尖孢鐮刀菌侵染枸杞根系的轉(zhuǎn)錄組分析

張生懂 李捷 馮麗丹 孫濤 張煦 李永暉

摘 要 由尖孢鐮刀菌引起的根腐病是枸杞種植中的主要病害之一，為探究尖孢鐮刀菌侵染枸杞的分子致病機制，并挖掘其關鍵致病基因，通過尖孢鐮刀菌侵染‘寧杞1號枸杞根系，于侵染第7天刮取菌樣進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果表明，與純培養(yǎng)菌株相比，在侵染第7天的尖孢鐮刀菌中共發(fā)現(xiàn)了1 892個顯著差異表達基因，其中上調(diào)表達基因1 242個，下調(diào)表達基因650個；GO富集分析表明，分子功能分類的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白和ATP酶活性以及生物學過程分類的跨膜轉(zhuǎn)運可能在尖孢鐮刀菌致病過程中發(fā)揮了重要作用；KEGG富集分析表明，鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運蛋白是尖孢鐮刀菌侵染過程的主要代謝途徑。此外，通過對比分析編碼碳水化合物酶與植物-病原互作相關基因在尖孢鐮刀菌侵染前后的表達量，篩選到10個關鍵致病候選基因。

關鍵詞 轉(zhuǎn)錄組；尖孢鐮刀菌；枸杞；差異表達基因；富集分析

枸杞（Lycium barbarum L.）是西北地區(qū)一類重要的藥食同源型經(jīng)濟作物，其在促進西北地區(qū)的經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著舉足輕重的作用。但近年來由尖孢鐮刀菌為主要病原菌引起的土傳真菌性病害——根腐病的廣泛傳播，造成盛果期枸杞植株的大量死亡［1］。相關研究表明，枸杞根腐病的發(fā)病率會隨枸杞種植年限的延長而逐年加重，嚴重時發(fā)病率可達50%，給枸杞的種植和生產(chǎn)帶來嚴重的經(jīng)濟損失［2］。加上根腐病的土壤傳播性質(zhì)，以目前的技術手段，很難通過施用殺菌劑對其產(chǎn)生有效防治［3］。

高通量測序技術精確度高，成本較低，已廣泛應用于病原和寄主分子互作機制的研究以及功能基因的挖掘［4］。Thatcher等［5］對侵染苜蓿（Medicago sativa L.）的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，初步篩選到10個與致病相關的基因；舒新月等［6］對不同侵染時間點的稻粒黑粉病菌（Tilletia horrida）進行轉(zhuǎn)錄組分析，初步解析了稻粒黑粉病菌的致病分子機制；Ding等［7］和丁兆建等［8］通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)，MAPK信號通路激酶基因FoBck1、 FoMKK2和FoSlt2可以調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；停‵usarium oxysporum f.sp.cubense）的生理特性和致病性，并在此基礎上，對尖孢鐮刀菌古巴?；鸵吧途旰虵oSlt2敲除突變體菌株進行比較轉(zhuǎn)錄組分析，證實基因FoSlt2在調(diào)控尖孢鐮刀菌古巴?；偷纳L發(fā)育、細胞壁完整性和致病性方面發(fā)揮著重要作用；梁麗琴等［9］也通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，敲除Argonaute1基因后的尖孢鐮刀菌致病相關基因顯著下調(diào)表達。

