烏頭堿調(diào)節(jié)C-C基序趨化因子配體2/C-C基序趨化因子受體2信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞抗腫瘤活性及其作用機(jī)制研究

任慧云，馮一偉，許培英

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200032

膀胱癌預(yù)后不理想，嚴(yán)重威脅病人身心健康［1-3］。C-C基序趨化因子配體2（CCL2）/C-C基序趨化因子受體2（CCR2）是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞極化的重要信號(hào)，與癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，在各種癌癥類型中高表達(dá)，抑制CCL2/CCR2信號(hào)具有很好的抗腫瘤功效，并可增強(qiáng)抗PD-1治療效果［4］，可通過(guò)減輕小膠質(zhì)細(xì)胞M2極化而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)，進(jìn)而提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人的放療療效［5］，還可通過(guò)抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞M2極化而減輕膀胱癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［6］，因而CCL2/CCR2可作為治療膀胱癌的潛在靶點(diǎn)。烏頭堿是一種有劇毒的雙酯類生物堿，可消炎鎮(zhèn)痛、減輕癌痛，能呈濃度及時(shí)間依賴性地抑制胃腺癌細(xì)胞存活及克隆形成［7］，提高小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑的敏感性［8］，還可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡［9］，但烏頭堿是否可通過(guò)下調(diào)CCL2/CCR2信號(hào)通路對(duì)膀胱癌細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤活性，目前并不清楚，2021年12月至2022年10月進(jìn)行本研究，以不同劑量烏頭堿處理體外培養(yǎng)的人膀胱癌細(xì)胞系5637，對(duì)此課題進(jìn)行探究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人膀胱癌細(xì)胞系5637（貨號(hào)ZQ0114）、RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%雙抗，貨號(hào)A0611）、RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基（貨號(hào)ZQ-200）購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司；空載質(zhì)粒、CCL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自蘇州吉瑪生物科技有限公司；烏頭堿（純度＞98%，貨號(hào)ZQ-201）購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；結(jié)晶紫染色液（貨號(hào)G1062）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，貨號(hào)ab228554）、Hoechst 33258染色溶液（貨號(hào)ab228550）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記驢抗兔IgG二抗（貨號(hào)ab6802）、兔抗人鋅指E盒結(jié)合同源盒1（ZEB1）一抗（貨號(hào)ab203829）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；一步法反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑盒（貨號(hào)D7277M）、兔抗人緊密連接蛋白1（ZO-1）一抗（貨號(hào)AF8394）、5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（5-Ethynyl-2'- deoxyuridine，Edu）-488細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)C0071S）、兔抗人上皮鈣黏素（E-cadherin）一抗（貨號(hào)AF6759）、兔抗人CCR2一抗（貨號(hào)AF2359）、兔源抗人神經(jīng)鈣黏素（N-cadherin）一抗（貨號(hào)AF0243）、兔抗人CCL2一抗（貨號(hào)AF7437）、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（貨號(hào)AF1186）、小鼠抗人Anti-BCL2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體（貨號(hào)AF0054）、兔抗人Anti-B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體（貨號(hào)AF6285）、免疫熒光染色試劑盒-抗小鼠熒光素異硫氰酸酯（FITC）（貨號(hào)P0196）、免疫熒光染色試劑盒-抗兔Cy3（貨號(hào)P0183）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)Varioskan LUX）、生物光學(xué)顯微鏡（型號(hào)Nicolet? iN? 5 FTIR）、倒置熒光顯微鏡（型號(hào)EVOS? M7000）均購(gòu)自賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司；蛋白濕式轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)為E-Blotter）、雙穩(wěn)定時(shí)通用型高電流電泳儀電源（型號(hào)ELITE HC 2.0）、垂直蛋白電泳儀（型號(hào)為V-GES）均購(gòu)自北京好億科技發(fā)展有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 篩選合適的烏頭堿作用濃度 將人膀胱癌細(xì)胞系5637快速解凍復(fù)蘇后以RPMI-1640完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后胰酶消化，傳代后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中培養(yǎng)，36 h后分別以0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L烏頭堿處理［9］，以0 μmol/L烏頭堿處理細(xì)胞做對(duì)照組，未接種細(xì)胞的培養(yǎng)孔做空白對(duì)照組，采用CCK-8試劑盒按照其說(shuō)明書中方法測(cè)出各組細(xì)胞吸光度后算出其細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=［藥物處理組D（λ）-空白對(duì)照組D（λ）］/［對(duì)照組D（λ）-空白對(duì)照組D（λ）］×100%，根據(jù)各烏頭堿處理后的細(xì)胞存活率來(lái)篩選出其合適的作用濃度。

