甘肅省胡蘿卜根結線蟲病病原鑒定

安麗婷 石明明 倪春輝 劉永剛 魏雪娟 喬萬強 李惠霞

摘 要 為了明確根結線蟲種類，采用形態(tài)學和分子生物學方法，對甘肅省臨洮縣胡蘿卜上的根結線蟲進行鑒定，并測定其致病性。結果表明，該群體雌蟲蟲體梨形或檸檬形，乳白色，口針粗壯，中食道球近圓形。雌蟲會陰花紋呈卵圓形，背弓較平緩，肛門處有刻點。雄蟲蟲體細長，尾部鈍圓，交合刺針狀，成對。2齡幼蟲蟲體細長，呈蠕蟲形，唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達，口針基部球小而圓，尾部透明區(qū)明顯，尾尖鈍圓。利用特異性引物Mh-R/Mh-F擴增得到大小為462 bp的特異性片段，與北方根結線蟲（Meloidogyne hapla）一致?；诟Y線蟲屬rDNA ITS和28S-rDNA D2D3區(qū)序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該群體均與北方根結線蟲序列聚為一支。將該線蟲接種胡蘿卜，其癥狀與田間發(fā)病癥狀一致，35 d后分離線蟲，其形態(tài)特征與北方根結線蟲相符。綜上，形態(tài)學特征結合分子生物學方法，將該病原鑒定為北方根結線蟲（M.hapla），這是甘肅省首次報道北方根結線蟲危害胡蘿卜類蔬菜作物。

關鍵詞 胡蘿卜；北方根結線蟲；形態(tài)學特征；分子生物學；致病性；鑒定

胡蘿卜（Daucus? carota var. sativa Hoffm.）屬傘形科胡蘿卜屬2 a生草本植物，在世界各地廣泛種植，為全球性十大蔬菜之一[1]，含有豐富的類胡蘿卜素等多種植物活性物質，具有抗癌、抗菌和血清生成的作用[2]。中國胡蘿卜種植面積約占世界總面積的40%，種植面積和總產量均居世界第一[3]。甘肅省是中國重要的胡蘿卜產區(qū)，全省胡蘿卜種植面積達到2.355萬hm2，產量達69.5萬t，近年來，定西市臨洮縣胡蘿卜種植面積約? 0.3萬 hm2，是甘肅省胡蘿卜種植大縣之一，胡蘿卜產業(yè)已成為農民致富的新增長點[3]。

根結線蟲（Meloidogyne spp.）寄主范圍廣泛，致病性強，是對中國農業(yè)生產影響最大的一類植物病原線蟲[4]。對經濟造成嚴重損失的常見種類主要是南方根結線蟲（M. incongnita）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、花生根結線蟲（M. arenaria）和北方根結線蟲（M. hapla）等4種[5-6]。據(jù)統(tǒng)計，中國蔬菜種植面積約1 100萬hm2，因根結線蟲為害造成減產約為30%，嚴重時甚至絕收，每年造成的經濟損失達5億美元[7]。在北方，主要以南方根結線蟲危害保護地蔬菜，甘肅省尚未見北方根結線蟲危害蔬菜的報道。2020年，在甘肅省臨洮縣窯店鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)露地胡蘿卜發(fā)生根結線蟲病，本研究擬通過病樣采集，利用形態(tài)學特征和分子生物學技術對其進行鑒定，以確定根結線蟲種類，為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2020年10月，在甘肅省定西市臨洮縣窯店鎮(zhèn)（N 35°2′99″，E 103°8′59″）胡蘿卜病田，采集具有典型癥狀的病株，帶回實驗室分離。

1.2 胡蘿卜根結線蟲病病原種類鑒定

1.2.1 根結線蟲雌蟲會陰花紋的制作與形態(tài)觀察 將胡蘿卜病株根系洗凈，置于體視顯微鏡下，用眼科手術刀將根結表皮切開，用毛刷或鑷子將乳白色的球狀物（即為根結線蟲雌蟲）挑出，收集20頭，備用。載玻片上滴一滴0.9% NaCl溶液，挑取一頭，觀察形態(tài)特征并拍照，參照謝輝[8]的方法測量雌蟲的形態(tài)特征值。