目前，對于尖孢鐮刀菌在其他植株，如綠豆（Vigna radiata L.）［10］、香蕉（Musa nana Lour.）［11］和苜蓿［5］等方面的研究較多，但在枸杞中的致病性研究較少。因此，為了初步解析尖孢鐮刀菌侵染枸杞的分子致病機制，本研究對侵染‘寧杞1號根系7 d的尖孢鐮刀菌進行取樣，以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d菌株作為對照進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，并篩選出尖孢鐮刀菌在侵染過程中的關鍵致病基因，為后續(xù)功能基因的驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尖孢鐮刀菌菌株由甘肅農(nóng)業(yè)大學林木生理生化實驗室分離并保存；枸杞根部組織采集自甘肅農(nóng)業(yè)大學經(jīng)濟林實訓基地大田栽種的‘寧杞1號植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備 將尖孢鐮刀菌菌株于PDA固體培養(yǎng)基上活化后，用消毒后的打孔器挑取菌餅于新的PDA固體培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫箱培養(yǎng)7 d后，刮取培養(yǎng)基表面的菌絲制成孢子懸浮液。將采集到的根組織用蒸餾水沖洗干凈，以消毒后的針刺對枸杞根組織間隔1 cm進行扎孔處理，為尖孢鐮刀菌提供侵染途徑。將處理后的根組織置于配置好的孢子懸浮液中靜置2 min后取出，于培養(yǎng)皿中26 ℃恒溫培養(yǎng)，為保持根組織活性，每隔2 d于無菌操作臺中向培養(yǎng)皿加入適量無菌水。由前期預試驗可知，在尖孢鐮刀菌侵染枸杞第7天可取夠轉(zhuǎn)錄組測序所需樣本量，同時PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)的菌絲也可長滿培養(yǎng)皿。因此，于尖孢鐮刀菌侵染第7天刮取枸杞根組織表面的菌絲作為處理組（T），同時以PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌絲作為對照組（CK），各組3個生物學重復，用于后續(xù)RNA提取。

1.2.2 樣品RNA提取 采用Tri-zol法提取6個 RNA 樣品，利用Nanodrop 2 000對所提RNA的濃度和純度進行檢測，以1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，并保存于超低溫冰箱備用。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序分析 利用高通量測序平臺（Illumina Hiseq 2 500）進行轉(zhuǎn)錄組測序，以PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d菌株測序作為參考基因組，使用SOAP2軟件將測序得到的過濾后讀段（Clean reads）比對到參考基因組。

1.2.4 差異表達分析 使用R程序中的DESeq2（version1.18.0）程序包進行差異表達分析，P-value的計算模型為負二項分布，初步以P-value< 0.0001 & |log2（Fold Change）| > 2作為篩選標準進行差異表達基因的篩選，并根據(jù)基因的表達量繪制表達模式聚類熱圖。

1.2.5 GO和KEGG富集分析 GO和KEGG富集的P-value經(jīng)過Bonferroni校正后，以? FDR<0.05為顯著富集。使用R程序中的GOseq程序包對差異表達基因進行GO富集分析；KEGG富集分析使用KOBAS 3.0軟件，并分別選取在GO和KEGGG中富集最為顯著的20個條目（term）和通路（pathway）繪制富集分析圖。

1.2.6 關鍵致病基因的篩選 根據(jù)“1.2.4”篩選到的差異表達基因繪制可以直觀顯示全部基因在兩組樣本間差異倍數(shù)（Fold Change）值分布情況的火山圖，進一步限定閾值，篩選極顯著差異表達的基因，并剔除少于兩個注釋信息的基因。在此基礎上，對與病原菌致病性密切相關的碳水化合物活性酶以及植物-病原互作相關基因進行篩選并分析。

1.2.7 實時熒光定量PCR分析 利用篩選到的候選致病基因，使用 ABI 7 500 實時系統(tǒng)進行熒光定量 PCR （qRT-PCR） 驗證 RNA-seq 的結(jié)果。以actin作為內(nèi)參基因，試驗對每個樣品進行3個生物學重復，使用軟件Oligo 7.0設計引物（表1），采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖孢鐮刀菌侵染枸杞根系的測序數(shù)據(jù)分析

6個樣本的轉(zhuǎn)錄組測序共獲得131 997 114條Clean reads，去掉接頭、含N的序列和低質(zhì)量的reads后，每個樣本產(chǎn)生約 6.5 Gb Clean bases；在參考基因組上的平均比對率約達70%，Q20為96.8%～98.5%，Q30為91.6%～95.3%，GC含量為53.6%～55.2%（表2）。根據(jù)測序的Clean reads和比對到參考基因組的數(shù)據(jù)，可進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 尖孢鐮刀菌侵染枸杞根系前后的差異性分析

2.2.1 差異表達分析 在P-value<0.000 1 & |log2（Fold Change）| >2的篩選閾值下總共篩選到1 892個差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），包括1 242個上調(diào)表達和650個下調(diào)表達的基因，表明尖孢鐮刀菌在侵染后的差異表達基因主要表現(xiàn)為顯著上調(diào)表達。

通過表達模式聚類熱圖（圖1）可知，CK和T兩組樣本間聚類明顯分離，且兩組樣本間顯示相同顏色的基因相對較少，初步說明尖孢鐮刀菌在侵染枸杞前后的基因表達存在明顯差異。