1.2.2 分組處理5637細(xì)胞后收集標(biāo)本 將5637細(xì)胞傳代后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)36 h后，分為對(duì)照組、烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組、烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組，對(duì)照組細(xì)胞不處理，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組細(xì)胞分別以10.0、20.0 μmol/L烏頭堿處理，烏頭堿高劑量+空載組以20.0 μmol/L烏頭堿處理同時(shí)采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組以20.0 μmol/L烏頭堿處理同時(shí)采用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染CCL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，各組均處理24 h后收集其細(xì)胞沉淀，重復(fù)6次，得到6份樣品。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組5637細(xì)胞CCL2/CCR2 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取出“1.2.2”中的各組細(xì)胞與高效RIPA裂解液混勻，于冰水浴中裂解后離心，采用BCA法測(cè)出上清中總蛋白濃度后，煮沸變性蛋白后每組取出15 μg，跑電泳后做全濕電轉(zhuǎn)，以3%牛血清白蛋白封閉膜上蛋白后將其中CCL2、CCR2、GAPDH截下，分別孵育相對(duì)應(yīng)一抗、二抗后洗膜，化學(xué)發(fā)光法對(duì)各組目的蛋白顯色后攝片，采用Image Pro Plus軟件分析所得圖片并定量各組CCL2、CCR2蛋白條帶灰度值，最終得到其相對(duì)表達(dá)。

1.2.4 CCK-8法、Edu染色法及Hoechst 33258染色分別檢測(cè)各組5637細(xì)胞存活率、增殖率、凋亡率CCK-8法：將5637細(xì)胞傳代后以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在96孔板中培養(yǎng)，36 h后按照“1.2.2”中方法分組處理24 h，采用CCK-8試劑盒測(cè)出各組細(xì)胞存活率，具體見“1.2.1”。

Edu染色法：將5637細(xì)胞傳代后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)，36 h后按照“1.2.2”中方法分組處理24 h，加入Edu試劑孵育3 h后PBS漂洗、4%多聚甲醛固定后采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)并攝片，增殖細(xì)胞為Edu陽(yáng)性細(xì)胞呈明亮綠色，采用Image Pro Plus軟件分析所得圖片并定量各組增殖細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)目，算出各組細(xì)胞增殖率，公式為：增殖率=增殖細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

Hoechst 33258染色：將5637細(xì)胞傳代后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)，36 h后按照“1.2.2”中方法分組處理24 h，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定、Hoechst 33258染色溶液染色、PBS漂洗后采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)并攝片，凋亡細(xì)胞呈明亮藍(lán)色且細(xì)胞核固縮破碎，正常細(xì)胞呈微弱藍(lán)色且細(xì)胞核圓潤(rùn)，采用Image Pro Plus軟件分析所得圖片并定量各組凋亡細(xì)胞及總細(xì)胞數(shù)目，算出各組細(xì)胞凋亡率，公式為：凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組5637細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率 Transwell實(shí)驗(yàn)：將5637細(xì)胞傳代后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在經(jīng)基底膠包被過(guò)的24孔Transwell培養(yǎng)板上室中，以不含胎牛血清的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，36 h后按照“1.2.2”中方法分組處理24 h后于下室內(nèi)加入含胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后將上室細(xì)胞擦除，PBS漂洗、4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色液染色、PBS漂洗下室細(xì)胞后采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞并攝片，采用Image Pro Plus軟件分析所得圖片并定量各組細(xì)胞數(shù)目作為細(xì)胞侵襲數(shù)。

劃痕實(shí)驗(yàn)：將5637細(xì)胞傳代后以每孔2×105個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔板中培養(yǎng)，36 h后按照“1.2.2”中方法分組處理24 h，使用1 mL槍頭在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中央劃一直線，以PBS將劃痕內(nèi)細(xì)胞洗去，于生物光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞并攝片，采用Image Pro Plus軟件分析所得圖片并定量各組細(xì)胞劃痕寬度（記為L(zhǎng)0h），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次觀察各組細(xì)胞并攝片、定量各組細(xì)胞劃痕寬度（記為L(zhǎng)24h），算出各組細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（L0h-L24h）/L0h×100%。