會陰花紋的制作與觀察[7]：將雌蟲置于滴有45% 乳酸的載玻片上，用手術刀切去雌蟲的頸，然后輕輕擠壓蟲體排出內含物，用手術刀將含有會陰花紋的蟲體后部切下，修整成平整的正方形，放置于載玻片上的甘油滴中，用毛針撥平鋪正，蓋上蓋玻片，制成臨時玻片，用顯微鏡觀察雌蟲會陰花紋并拍照。

1.2.2 根結線蟲2齡幼蟲的收集與形態(tài)觀察 在體視顯微鏡下用滅菌的眼科手術刀切開較大的根結，收集單個卵囊。將其置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵化。2～3 d后，在體視顯微鏡下觀察孵出2齡幼蟲[9]，挑取20條，? 備用。

載玻片上滴加蒸餾水，挑取2齡幼蟲，酒精燈上加熱，隔2～3秒在顯微鏡下觀察蟲體，若彎曲的線蟲蟲體突然伸直，則表明線蟲已死亡，停止加熱。熱殺死的線蟲立即加一滴TAF固定液（制作比例：三乙醇胺2 mL、福爾馬林7 mL、蒸餾水91 mL）固定，制作臨時玻片。以水作為浮載劑，將固定好的線蟲挑入，蓋上蓋玻片[7]，在顯微鏡下觀察線蟲形態(tài)并拍照，參照謝輝[8]的方法，進行形態(tài)學觀察和體值測量。

1.2.3 分子生物學鑒定 根結線蟲DNA的提取：參照王江玲等[10]和王曦茁等[11]的方法稍作改進。將孵出的2齡幼蟲清洗消毒后，挑取單條至盛有10 mL ddH2O的離心管中，反復沖洗2～3次，隨后轉移到含有10 μL線蟲裂解液的PCR管中。用滅菌解剖刀將線蟲切成數(shù)節(jié)，離心? 2 min后，加1 mg/mL的蛋白酶K 1 μL。將裂解后的線蟲置于PCR儀65 ℃恒育1 h，以降解蛋白質，然后95 ℃恒溫10 min，得到線蟲DNA粗提取液。

PCR擴增：采用線蟲ITS-rDNA通用引物TW81/AB28[12]、28S-rDNA通用引物D2A/D3B[13]及北方根結線蟲特異性引物Mh-F（5′-CGAATAGTCTCAACGTTTATC-3′）/Mh-R（5′-ATGTGACAGCGAAAAGAATT-3′）[14]進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，包括DNA模板3 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1? μL，ddH2O 7.5 μL。PCR擴增程序：95 ℃變性3 min，95 ℃變性30 s，退火溫度（55 ℃、55 ℃、52 ℃）退火30 s，? 72 ℃延伸1 min，循環(huán)34次，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴增產物5 μL經1.2%的瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min進行檢測， 最后在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀測拍照[15]。

擴增產物測序及數(shù)據(jù)分析：參照DNA凝膠回收試劑盒說明書，回收ITS序列和28S rDNA D2D3區(qū)的擴增產物。將回收產物與pMDTM 18-T載體連接，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，然后均勻涂布于LB-氨芐青霉素固體培養(yǎng)基上，用滅菌牙簽挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆后委托擎科生物技術有限公司（北京）測序。測序結果在NCBI中進行BLAST比對分析，下載置信度較高的序列，采用Clustal W對其和近源種進行比對分析，通過Gbock 0.91b選擇保守區(qū)域后用MeModeltest version 2.3篩選最佳模型，最后用MrBayes構建系統(tǒng)發(fā)育樹[15-17]。分別以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）（登錄號 X03680）和禾谷孢囊線蟲（Heterodera avenae）（登錄號 LT159825）為ITS和28S序列系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。

