范可尼貧血癥通路影響腫瘤耐藥、化療增敏的研究進(jìn)展

楊淑賢，余克富，孫阿寧，史衛(wèi)忠，趙志剛

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100070

范可尼貧血癥是一種罕見的人類遺傳疾病，已有1 000例患者被報(bào)道，最初是瑞士?jī)嚎漆t(yī)生Guido Fanconi于1927年首次發(fā)現(xiàn)并描述的[1]。據(jù)估計(jì)，范可尼貧血癥的患病率僅為1～5人/百萬，常常在5～10歲發(fā)病，兒童攜帶的概率約為1人/36萬[2]。范可尼貧血癥的基本特征是染色體的不穩(wěn)定性，表現(xiàn)為自發(fā)斷裂增多，尤其是在DNA交聯(lián)劑如順鉑、絲裂霉素C等誘導(dǎo)下斷裂明顯高于正常人，這一特征也被認(rèn)為是診斷范可尼貧血癥的金標(biāo)準(zhǔn)。此外，范可尼貧血癥患者也常伴有癌癥易感性、骨髓衰竭和發(fā)育異常3大特征[3]。范可尼貧血癥通路的發(fā)現(xiàn)與范可尼貧血癥密切相關(guān)。迄今為止，研究者們已經(jīng)確定出了22個(gè)范可尼貧血癥基因，包括FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV、FANCW，其中1個(gè)范可尼貧血癥基因發(fā)生突變就會(huì)發(fā)生范可尼貧血癥[4]。范可尼貧血癥基因編碼的蛋白質(zhì)和相關(guān)蛋白構(gòu)成范可尼貧血癥通路，它們相互合作，調(diào)節(jié)感知，共同抵抗DNA損傷。由于其中的幾個(gè)基因也編碼乳腺癌易感基因（BRCA）產(chǎn)物，因此也被成為“FABRCA通路”[5-6]。研究表明，范可尼貧血癥通路在內(nèi)源性DNA損傷的檢測(cè)與修復(fù)中發(fā)揮重要作用，并且范可尼貧血癥途徑與腫瘤發(fā)生、腫瘤耐藥、化療藥物增敏等密切相關(guān)[7]?；谝陨?，本文歸納了范可尼貧血癥通路組成及其參與DNA損傷修復(fù)過程，討論了范可尼貧血癥通路的調(diào)控、對(duì)腫瘤耐藥、化療敏感性的影響，并總結(jié)了靶向范可尼貧血癥通路的小分子抑制劑，為癌癥干預(yù)提供新思路。

1 范可尼貧血癥通路組成及其參與DNA損傷修復(fù)過程

范可尼貧血癥基因編碼的蛋白和相關(guān)蛋白構(gòu)成了范可尼貧血癥通路。當(dāng)細(xì)胞在DNA交聯(lián)劑或紫外線照射作用下導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，范可尼貧血癥通路會(huì)被激活，從而對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，其過程主要包括4個(gè)部分（圖1）。第1部分是損傷感知模塊，位于范可尼貧血癥通路上游的FANCM與FAAP24在DNA結(jié)合輔助因子MHF1、MHF2的協(xié)助下首先識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)，并幫助募集下游的范可尼貧血癥蛋白[8-10]。第2部分是形成范可尼貧血癥核心復(fù)合體，該復(fù)合體是由八蛋白復(fù)合物（FANCA，-B，-C，-E，-F，-G，-L，-M）和輔蛋白（FAAP20、FAAP100）形成的，有E3泛素連接酶活性（該酶的活性由FANCL、RING E3連接酶完成）[11]。第3部分是形成FANCI-FANCD2異源二聚體（I-D2復(fù)合體），上述范可尼貧血癥核心復(fù)合體可發(fā)揮E3泛素連接酶活性，在DNA損傷位置募集FANCD2、FANCI，繼而單泛素化FANCD2、FANCI蛋白，形成單泛素化的I-D2復(fù)合體[12-13]。第4部分是DNA損傷修復(fù)，單泛素化的I-D2復(fù)合體定位于DNA損傷位點(diǎn)，并與下游的范可尼貧血癥蛋白如FANCD1，-O，-R，-U，-Q，-P相互作用，一起完成DNA修復(fù)過程，進(jìn)行DNA損傷應(yīng)答[14]。整個(gè)過程中，單泛素化的FANCI-FANCD2異源二聚體也能夠被去泛素化酶USP1去泛素化，周而復(fù)始，不斷完成并進(jìn)行新的修復(fù)過程[15]。

圖1 范可尼貧血癥通路參與的DNA損傷修復(fù)Fig.1 Involvement of Fanconi anemia pathway in DNA damage repair