1.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)比值（Bax/Bcl-2） 取傳代5637細(xì)胞接種在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)孔約含1×105個(gè)細(xì)胞，2 d后依照“1.2.2”中步驟分組并進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后吸出培養(yǎng)基后漂洗、固定、5%牛血清白蛋白封閉、小鼠抗人Anti-Bax抗體和兔抗人Anti-Bcl-2抗體孵育、漂洗、Alexa Fluor 488偶聯(lián)抗小鼠二抗及Alexa Fluor 555偶聯(lián)抗兔二抗孵育、漂洗細(xì)胞，依照免疫熒光染色試劑盒說(shuō)明書指導(dǎo)步驟做DAPI染色后漂洗，使用研究級(jí)正置熒光顯微鏡觀察各組Bax（綠色熒光）和Bcl-2表達(dá)（紅色熒光）情況并攝取圖像，通過(guò)Image J軟件定量各組細(xì)胞紅色、綠色平均熒光強(qiáng)度后算出Bax/Bcl-2，公式為：Bax/Bcl-2=綠色平均熒光強(qiáng)度/紅色平均熒光強(qiáng)度。

1.2.7 免疫印跡法檢測(cè)各組5637細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白（N-cadherin、ZEB1、ZO-1、E-cadherin）表達(dá) 取出“1.2.3”中剩余的各組細(xì)胞蛋白樣品液，采用免疫印跡法檢測(cè)其中各組N-cadherin、ZEB1、ZO-1、E-cadherin相對(duì)表達(dá)，具體方法見“1.2.3”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)以統(tǒng)計(jì)SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并作為計(jì)量資料以進(jìn)行描述，且符合正態(tài)分布。采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異比較，組間兩兩進(jìn)一步差異比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度烏頭堿對(duì)5637細(xì)胞存活率的影響0、2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L濃度的烏頭堿處理時(shí)5637細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）%、（85.01±10.26）%、（71.87±8.85）%、（59.22±7.12）%、（39.54±5.69）%、（35.85±5.52）%。2.5、5.0、10.0、20.0、30.0μmol/L濃度的烏頭堿均可降低5637細(xì)胞存活率（P分別為0.010，＜0.001，＜0.001，＜0.001，＜0.001），且其降低作用隨烏頭堿濃度的升高而增強(qiáng)，選擇IC50值附近的10.0、20.0 μmol/L的烏頭堿進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 各組5637細(xì)胞CCL2/CCR2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白表達(dá)均降低（均P＜0.001），烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白表達(dá)相比烏頭堿低劑量組進(jìn)一步降低（均P＜0.001）；與烏頭堿高劑量組相比，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白表達(dá)升高（均P＜0.001），烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.999）。見圖1，表1。

表1 各組5637細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平/

表1 各組5637細(xì)胞CCL2、CCR2蛋白相對(duì)表達(dá)水平/

注：CCL2為C-C基序趨化因子配體2，CCR2為C-C基序趨化因子受體2。①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與烏頭堿低劑量組相比，P＜0.001。③與烏頭堿高劑量組相比，P＜0.05。

CCR2 1.33±0.20 0.78±0.12①0.26±0.06①②0.27±0.07①②1.29±0.22③73.65＜0.001組別對(duì)照組烏頭堿低劑量組烏頭堿高劑量組烏頭堿高劑量+空載組烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組F值P值重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 CCL2 1.21±0.13 0.69±0.09①0.20±0.03①②0.19±0.04①②1.17±0.15③148.63＜0.001

圖1 免疫印跡法檢測(cè)各組5637細(xì)胞CCL2/CCR2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

2.3 各組5637細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞存活率、增殖率均降低（均P＜0.001），凋亡率均升高（均P＜0.001）；烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞存活率、增殖率相比烏頭堿低劑量組進(jìn)一步降低（均P＜0.001），凋亡率進(jìn)一步升高（均P＜0.001）。與烏頭堿高劑量組相比，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞存活率、增殖率升高（均P＜0.001），凋亡率降低（P＜0.001）；烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞存活率、增殖率與凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（存活率、凋亡率：P＞0.999；增殖率：P=0.997）。見圖2，3；表2。