1.2.4 致病性測定 將健康胡蘿卜種植于16×20 cm的塑料盆中，每盆一株，共10株，放置于? 25～28 ℃的溫室中，光暗交替培養(yǎng)（14L/10D）。2周后，8株胡蘿卜上接種北方根結線蟲臨洮群體的卵和2齡幼蟲混合液2 500條，2株未接種，作為對照。25～28 ℃溫室中培養(yǎng)，連續(xù)觀察植株發(fā)病情況。待植株發(fā)病后，從根上分離線蟲，觀察其形態(tài)是否與接種的線蟲群體一致。

2 結果與分析

2.1 胡蘿卜根結線蟲病危害癥狀

胡蘿卜感染根結線蟲后，初期地上部癥狀不明顯，后期發(fā)病重時地上部表現(xiàn)為植株矮小、葉片黃化萎蔫，發(fā)病植株常呈塊狀分布，造成缺苗斷梗。挖出肉質根，可觀察到根部有大量須根和毛細根，主根偶有分叉。其上有球形或圓錐狀、大小不等的瘤狀物，即為根結（圖1-A）。根結初期為白色，表面光滑（圖1-B），后期逐漸變?yōu)楹稚㈤_始腐爛。剖開根結，可觀察到半透明或乳白色、針頭大小的雌成蟲。

2.2 根結線蟲胡蘿卜群體形態(tài)學特征

根結線蟲雌蟲形態(tài)測量值見表1。雌蟲蟲體為梨形或檸檬形（圖2-A），乳白色，蟲體前端突出如頸，后端橢圓形，口針強壯，中食道球發(fā)達，近圓形（圖2-B）。雌蟲會陰花紋呈卵圓形，背弓略平，有些群體刻線明顯，有些不明顯（圖2-C），肛門處有刻點。上述會陰花紋均為北方根結線蟲的典型特征。

該線蟲群體雄蟲形態(tài)測量值見表1。雄蟲蟲體蠕蟲形（圖3-A），口針粗壯（圖3-B）。尾部鈍圓，交合刺針狀，成對（圖3-C）。

胡蘿卜上根結線蟲2齡幼蟲形態(tài)測量值見表1。線蟲蟲體細長，頭部鈍圓光滑，尾部尖細，（圖3-D）唇區(qū)無明顯縊縮，口針發(fā)達（圖3-E），口針基部球明顯，呈圓形。尾部透明區(qū)清晰（圖3-F），這些特征均與北方根結線蟲2齡幼蟲特征相符。因此，初步將該線蟲群體鑒定為北方根結線蟲（M. hapla）。

2.3 分子生物學鑒定結果

利用通用引物擴增得到ITS和28S片段，大小分別為577 bp和762 bp，ITS序列（GenBank登錄號OM854803）與北方根結線蟲（GenBank登錄號MT249021、LC030361等）相似度為? 98.37%～99.82%，28S序列（GenBank登錄號OM401656）與北方根結線蟲（GenBank登錄號KJ598136、MN475814等）相似度為99.44%～99.87%?；贕TR+I+G模型構建ITS和28S系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，該根結線蟲ITS序列與北方根結線蟲序列聚為一支，置信度為100%，與其他根結線蟲序列可明顯區(qū)分（圖4）；28S序列與北方根結線蟲聚為一支，置信度達100%，與其他根結線蟲序列可明顯區(qū)分開（圖5）。

利用北方根結線蟲特異性引物Mh-F/Mh-R擴增得到大小為462 bp的片段（圖6），而對照沒有擴增出特異條帶，進一步表明所測樣本為北方根結線蟲（M. hapla）。

2.4 致病性測定

株根部均有明顯的根結形成，與田間觀察到的癥狀一致，2株對照均未發(fā)現(xiàn)根結。從發(fā)病植株分離根結線蟲，觀察發(fā)現(xiàn)其形態(tài)特征與接種線蟲一致，表明侵染胡蘿卜的病原是北方根結線蟲。