值得注意的是，如果FANCD2/FANCI復(fù)合體不發(fā)生單泛素化，將不會(huì)有后續(xù)的DNA修復(fù)過程，因此FANCD2的單泛素化（FANCD2-S轉(zhuǎn)變?yōu)镕ANCD2-L）被認(rèn)為是范可尼貧血癥通路激活的最核心環(huán)節(jié)[16-17]。核心復(fù)合體中的FANCDL亞基是1個(gè)E3泛素連接酶，分別單泛素化FANCD2蛋白的K561位點(diǎn)和FANCI蛋白的K523位點(diǎn)，以響應(yīng)DNA損傷或復(fù)制應(yīng)激[18-20]。也有研究表明FANCI的磷酸化是FANCD2單泛素化的觸發(fā)因子，F(xiàn)ANCI在S/TQ集群域的磷酸化是觸發(fā)FANCD2單泛素化的1個(gè)分子開關(guān)[21]。此外，F(xiàn)ANCD2的單泛素化也已被證明受ATR-ATRIP激酶和E2酶UBE2T/FANCT的調(diào)控[22]。除了泛素化作用外，去泛素化作用在范可尼貧血癥通路的調(diào)節(jié)中也同等重要[23]。有研究表明，F(xiàn)ANCI/FANCD2的去泛素化由USP1-UAF1復(fù)合體特異性催化。USP1屬于泛素特異性蛋白酶類去泛素化酶，USP1與泛素結(jié)合，并催化其從與之結(jié)合的蛋白質(zhì)中去除，USP1本身的活性很小，因此需要USP1相關(guān)因子1（UAF1）活化以提高催化作用[24]。只有泛素化、去泛素化以循環(huán)的方式正常運(yùn)行，才能使FANCD2循環(huán)，不斷用于新的修復(fù)反應(yīng)。

2 范可尼貧血癥通路的調(diào)控

范可尼貧血癥通路主要受到2種機(jī)制的調(diào)控。第1種是泛素化調(diào)控。泛素化是一種重要的蛋白質(zhì)共價(jià)鍵修飾方式，通過復(fù)雜的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行，包括泛素活化酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素蛋白連接酶（E3）。在范可尼貧血癥通路中，E1酶UBA1、E2酶UBE2T（又稱FANCT）和E3連接酶（FANCL）共同負(fù)責(zé)FANCD2、FANCI的單泛素化過程[25-26]。具體步驟包括：泛素首先被E1泛素活化酶（通常是UBA1）激活，并與之形成巰基酯鍵；然后它被轉(zhuǎn)移到E2泛素結(jié)合酶（UBE2T）的催化半胱氨酸上（再次作為巰基酯中間體）；最后泛素在E3泛素連接酶（FANCL）的幫助下從E2酶轉(zhuǎn)移到FANCD2和FANCI蛋白的賴氨酸上，即可對(duì)特異性賴氨酸位點(diǎn)K561、K523進(jìn)行泛素化[27]。見圖2。

圖2 泛素化的3步酶促過程Fig.2 Three-step enzymatic process of ubiquitination

第2種是ATR激酶介導(dǎo)的范可尼貧血癥蛋白磷酸化。ATR是一種檢查點(diǎn)蛋白激酶，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)DNA單鏈斷裂時(shí)，ATR即被激活，激活的ATR可磷酸化FANCD2的Thr691、Ser717位點(diǎn)，從而促進(jìn)FANCD2的單泛素化[28]。另外，ATR也能夠磷酸化FANCI，使I-D2復(fù)合體定位于DNA損傷位點(diǎn)處，F(xiàn)ANCI與叉狀DNA相結(jié)合后，I-D2復(fù)合體的構(gòu)形也隨之發(fā)生改變，暴露FANCD2的泛素化位點(diǎn)，從而使FANCD2更容易被泛素化[22]。也有研究表明在應(yīng)激反應(yīng)期間，范可尼貧血癥核心復(fù)合物的多個(gè)成分可被ATR磷酸化激活，并指出ATR介導(dǎo)的FANCA Ser1449位點(diǎn)的磷酸化和chk1介導(dǎo)的FANCE Thr346、Ser374位點(diǎn)的磷酸化是范可尼貧血癥通路功能完整所必需的[29-30]。因此ATR激酶介導(dǎo)的磷酸化對(duì)范可尼貧血癥通路的激活至關(guān)重要。