表2 各組5637細(xì)胞存活率、增殖率與凋亡率/（%，）

表2 各組5637細(xì)胞存活率、增殖率與凋亡率/（%，）

注：CCL2為C-C基序趨化因子配體2。①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與烏頭堿低劑量組相比，P＜0.001。③與烏頭堿高劑量組相比，P＜0.05。

凋亡率4.32±0.57 33.56±5.28①64.23±14.32①②65.10±13.84①②7.24±1.28③61.10＜0.001組別對(duì)照組烏頭堿低劑量組重復(fù)次數(shù)烏頭堿高劑量組烏頭堿高劑量+空載組烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組F值P值6 6 6 6 6存活率100.00±0.00 67.34±10.06①39.95±8.15①②40.26±7.94①②93.86±13.45③59.18＜0.001增殖率41.67±6.20 23.95±4.34①8.13±1.32①②9.06±2.15①②38.36±7.01③66.05＜0.001

圖2 Edu染色檢測(cè)各組5637細(xì)胞增殖（×200）

圖3 Hoechst 33258染色檢測(cè)各組5637細(xì)胞凋亡（×400）

2.4 各組5637細(xì)胞侵襲、遷移檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率均降低（均P＜0.001），烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率相比烏頭堿低劑量組進(jìn)一步降低（均P＜0.001）；與烏頭堿高劑量組相比，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率升高（均P＜0.001），烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.999）。見圖4，5；表3。

表3 各組5637細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率/

表3 各組5637細(xì)胞侵襲數(shù)、遷移率/

注：CCL2為C-C基序趨化因子配體2。①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與烏頭堿低劑量組相比，P＜0.05。③與烏頭堿高劑量組相比，P＜0.05。

重復(fù)次數(shù)組別對(duì)照組烏頭堿低劑量組烏頭堿高劑量組烏頭堿高劑量+空載組烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組F值P值6 6 6 6 6侵襲數(shù)/個(gè)261.50±42.13 155.38±30.20①52.46±7.14①②50.96±8.35①②248.32±41.06③69.07＜0.001遷移率/%82.15±15.20 45.97±7.23①12.25±3.21①②13.06±4.14①②78.42±16.13③60.18＜0.001

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組5637細(xì)胞侵襲（×200）

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組5637細(xì)胞遷移（×200）

2.5 各組5637細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果對(duì)照組、烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組、烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組Bax/Bcl-2分別為0.16±0.02、0.51±0.06、0.87±0.10、0.86±0.07、0.19±0.04，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=174.40，P＜0.001）。與對(duì)照組相比，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞Bax/Bcl-2均升高（均P＜0.001），烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞Bax/Bcl-2相比烏頭堿低劑量組進(jìn)一步升高（均P＜0.001）；與烏頭堿高劑量組相比，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞Bax/Bcl-2降低（P＜0.001），烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞Bax/Bcl-2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.999）。見圖6。

圖6 免疫熒光染色檢測(cè)各組5637細(xì)胞Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bax，綠色）和B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2，紅色）表達(dá)（×200）

2.6 各組5637細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，烏頭堿低劑量組、烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞N-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)均降低（均P＜0.001），ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)均升高（均P＜0.001）；烏頭堿高劑量組、烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞N-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)相比烏頭堿低劑量組進(jìn)一步降低（均P＜0.001），ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高（均P＜0.001）。與烏頭堿高劑量組相比，烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組細(xì)胞N-cadherin、ZEB1蛋白表達(dá)升高（N-cadherin：P＜0.001；ZEB1：P=0.006），ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)降低（均P＜0.001）；烏頭堿高劑量+空載組細(xì)胞N-cadherin、ZEB1、ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（N-cadherin、ZEB1、ZO-1均P＞0.999；E-cadherin：P=0.996）。見圖7，表4。

表4 各組5637細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白相對(duì)表達(dá)水平/

表4 各組5637細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白相對(duì)表達(dá)水平/

注：CCL2為C-C基序趨化因子配體2，N-cadherin為神經(jīng)鈣黏素，ZEB1為鋅指E盒結(jié)合同源盒1，ZO-1為緊密連接蛋白1，E-cadherin為上皮鈣黏素。①與對(duì)照組相比，P＜0.05。②與烏頭堿低劑量組相比，P＜0.05。③與烏頭堿高劑量組相比，P＜0.05。