3 討論與結論

本研究對胡蘿卜根結線蟲病病株進行病原分離，通過形態(tài)學鑒定、分子生物學鑒定和致病性測定，確定引起甘肅省臨洮縣胡蘿卜根結線蟲病的病原為北方根結線蟲（M.hapla）。北方根結線蟲是冷涼區(qū)作物上最主要的植物病原線蟲[16]。其寄主范圍廣泛，致病性強，可侵染蔬菜、煙草、花生、豆類等[17]多種作物，2020年，Li等[18]在甘肅省渭源縣黨參上首次發(fā)現(xiàn)北方根結線蟲。目前，國內報道的引起胡蘿卜根結線蟲病的病原有南方根結線蟲[19]、花生根結線蟲和北方根結線蟲[20-21]。2010年，蘇定昌等[21]報道花生根結線蟲和北方根結線蟲引起胡蘿卜根結線蟲病，但未對其進行系統(tǒng)鑒定。因北方根結線蟲對不同作物品種具有較強的寄主?；?，故準確鑒定病原種類，明確田間為害的優(yōu)勢種對防治根結線蟲病具有重要意義。

通常，根結線蟲采用形態(tài)學特征結合分子生物學方法進行鑒定[22-23]。雌蟲會陰花紋是根結線蟲重要的鑒別特征[24]，本試驗中，供試根結線蟲的會陰花紋肛門處有刻點，背弓緩，這與謝輝[8]描述的北方根結線蟲雌蟲會陰花紋特征相似，且2齡幼蟲和雄蟲的測量值均與Whitehead[25]所描述的北方根結線蟲測量值基本相符。根結線蟲近源種之間形態(tài)差異不明顯，而雌蟲的會陰花紋存在一定的種內變異[26]，因而無法單獨根據(jù)形態(tài)學特征準確鑒定，還需結合分子生物學方法進行鑒定。本試驗擴增了根結線蟲胡蘿卜群體的? rDNA-ITS和28S-rDNAD2D3區(qū)序列并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，其序列均與北方根結線蟲群體聚為一支且相似度較高。同時，北方根結線蟲特異性引物Mh-R/Mh-F擴增結果與馮光泉等[14]一致，進一步證實胡蘿卜根結線蟲病病原為北方根結線蟲。

甘肅省是北方根結線蟲新分布區(qū)，這是首次在甘肅省發(fā)現(xiàn)北方根結線蟲危害胡蘿卜。臨洮縣氣候陰濕，降雨較充足[27]，適合北方根結線蟲生存。胡蘿卜作為高原夏菜的重要品種，常年連作[28]，易造成根結線蟲病逐步擴大、危害加重的趨勢，這將成為胡蘿卜生產中潛在的危險性因素。若不采取控制措施，造成北方根結線蟲大量繁殖和擴散，則會對甘肅省露地蔬菜產業(yè)發(fā)展造成? 威脅。

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Identification of Carrot Root-knot Nematode Pathogen in Gansu Province

Abstract Morphological and molecular biological methods were used to identified the nematode population affecting carrots in Lintao county，Gansu province.The results showed that the female nematodes exhibiting pear-shaped or lemony bodied，were milky white with a robust stylet，and had round? median bulbs.The perineal patterns of females were oval with a low dorsal arch and punctations，and typically located above the anus.The male nematodes displayed elongated bodies with obtuse tails and a pair of acicular spicula.The second-stage juveniles（J2） had elongated and helminth-shaped bodies with no obvious constriction in the labial area.Their stylets were robust with small and round basal balls，and their tails were obtuse with obvious transparent areas.A specific 462 bp fragment? was amplified from the population using Mh-R/Mh-F specific primers，consistent with that of Meloidogyne hapla.Phylogenetic trees constructed based on the rDNA ITS and 28S-rDNA D2D3 sequences of the genus meloidogyne，indicated that this population clustered with the sequences of M.hapla.This nematode population inoculated on carrots led to the symptoms consistent with those of the diseased ones in the field.After 35 days，the nematode was isolated，and its morphological characteristics matched those of M.hapla.In conclusion，both morphological characteristics and molecular biological methods identify the the pathogen as M.hapla.This is the first report of M.hapla infecting carrot vegetable crop in Gansu province.

Key words Carrot;Meloidogyne hapla; Morphological characteristics; Molecular biological; Pathogenicity; Identification