2.2.2 GO富集分析 對篩選到的1 892個DEGs進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，這些DEGs被富集到生物學過程（biological process）、細胞組成（cellular componment）和分子功能（molecular function）3個GO分類中。由GO富集柱狀圖（圖2）可以看出，在生物學過程分類中，DEGs主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運過程相關條目中，如金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運等過程；在細胞組成分類中，DEGs在細胞膜及質(zhì)膜等相關條目富集最為顯著；在分子功能分類中，DEGs則主要富集在跨膜轉(zhuǎn)運蛋白及ATP酶活性相關條目中。

2.2.3 KEGG富集分析 對DEGs進行Pathway顯著性分析發(fā)現(xiàn)，在尖孢鐮刀菌侵染過程中，鞘脂代謝（sphingolipid metabolism）、過氧化物酶體（Peroxisome）和ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ABC transporters）等是最主要的代謝途徑，其P-value均小于0.000 1，推測以上代謝途徑很可能參與了尖孢鐮刀菌對枸杞的致病過程（圖3）。

2.3 關鍵致病基因的篩選

通過火山圖可以發(fā)現(xiàn)，大部分高表達的基因主要分布于-lg P-value>10 & |log2（Fold Change）|>5的范圍內(nèi)，因此進一步設定篩選閾值為-lg P-value>10 & |log2（Fold Change）|>5對1 892個顯著DEGs進行篩選，最終共篩選到283個極顯著DEGs，包括166個上調(diào)表達和117個下調(diào)表達的DEGs（圖4）。通過NR數(shù)據(jù)庫、GO數(shù)據(jù)庫、KO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、KOG數(shù)據(jù)庫和Swiss-prot數(shù)據(jù)庫對篩選到的極顯著DEGs進行注釋，并剔除少于兩個注釋結(jié)果的DEGs，最終得到180個極顯著表達且有兩個及以上注釋結(jié)果的DEGs。

2.3.1 碳水化合物活性酶相關DEGs 通過分析180個極顯著DEGs的注釋信息，發(fā)現(xiàn)47個DEGs與碳水化合物活性酶相關，包括編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶以及細胞壁降解酶相關的基因。其中，編碼β-木糖酶（beta-xylosidase）的基因 NECHADRAFT_48184、編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine-protein kinase）的基因NECHADRAFT_52370、編碼果膠酸裂解酶（pectate lyase）的基因NECHADRAFT_8181和NECHADRAFT_122787以及編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白（MFS transporter）的基因NECHADRAFT_45233在尖孢鐮刀菌侵染7 d后顯著上調(diào)表達（圖5）。相關研究表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和MFS轉(zhuǎn)運蛋白在病原真菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮致病性作用，而β-木糖酶和果膠酸裂解酶均為細胞壁降解酶類，是致病菌侵染宿主植物細胞壁的關鍵酶［12-13］。因此，推測NECHADRAFT_48184、NECHADRAFT_52370、NECHADRAFT_8181、 NECHADRAFT_122787和NECHADRAFT_45233參與了尖孢鐮刀菌的致病機制。

2.3.2 植物-病原互作相關DEGs 從180個DEGs中共篩選到25個上調(diào)表達的植物-病原互作相關DEGs，包括編碼角質(zhì)酶、自噬相關蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶和轉(zhuǎn)運型ATP酶等相關酶的基因。其中，編碼Na+/K+轉(zhuǎn)運P型ATP酶（Na+/K+ P-type transporting ATPase）的基因 NECHADRAFT_65962和 NECHADRAFT_62632、編碼Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶（Ca2+P-type transporting ATPase）的基因 NECHADRAFT_100814、編碼AAA+型ATP酶（AAA+-type ATPase）的基因NECHADRAFT_1988和編碼角質(zhì)酶（chitinase）的基因 NECHADRAFT_122567在尖孢鐮刀菌侵染前后變化尤為顯著（圖6）。研究表明，轉(zhuǎn)運型ATP酶在致病菌致病過程中可以為細胞輸入許多新陳代謝所需的物質(zhì)并輸出毒物［14］，因此推測基因NECHADRAFT_65962、 NECHADRAFT_62632、 NECHADRAFT_100814和NECHADRAFT_1988可能在致病過程中發(fā)揮了重要作用。另外，角質(zhì)酶作為突破寄主植物角質(zhì)層的工具酶，也參與了真菌的致病性過程，其編碼基因 NECHADRAFT_122567也是尖孢鐮刀菌成功侵染的關鍵基因。

