桑黃菌絲多糖的提取及氧化還原性分析

劉開莉 梁貴秋 莫炳巧 肖瀟 徐雯雯 李安華 陸春霞韋師妮 李小群

摘要? 通過對桑黃多糖提取方法進行選取并測定其含量，選出提取率高的多糖提取方法以及最優(yōu)條件，結果表明超聲波輔助酶法較水浴輔助溶劑浸提法和微波輔助提取法得率更高，最佳提取條件為料液比1∶20（g： mL）、超聲波提取時間40 min、超聲波功率300 W、加酶量0.15%，在此條件下，桑黃菌絲多糖得率為（6.58±0.01）%；通過HPLC外標法對桑黃菌絲多糖進行成分分析，得出桑黃菌絲體多糖主要單糖成分有甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖；通過對桑黃菌絲多糖進行氧化還原分析，得出桑黃菌絲多糖均有一定的抗氧化能力，但相較VC，桑黃菌絲多糖的抗氧化能力效果略弱。

關鍵詞? 桑黃菌絲；多糖；提?。怀煞譁y定；氧化還原性

中圖分類號? R284? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2024）04-0157-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.035

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Extraction of Polysaccharide from Mycelia of Sanghuangporus lonicericola and Analysis of Oxidative Reducibility

LIU Kai.li1，2，LIANG Gui.qiu1，2，MO Bing.qiao1，2 et al

（1.Guangxi Silkworm Technology Promotion Station，Nanning，Guangxi 530007;2.Guangxi Key Laboratory of Sericultural Genetic Improvement and Efficient Breeding，Nanning，Guangxi 530007）

Abstract? By selecting extraction method? and determining the content of polysaccharide of S. lonicericola， the polysaccharide extraction method with high extraction rate and the optimal conditions were selected. The results showed that ultrasonic assisted enzymatic method had a higher yield than water bath assisted solvent extraction method and microwave.assisted extraction method. The optimal extraction conditions were solid.liquid ratio of 1∶20 （g∶mL）， ultrasonic extraction time of 40 min， ultrasonic power of 300 W， the enzyme dosage of 0.15%. Under these conditions， the yield of polysaccharide from mycelial of S. lonicericola was （6.58±0.01）%. By HPLC external standard method， the main monosaccharide components of S. lonicericola mycelial polysaccharide were mannose， glucosamine， ribose， rhamnose， glucuronic acid， galacturonic acid， amino galactose， glucose， galactose， xylose， arabinose and fucose. Through oxidation.reduction analysis of S. lonicericola mycelial polysaccharide， it was found that S. lonicericola mycelial polysaccharide had certain antioxidant capacity， but compared to VC， the antioxidant effect of S. lonicericola mycelial polysaccharide was slightly weaker.

Key words? S. lonicericola mycelial;Polysaccharide;Extract;Composition determination;Oxidation reduction

基金項目? 廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科AB21196040）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系廣西創(chuàng)新團隊建設項目（nycytxgxcxtd-2021-02-05）。

作者簡介? 劉開莉（1988—），女，廣西玉林人，農(nóng)藝師，從事蠶桑資源綜合利用和食品加工研究。*通信作者，正高級農(nóng)藝師，碩士，從事蠶桑資源綜合利用、食品加工和食品微生物研究。

收稿日期? 2023-03-31

桑黃［Sanghuangporus lonicericola （Parmasto） L.W.Zhou & Y. C. Dai］是銹革孔菌科桑黃屬真菌，菌蓋呈木質狀，扁平球形或馬蹄形，顏色呈淺肝褐色至暗灰色或黑色，幼期有細微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱，老時常龜裂，無皮殼，菌肉深咖啡色，木質［1］。桑黃可多年生長在樹上，主要寄生于桑樹，楊樹、樺樹等樹木上也可生長，目前桑黃已實現(xiàn)人工栽培，我國東北、華北等已廣泛人工栽培桑黃［2-3］。桑黃始載于《藥性論》，其具有抗腫瘤、抗癌、抗氧化等作用，尤其對婦科疾病具有一定的療效，因此被賦予“桑樹黃金”的美譽［4-5］。隨著桑黃藥用價值的不斷被挖掘，桑黃栽培得到越來越重視，同時其活性成分的提取、分離等研究也取得了有效進展。桑黃菌絲提取多糖較子實體提取多糖更為容易，利用價值更高，因此該試驗通過對桑黃菌絲多糖提取的方法、成分測定和氧化還原性進行分析，以期為桑黃進一步開發(fā)利用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 試材。桑黃菌種由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術推廣站食品加工研究實驗室提供。在無菌的環(huán)境中，取1 cm3桑黃母種，接入經(jīng)高壓滅菌的100 mL PD培養(yǎng)基中，置于26 ℃、150 r/min的搖床中培養(yǎng)14 d，過濾得到菌絲體，將桑黃菌絲體于60 ℃烘干至質量恒定，粉碎過60目篩，置于封口袋中于冰箱中冷凍備用。

