達(dá)量的變化與含有的MBS、HSE等響應(yīng)元件的相關(guān)性分別為83.3%和66.7%，而低溫處理后蘋果MdGRFs的表達(dá)量變化與基因啟動(dòng)子區(qū)域含有的LTR元件并沒有緊密聯(lián)系。

通過(guò)深入分析qRT-PCR結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，很多非生物脅迫條件下的調(diào)控模式有相似性，比如：干旱、鹽害脅迫后，MdGRF05、MdGRF07、MdGRF11和MdGRF12均有上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)（圖1和圖2）；同時(shí)，干旱、低溫處理后，MdGRF05、MdGRF06、MdGRF07和MdGRF08的基因表達(dá)量增加，以上兩種情況相似基因數(shù)占總上調(diào)基因數(shù)的2/3（圖1和圖4）；MdGRF05和MdGRF07兩個(gè)基因受到干旱、鹽害和低溫的誘導(dǎo)表達(dá)（圖1、圖2和圖4），可作為今后重點(diǎn)研究的非生物脅迫響應(yīng)途徑的關(guān)鍵基因；另外，分析還發(fā)現(xiàn)MdGRF01多呈現(xiàn)下調(diào)模式，鹽害、溫度脅迫都會(huì)降低該基因的表達(dá)，MdGRF04受到高溫誘導(dǎo)，低溫處理后表達(dá)量下降；MdGRF10則正好相反（圖2、圖3和圖4），以上結(jié)果說(shuō)明：MdGRFs基因家族響應(yīng)非生物脅迫是大多數(shù)基因具有相似性和少數(shù)基因多樣化共存。

綜合上述研究結(jié)果，MdGRFs參與蘋果響應(yīng)干旱、鹽脅迫、高溫及低溫信號(hào)途徑，在調(diào)控蘋果逆境響應(yīng)機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用，但詳細(xì)的逆境生物學(xué)功能以及分子調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步探索。本文為今后研究蘋果MdGRFs在干旱、鹽脅迫及溫度等非生物脅迫過(guò)程中的具體功能和抗性機(jī)理提供了一定的理論基礎(chǔ)，也為培育抗逆蘋果新品種提供了關(guān)鍵的候選基因資源。

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Expression Analysis of? GRF Gene Family under Abiotic Stress in Apple

Abstract Growth Regulating Factor （GRF） gene family is a kind of plant-specific transcription factors，which play an important role in regulating the growth and development of plants and osmotic stress，mainly the role in promoting the growth of plant tissues and organs by regulating the cell proliferation process，and improving the adaptability to environmental stress in plants.Therefore，it is of great significance to study the expression regulation of GRF gene family under abiotic stress in plant.In this study，bioinformatics analysis and quantitative real-time PCR were used to detect the expression of 12 MdGRFs genes under drought，salt and temperature stress in apple.The results showed that MdGRFs were involved in response to abiotic stress，and the expression level of MdGRFs changed significantly under drought，salt injury，high temperature and low temperature.MdGRF05，MdGRF06，MdGRF07，MdGRF08 and MdGRF11 showed similar regulation pattern，and the regulation of MdGRF09 and MdGRF12 was different under drought and cold stress.After salt stress，eight MdGRFs were significantly up-regulated and four MdGRFs were significantly down-regulated.Under high temperature stress，the expression of MdGRF04，MdGRF05，MdGRF07，MdGRF09 and MdGRF11 genes were slightly up-regulated，and the expression of MdGRF02，MdGRF03 and MdGRF10 were down-regulated.The expression of MdGRF10 could hardly be detected after 12? h of high temperature.

Key words Apple; GRF? gene family; Abiotic stress; Expression analysis