2.4 實時定量PCR 分析

為了驗證 RNA-seq 數(shù)據(jù)的可靠性，對篩選到的10個關鍵致病候選基因進行qRT-PCR驗證，并將其結(jié)果與RNA-seq結(jié)果進行相關性分析（圖7）。結(jié)果表明，10個關鍵致病候選基因轉(zhuǎn)錄得到的FPKM值與qRT-PCR得到的基因相對表達量的變化趨勢基本一致，兩者的相關系數(shù)達?? 0.882 5，說明對轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的分析具有可? 靠性。

3 討? 論

近年來，素有“植物癌癥”之稱的根腐病逐漸成為制約枸杞種植的重要因素之一，其發(fā)病率一般可達15%～65%［15］。而目前主要依賴于化學藥劑對枸杞根腐病的防治，不僅對環(huán)境和人體不利，而且因其土傳性質(zhì)，很難達到有效防治［16］。解析根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌的分子致病機[CM（21]制，是制定對其進行有效防治策略的根本前提。

為初步闡明尖孢鐮刀菌的分子致病機制，本研究對尖孢鐮刀菌侵染第7天的DEGs進行富集分析，并篩選10個與致病性密切相關的候選基因。為了確保測序數(shù)據(jù)的可靠性，通過qRT-PCR對10個候選致病基因的表達量進行驗證，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)和qRT-PCR得到的數(shù)據(jù)表達趨勢高度一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)可以作為解析尖孢鐮刀菌致病機制的依據(jù)。

KEGG富集分析表明，DEGs在鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運蛋白等代謝途徑顯著富集。其中，鞘脂代謝途徑不僅參與多種重要的信號轉(zhuǎn)導過程，還與病原真菌的致病性密切相關［17］。本研究中共發(fā)現(xiàn)17個與鞘脂代謝途徑相關的DEGs，其中在尖孢鐮刀菌侵染前后表達差異最為顯著的基因 NECHADRAFT_53688和 NECHADRAFT_78539分別通過調(diào)控能影響病原真菌生長發(fā)育和致病力的葡萄糖基神經(jīng)酰胺（glucosylceramide，GlcCer）和半乳糖基神經(jīng)酰胺（galactosylceramide，GalCer）的合成，從而對鞘脂代謝產(chǎn)生影響 ［18-21］。研究表明，沉默調(diào)控GlcCer合成相關基因的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）突變體菌株，雖仍可侵染宿主植物，但致病力明顯減弱［22］； PdGcs1是編碼柑橘綠霉菌（Penicillium digitatum） GlcCer合成的關鍵基因，缺失該基因會導致柑橘綠霉菌菌絲生長緩慢，孢子萌發(fā)延遲，且毒力顯著減弱［23］。過氧化物酶體也在真菌致病過程中發(fā)揮著重要作用，缺失過氧化物酶體 PEX6基因的炭疽病菌（Colletotrichum acutatum），致病力明顯下降，導致侵染宿主植物失?。?4］；敲除過氧化物酶體基因Mgpex6Delta的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）突變體菌株，不能形成具有侵染能力的附著孢，從而導致病原菌的致病性喪失［25］。除此之外，通過對小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）ABC轉(zhuǎn)運蛋白的功能驗證發(fā)現(xiàn)，沉默小麥葉銹病菌體內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關基因，會導致小麥葉銹病菌致病力顯著降低，并且抑制病原菌的發(fā)育，證明ABC轉(zhuǎn)運蛋白在致病菌侵染過程中發(fā)揮毒力作用［26］?；谝陨嫌^點，本研究進一步推測鞘脂代謝、過氧化物酶體和ABC轉(zhuǎn)運蛋白等代謝途徑在尖孢鐮刀菌侵染枸杞過程中發(fā)揮了極其重要的作用。