1.1.2? 試劑。無水乙醇、苯酚、濃硫酸、無水葡萄糖等，均為分析純，由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3? 儀器。全溫培養(yǎng)搖床（QHX-250BSH-Ⅲ型）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A型）；電子分析天平（ME104型）；數(shù)控超聲清洗器（KQ-500B型）；冷凍離心機（H1750R）；斷水自控電熱蒸餾水器；粉碎機；酶標儀。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 苯酚溶液的制備與標準曲線的繪制。

1.2.1.1

苯酚溶液的制備。稱取80 g苯酚（C6H12O6，重蒸餾）于100 mL燒杯中，加水定容至100 mL的棕色容量瓶中，得到80%的苯酚溶液。吸取5 mL苯酚溶液（80%）溶于75 mL 水中，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配，標記為苯酚工作液。

1.2.1.2? 標準曲線的繪制。根據(jù)中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 4260—2015［6］的苯酚-硫酸法繪制標準曲線。將葡萄糖于105 ℃恒溫烘干至恒重，準確稱取1.000 g 葡萄糖于100 mL燒杯中加水溶解，定容至1 000 mL容量瓶中，即葡萄糖濃度為1.0 g/L。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖溶液（1.0 g/L）于具塞刻度試管中，用蒸餾水補至1 mL，向試管中加入1.0 mL苯酚工作液后快速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，充分搖勻后置于30 ℃水浴中反應20 min，490 nm測量吸光度，繪制標準曲線（圖1）。得到回歸方程為y=4.481 6x+0.301 4（R2=0.991 7），其中y為吸光度，x為葡萄糖濃度。

1.2.2? 桑黃多糖提取方法的選取及含量測定。

1.2.2.1? 水浴輔助溶劑浸提法。

參考李瑞雪等［7］對桑黃菌絲體多糖的研究，根據(jù)其單因素試驗的結果，該試驗以料液比、水浴溫度、水浴時間、提取次數(shù)為影響多糖提取率的主要因素，每個因素設3個水平，選用L9（34）正交試驗設計（表1），每個處理3次重復。

準確稱取樣品10.00 g，按表1正交試驗設計進行多糖提取，合并提取的濾液，加入4倍體積的無水乙醇，搖勻后3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，將殘渣于30 ℃恒溫烘干。稱取烘干后的殘渣樣0.20 g，按照“1.2.1.2”方法測定多糖含量，根據(jù)標準曲線計算結果，計算提取率。

1.2.2.2? 微波輔助提取法。

參考秦俊哲等［8］采用微波輔助提取法提取桑黃子實體多糖的研究，該試驗以料液比、微波提取時間、微波功率、提取次數(shù)為影響多糖提取率的主要因素，每個因素設3個水平，選用L9（34）正交試驗設計（表2），每個處理3次重復。

稱取樣品10.00 g，參照表2正交試驗設計進行多糖提取，以下操作步驟同“1.2.2.1”。

1.2.2.3? 超聲波輔助酶法。

參考時東方等［9］對桑黃菌絲體粗多糖的提取方法研究和程偉等［10］對桑黃多糖超聲波協(xié)同纖維素酶法提取的工藝優(yōu)化研究，在其單因素試驗的基礎上，該試驗選用L9（34）正交試驗設計（表3），設定4個因素，每個因素3個水平，每個處理3次重復。