3 范可尼貧血癥通路對(duì)腫瘤耐藥的影響

癌癥細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)DNA損傷的化療藥變得耐藥的一種方法是獲得更高的DNA損傷修復(fù)能力，而范可尼貧血癥通路作為DNA損傷修復(fù)通路之一，在腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑（如順鉑、絲裂霉素等）的耐藥中發(fā)揮重要作用。范可尼貧血癥通路的基因改變和沉默可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑的敏感性，范可尼貧血癥通路被激活則導(dǎo)致化療耐藥的產(chǎn)生[31-32]。研究表明范可尼貧血癥基因表達(dá)升高在癌癥中是普遍的，并經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)與化療耐藥相關(guān)，如A549細(xì)胞衍生的順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DR與親本和其他非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株相比，表現(xiàn)出多個(gè)范可尼貧血癥基因上調(diào)和FANCD2單泛素化升高，而敲除范可尼貧血癥基因則使A549/DR細(xì)胞對(duì)順鉑治療再次敏感[33]。也有研究表明在腺癌細(xì)胞系中，破壞范可尼貧血癥核心復(fù)合物蛋白FANCC、FANCG可消除FANCD2單泛素化作用，并使腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑、美法侖等藥物敏感，減少耐藥[34]，同時(shí)，范可尼貧血癥通路被激活也與多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌對(duì)美法侖的耐藥性有關(guān)[35-36]。除了DNA交聯(lián)劑外，范可尼貧血癥途徑還可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤對(duì)順鉑等DNA烷基化劑產(chǎn)生抗性[37]。除了范可尼貧血癥介導(dǎo)的耐藥外，還觀察到范可尼貧血癥通路相關(guān)蛋白如FANCA與癌癥患者的不良預(yù)后、生存相關(guān)[38-39]。這些研究數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了在范可尼貧血癥通路表達(dá)和功能升高而出現(xiàn)化療耐藥性的情況下，開發(fā)靶向范可尼貧血癥通路藥物的必要性，利用抑制范可尼貧血癥通路的小分子藥物和化療藥物聯(lián)合治療是克服耐藥性的新趨勢(shì)。因此，通過調(diào)控范可尼貧血癥通路使癌細(xì)胞對(duì)化療藥敏感，將推動(dòng)對(duì)抗化療耐藥新策略的發(fā)展。

4 范可尼貧血癥通路對(duì)化療敏感性的影響

范可尼貧血癥通路是細(xì)胞對(duì)DNA交聯(lián)劑耐藥所必需的，抑制范可尼貧血癥通路的調(diào)節(jié)因子或激活因子可使癌細(xì)胞對(duì)這些藥物的敏感性增加，因此，基于范可尼貧血癥通路開發(fā)的小分子抑制劑可在臨床上作為化療增敏劑用于癌癥治療。

范可尼貧血癥途徑涉及到多種酶（泛素連接酶、泛素結(jié)合酶、去泛素化酶、激酶）和許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用，所有這些成分都是范可尼貧血癥通路小分子抑制劑的潛在靶點(diǎn)，盡管對(duì)范可尼貧血癥通路的抑制可以在多個(gè)分子上發(fā)生，但FANCD2單泛素化一直是藥物干預(yù)的主要目標(biāo)[40]。Jacquemont研究小組以可抑制FANCD2核內(nèi)焦點(diǎn)形成為判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)超過16 000種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行體外篩選，鑒定出15個(gè)有望靶向范可尼貧血癥通路的分子，這些化合物包括蛋白酶體抑制劑（姜黃素、compound 5929407、硼替佐米、MG-132等）、蛋白激酶C（PKC）抑制劑（H-9、Go6976）、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1（Chk1）抑制劑（7-羥基星形孢菌、SB218078）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑（羅斯科維汀）、熱休克蛋白（HSP）90抑制劑（坦螺旋霉素）和其他成分（氯喹）[41]。其中硼替佐米抑制蛋白酶體或耗盡蛋白酶體亞基，可抑制FANCD2單泛素化，此外，它還可以通過抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)FANCD2基因的表達(dá)，并增強(qiáng)美法侖對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性，因此，硼替佐米已是復(fù)發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物[42]。近年來硼替佐米的使用擴(kuò)大到了聯(lián)合療法，如硼替佐米聯(lián)合順鉑用于范可尼貧血癥基因正常表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞時(shí)，二者表現(xiàn)出協(xié)同作用，它可增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[43]。