此外，為了進一步篩選出尖孢鐮刀菌在侵染過程中的關鍵致病基因，本研究對在真菌侵染過程中發(fā)揮致病作用的碳水化合物活性酶和植物—病原互作相關的DEGs進行解析。在對碳水化合物活性酶相關DEGs進行分析時發(fā)現(xiàn)，除細胞壁降解酶相關DEGs變化顯著外，MFS轉(zhuǎn)運蛋白和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關DEGs也被誘導顯著差異表達。其中，細胞壁降解酶是病原菌成功侵染宿主植物的關鍵致病因子，植物病原菌通過分泌細胞壁降解酶降解宿主植物的細胞壁成功進入植物體內(nèi)，從而對植物產(chǎn)生致病性，Zheng等［27］研究表明，水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）侵染宿主期間，大量細胞壁降解酶被誘導表達。MFS是真核生物和原核生物體內(nèi)兩個最大的膜轉(zhuǎn)運蛋白超家族之一，在植物病原菌中，MFS轉(zhuǎn)運蛋白可通過參與植物毒素的分泌，從而對植物產(chǎn)生致病性。敲除灰霉病菌（Botrytis cinerea） BcMfs1、小麥葉枯菌（Mycosphaerella graminicola） MgMfs1和炭疽病菌（Colletotrichum acutatum） ChMfs1等真菌體內(nèi)編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白的基因后，其突變體菌株均表現(xiàn)為分生孢子減少，致病力降低［12，28-29］。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，敲除編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MoSch9基因后的稻瘟病菌突變體菌株，生長速率、產(chǎn)孢量、致病力以及在寄主植物體內(nèi)的擴展能力均顯著降低，且有性生殖能力喪失［30］；Liu等［31］也發(fā)現(xiàn)缺失編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 MgATG1基因的稻瘟病菌突變體菌株，喪失侵染水稻和小麥的能力，以上研究均表明絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在植物病原菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮了致病性作用。在本研究中，編碼細胞壁降解酶的基因NECHADRAFT_48184、NECHADRAFT_8181、NECHADRAFT_122787和編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的基因NECHADRAFT_52370以及編碼MFS轉(zhuǎn)運蛋白的基因NECHADRAFT_45233均被誘導顯著上調(diào)表達，因此推測以上基因是尖孢鐮刀菌侵染枸杞的關鍵致病基因。

在對植物—病原互作相關DEGs進行分析時發(fā)現(xiàn)，Na+/K+轉(zhuǎn)運P型ATP酶編碼基因NECHADRAFT_65962和NECHADRAFT_62632、Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶編碼基因NECHADRAFT_100814等一些編碼P型ATP酶的基因在尖孢鐮刀菌侵染前后表達差異顯著。相關研究表明，P型ATP酶是一類可以被ATP驅(qū)動發(fā)生磷酸化的陽離子泵，包括Na+、K+和Ca2+轉(zhuǎn)運ATP酶，普遍存在于各種生物體中，參與生物體許多重要的代謝過程。在植物病原菌中，P型ATP酶家族基因不僅參與離子運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導等功能，部分P型ATP酶還與病菌的生長發(fā)育以及致病性密切相關［14］。相關研究在稻瘟病菌中發(fā)現(xiàn)了 MgAPT2和 PDE1兩個與致病性密切相關的P型ATP酶基因，其中? MgAPT2是稻瘟病菌侵染過程中分泌作用所必需的基因，缺少該基因的突變體菌株表現(xiàn)為多種胞外酶分泌受阻，影響附著胞的形成，而 PDE1基因則主要調(diào)控致病菌的生長發(fā)育和致病性［32-33］；蔡志英［34］利用基因敲除與互補技術，證實了Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因 CgATPase是橡膠樹膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的一個致病基因，該基因不僅影響菌株穿透橡膠樹葉片表皮組織的能力，還可調(diào)控菌株生長速度、產(chǎn)孢量以及孢子大小。此外，編碼角質(zhì)酶的基因NECHADRAFT_122567也在尖孢鐮刀菌侵染前后顯著差異表達，角質(zhì)酶在植物病原菌侵染宿主植物過程中發(fā)揮重要作用，是突破植物角質(zhì)層的主要工具酶，相關研究表明，缺失編碼角質(zhì)酶基因的突變體菌株致病力減弱或無致病力，而恢復缺失的角質(zhì)酶編碼基因后，菌株恢復致病力［35］。結(jié)合上述相關研究推測，編碼P型ATP酶的基因NECHADRAFT_65962、NECHADRAFT_62632、NECHADRAFT_100814和編碼角質(zhì)酶的基因NECHADRAFT_122567可能也是尖孢鐮刀菌成功侵染寄主的關鍵因子。