組別對(duì)照組烏頭堿低劑量組烏頭堿高劑量組烏頭堿高劑量+空載組烏頭堿高劑量+CCL2過(guò)表達(dá)組F值P值E-cadherin 0.13±0.02 0.54±0.05①0.97±0.13①②0.95±0.15①②0.16±0.03③115.45＜0.001重復(fù)次數(shù)6 6 6 6 6 N-cadherin 1.24±0.12 0.65±0.06①0.12±0.02①②0.11±0.03①②1.19±0.14③233.58＜0.001 ZEB1 1.35±0.15 0.70±0.08①0.17±0.01①②0.18±0.04①②0.35±0.05③222.92＜0.001 ZO-1 0.07±0.10 0.36±0.03①0.90±0.12①②0.89±0.14①②0.10±0.02③110.95＜0.001

圖7 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組5637細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)

3 討論

膀胱癌的臨床治療以手術(shù)去除腫瘤組織為主，并輔以膀胱灌注、放療、化療等手段，可有效緩解膀胱癌進(jìn)展，但對(duì)于發(fā)展到晚期及發(fā)生轉(zhuǎn)移的病人療效并不理想，因此尋找開發(fā)更有效的抗癌藥物對(duì)于改善膀胱癌病人預(yù)后具有重大價(jià)值［10-11］。烏頭堿是提取自中藥烏頭中的一種天然生物堿，可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路而發(fā)揮抗卵巢癌作用［12］，能通過(guò)促進(jìn)活性氧而增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞凋亡［13］，還可顯著抑制食管癌細(xì)胞增殖、克隆形成、侵襲及促進(jìn)其凋亡［14］，具有明顯的抗腫瘤作用。本研究以不同劑量烏頭堿處理5637細(xì)胞，均可降低其存活率、增殖率并升高Bax/Bcl-2，表明烏頭堿可增強(qiáng)促凋亡蛋白表達(dá)，抑制膀胱癌存活、增殖并誘導(dǎo)其凋亡；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲的關(guān)鍵生理過(guò)程，與膀胱癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)［15］，ZO-1、E-cadherin是上皮標(biāo)志物，N-cadherin、ZEB1和Vimentin是間充質(zhì)標(biāo)志物，在癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到重要調(diào)控作用［16-17］。

CCL2作為一種CC趨化因子家族的小分子量細(xì)胞因子，可招募調(diào)控單核細(xì)胞、記憶性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞功能，在不同類型的癌癥中起著關(guān)鍵作用，下調(diào)CCL2及其受體CCR2表達(dá)可通過(guò)減輕糖酵解而促進(jìn)替莫唑胺誘導(dǎo)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡［18］，減輕HER2陽(yáng)性細(xì)胞的遷移［19］，并可抑制免疫抑制巨噬細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞募集到胰腺中，進(jìn)而通過(guò)改善免疫抑制腫瘤微環(huán)境來(lái)阻止胰腺上皮內(nèi)瘤變向胰腺導(dǎo)管腺癌的進(jìn)展［20］，最終起到明顯抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示，以不同劑量烏頭堿處理5637細(xì)胞，均可降低其CCL2、CCR2蛋白表達(dá)；以烏頭堿處理5637細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染CCL2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，相比烏頭堿單獨(dú)處理，可升高細(xì)胞CCL2、CCR2、N-cadherin與ZEB1蛋白表達(dá)、存活率、增殖率、侵襲數(shù)、遷移率，降低細(xì)胞Bax/Bcl-2、ZO-1與E-cadherin蛋白表達(dá)，揭示烏頭堿抑制膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲并促使其凋亡是通過(guò)下調(diào)CCL2實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，烏頭堿可通過(guò)降低CCL2及CCR2表達(dá)而抑制膀胱癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而降低細(xì)胞增殖、遷移侵襲能力并促使其大量凋亡；最終起到顯著抗腫瘤功效，抑制CCL2/CCR2 信號(hào)激活可能是其藥理機(jī)制之一。本研究提供了烏頭堿這一新型的膀胱癌治療候選藥物，有助于其臨床開發(fā)應(yīng)用及膀胱癌病人預(yù)后的改善。