另外，源于植物的天然產(chǎn)物姜黃素的研究較多，姜黃素可抑制FANCD2單泛素化，并通過范可尼貧血癥通路相關(guān)性方式使卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感，提示姜黃素對(duì)順鉑的敏化作用主要通過范可尼貧血癥通路抑制發(fā)生[32]。為了將姜黃素開發(fā)為順鉑增敏劑，姜黃素聯(lián)合順鉑使用的體內(nèi)外、分子機(jī)制研究也正在進(jìn)行。此外，姜黃素的類似物如EF24、4H-TTD也已被證明可抑制FANCD2的激活，并增加順鉑的敏感性[44]。另外，pevonedistat被證明能削弱FANCD2的激活，使癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)劑更敏感[45]。1項(xiàng)研究表明咖啡因可通過抑制FANCD2的單泛素化調(diào)控DNA修復(fù)過程，增強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌的抗癌效果[46]。Burkitt研究小組將順鉑與范可尼貧血癥通路抑制劑苯丁酸酯聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合使用誘導(dǎo)了更大程度的頭頸部癌細(xì)胞凋亡，證實(shí)了苯丁酸酯對(duì)順鉑有增敏作用，苯丁酸酯通過下調(diào)BRCA1抑制FA/BRCA通路，提高頭頸部癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[47]?？梢娽槍?duì)范可尼貧血癥通路中的蛋白，特別是FANCD2蛋白是一個(gè)比較可行的抗腫瘤靶點(diǎn)。另外，阻斷FANCD2蛋白的泛素-去泛素化循環(huán)也可導(dǎo)致范可尼貧血癥通路的抑制。近年來，一些針對(duì)USP1-UAF1去泛素化酶復(fù)合體抑制劑已經(jīng)被開發(fā)出來。小分子抑制劑（哌咪清、GW7647）以及更具選擇性的抑制劑ML323均可抑制FANCD2去泛素化作用，增強(qiáng)順鉑對(duì)化療耐藥癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性[48-49]。抑制USP1-UAF1復(fù)合體也會(huì)通過增加USP1的另一底物單泛素化PCNA的水平來損害跨損傷DNA合成，這表明抑制USP1-UAF1復(fù)合體可以同時(shí)針對(duì)范可尼貧血癥通路中的兩個(gè)主要步驟[50]。因此USP1抑制劑也可以在治療癌癥方面發(fā)揮作用。

值得指出的是，闡明上述候選抑制劑的具體機(jī)制將是開發(fā)具有特異性、有效性的范可尼貧血癥抑制劑的關(guān)鍵。為進(jìn)一步了解范可尼貧血癥通路的調(diào)控作用，需要精確分析每種藥物對(duì)范可尼貧血癥通路中各個(gè)步驟的作用，以確定它們的特定靶點(diǎn)，這些分析將包括體外ATR激酶檢測(cè)、體外UBE2T和FANCL自泛素化檢測(cè)、范可尼貧血癥核心復(fù)合物的形成評(píng)估等。此外，對(duì)范可尼貧血癥通路相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)解析可為藥物設(shè)計(jì)、候選抑制劑的靶點(diǎn)確定提供有用的信息[51-52]?？傮w來講，針對(duì)范可尼貧血癥通路的藥物開發(fā)仍處于早期階段，因此目前還沒有被大家廣泛接受的范可尼貧血癥特異性抑制劑存在。

5 結(jié)語與展望

范可尼貧血癥是一種罕見的遺傳疾病，由目前已知的22個(gè)范可尼貧血癥基因中的其中1個(gè)突變引起。這些基因編碼的蛋白質(zhì)和其他范可尼貧血癥相關(guān)的蛋白質(zhì)參與1個(gè)生化途徑，被稱為范可尼貧血癥通路。范可尼貧血癥通路在DNA鏈間交聯(lián)修復(fù)和基因組完整性維持中起著核心作用，在DNA鏈間交聯(lián)識(shí)別和修復(fù)過程中，范可尼貧血癥通路穩(wěn)定了復(fù)制叉，一旦修復(fù)損傷，復(fù)制就可以重新開始。

范可尼貧血癥通路的完整性決定了對(duì)產(chǎn)生DNA鏈間交聯(lián)的化療藥物的敏感性或耐藥性。癌細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物（如交聯(lián)劑順鉑）的反應(yīng)，無論是敏感還是耐藥，都取決于DNA修復(fù)途徑的狀態(tài)。如果范可尼貧血癥通路被激活，順鉑耐藥可能在初始治療后就發(fā)生，范可尼貧血癥通路在交聯(lián)劑敏感和耐藥中的重要作用確定了范可尼貧血癥通路作為癌癥治療的特定靶點(diǎn)。通過評(píng)估范可尼貧血癥通路功能狀態(tài)可以識(shí)別出對(duì)交聯(lián)劑敏感的特異性腫瘤。此外，靶向阻斷范可尼貧血癥通路可恢復(fù)交聯(lián)劑對(duì)耐藥腫瘤的敏感性，還可與交聯(lián)劑、輻射、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制劑等多種化療藥物聯(lián)合治療，提高療效[53]。針對(duì)DNA修復(fù)途徑的增敏劑與常規(guī)化療聯(lián)合應(yīng)用的療法為癌癥的治療帶來了巨大的希望。在未來，隨著對(duì)范可尼貧血癥通路的作用和機(jī)制的更深入了解，以及對(duì)該通路特異性抑制劑的識(shí)別，范可尼貧血癥通路的靶向調(diào)節(jié)將在許多化療方案中發(fā)揮重要作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突