除此之外，本研究通過火山圖發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)和下調(diào)表達的DEGs中分別有兩個表達差異異常顯著的基因，其中上調(diào)表達的基因 NECHADRAFT_92084和 NECHADRAFT_51989主要調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白的活性，而下調(diào)表達的基因 NECHADRAFT_64597和 NECHADRAFT_39397則主要調(diào)控磷酸酶的活性。ABC轉(zhuǎn)運蛋白在真菌致病過程中發(fā)揮了重要作用在上文已經(jīng)得到論證，因此，本研究推測，調(diào)控ABC轉(zhuǎn)運蛋白活性的基因 NECHADRAFT_92084和 NECHADRAFT_51989極有可能也是尖孢鐮刀菌成功侵染枸杞的關鍵致病基因。而磷酸酶是一類廣泛存在于除高等植物外幾乎所有生物體內(nèi)的非特異性磷酸單酯酶，主要參與催化生物體內(nèi)的水解反應［36］。有研究表明，磷酸酶在真菌的生長發(fā)育、分生孢子的形成和對寄主的致病性方面發(fā)揮著重要作用，通過敲除稻瘟病菌體內(nèi)編碼磷酸酶的基因發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，突變體菌株生長緩慢，且分生孢子的致病力減弱［37］；除參與病原菌的致病性過程外，磷酸酶還參與病原菌對氧化脅迫的響應，研究發(fā)現(xiàn)，在氧化脅迫下，柑橘褐斑病菌編碼磷酸酶的基因表達量顯著下降［38］。在本研究中，編碼磷酸酶的基因 NECHADRAFT_64597和 NECHAD-RAFT_39397在尖孢鐮刀菌侵染后顯著下調(diào)表達，推測可能是由于枸杞為了抵御尖孢鐮刀菌的侵染，產(chǎn)生大量活性氧，導致編碼磷酸酶的基因表達受到了抑制，但其具體的作用機理以及基因 NECHADRAFT_64597和 NECHADRAFT_39397是否為尖孢鐮刀菌侵染枸杞的關鍵致病基因還需要進一步研究和驗證。

4 結(jié)? 論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，解析尖孢鐮刀菌在侵染枸杞前后的基因表達差異，初步闡明ABC轉(zhuǎn)運蛋白、過氧化物酶體以及鞘脂代謝是尖孢鐮刀菌侵染枸杞過程中的關鍵代謝途徑。此外，對細胞壁降解酶和植物—病原互作相關DEGs進行解析，最終篩選到10個與尖孢鐮刀菌致病性密切相關的致病候選基因，為后續(xù)關鍵致病基因的功能驗證奠定了理論基礎。

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Transcriptome Analysis of Fusarium oxysporum Infected Roots of Lycium barbarum

Abstract Root rot caused by Fusarium oxysporum is major disease affecting the cultivation of Lycium barbarum.We infected the roots of L.barbarum ‘Ningqi No.1 with F.oxysporum and analyzed the bacterial samples on the 7th day of infection using transcriptome sequencing.The aim was to investigate the molecular pathogenic mechanism of F.oxysporum infection in? L.barbarum and identify its key pathogenic genes.Our findings? revealed that，compared with pure culture strains，F(xiàn).oxysporum showed 1 892 significantly differentially expressed genes on the 7th day of infection，including?? 1 242 up-regulated genes and 650 down-regulated genes; GO enrichment analysis indicated that transmembrane transporter and ATPase activity classified as molecular function and transmembrane transport classified as biological process might play an important role in the pathogenesis of F.oxysporum; KEGG enrichment analysis showed that sphingolipid metabolism，peroxisome and ABC transporters were the main metabolic pathways during F.oxysporum infection.Furthemore，we identified 10 key pathogenic candidate genes by comparing the the expression levels of genes encoding carbohydrases and plant-pathogen interactions before and after F.oxysporum infection.Overall，this study provides a theoretical foundation for the elucidation of the molecular pathogenic mechanism of? F.oxysporum.

Key words Transcriptome; Fusarium oxysporum; Lycium barbarum; Differentially expressed genes; Enrichment analysis