稱取樣品10.00 g，參照表3正交試驗設計進行多糖提取，以下操作步驟同“1.2.2.1”。

1.2.3? 桑黃菌絲多糖的單糖組成分析。樣品由上海微譜化工技術服務有限公司采用HPLC外標法進行測試分析。

1.2.4? 桑黃菌絲多糖抗氧化性分析。

取“1.2.2”中通過不同方法提取得到的桑黃菌絲多糖為供試樣品，充分混勻后在料液比1∶20、提取溫度80 ℃、提取時間2 h、提取2次的條件下處理桑黃菌絲多糖，然后濃縮蒸干得到桑黃菌絲多糖提取物，于-18 ℃保存?zhèn)溆?，用于桑黃菌絲多糖的抗氧化性分析。

1.2.4.1? 不同濃度桑黃菌絲多糖溶液的配制。準確稱取桑黃菌絲多糖提取物1.0 g于100 mL容量瓶中定容，即得10 mg/mL 的母液，4 ℃保存。分別從母液中吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25? mL于10? mL容量瓶中定容，即為濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的樣品待測液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4.2? 不同濃度VC溶液的制備。準確稱取VC標準品1.0 g于100 mL容量瓶中定容，即得10 mg/mL的VC標準母液，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL于10? mL容量瓶中定容，即為濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL的VC標準溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4.3? 羥自由基清除率測定。

取試管先加2.0 mL硫酸亞鐵溶液（濃度為2 mmol/L）、2.0? mL過氧化氫溶液（濃度為6 mmol/L），搖勻后加入3.0? mL水楊酸（濃度為6 mmol/L），再充分搖勻，放于37 ℃水浴鍋中反應15 min，取一支試管測量其吸光度記A0，分別向余下試管中依次加入0.6 mL樣品待測液（或同濃度的VC標準液，做對比試驗）和0.4 mL雙蒸水，搖勻后37 ℃水浴15 min，在510 nm處測定吸光度Ab，重復3次試驗，取平均值［11］。同時以2.0 mL雙蒸水代替過氧化氫溶液作空白對照，記Ac。按以下公式計算羥自由基的清除率（P）：

P=［1-（Ab-Ac）/A0］×100%

1.2.4.4? 超氧陰離子自由基清除率測定。

配制不同濃度的桑黃菌絲多糖樣品待測液，操作步驟參照“1.2.4.1”。分別吸取不同濃度待測液0.2 mL于盛有5.7 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH=8.20，50 mmol/L）的試管中，在25 ℃水浴中靜置10 min，然后加入0.1 mL鄰苯三酚溶液（25 ℃，6 mmol/L），用漩渦混勻器迅速充分混勻，用酶標儀測定反應1 min時的吸光度A1，同時用雙蒸水代替樣品待測液作空白對照測吸光度A2，波長為325 nm［12］。用等濃度的樣品待測液作參照測定吸光度A3，以扣除樣品本身的顏色對結果的干擾。按以下公式計算超氧陰離子自由基的清除率（P）：

P=［1-（A1-A3）/A2］×100%

1.2.4.5? 還原力測定。

按照“1.2.4.1”的步驟配制不同濃度的桑黃菌絲多糖待測液，分別吸取2 mL于刻度試管中，加入2 mL 磷酸緩沖液（pH為6.6）和2 mL鐵氰化鉀溶液（1%），充分混勻，在50 ℃下水浴20 min，加入2 mL三氯乙酸溶液（10%），混勻后取2 mL混合液，加入2 mL去離子水和0.4 mL三氯化鐵溶液（0.1%），靜置10 min，在700 nm下測定吸光度Ax；用蒸餾水代替樣品待測液作空白對照，測定其吸光度Ao；以質量濃度為0.25 mg/mL的VC溶液的吸光度Ay為基準，重復3次試驗，取平均值［11］。按照以下公式計算還原力：

還原力=（Ax-Ao）/（Ay-Ao）×100%

2? 結果與分析

2.1? 不同提取方法桑黃菌絲多糖的含量比較

通過正交設計試驗，分別得到不同方法提取桑黃菌絲體多糖的最佳工藝條件，在此條件下測定桑黃菌絲體的多糖得率并加以比較，結果見表4～6。

表4結果表明水浴輔助溶劑浸提法的最佳提取條件為料液比1∶15（g∶mL）、水浴溫度80 ℃、水浴時間2.5 h、提取次數(shù)2次，在此條件下做重復試驗，桑黃菌絲多糖得率為（5.01±0.02）%。表5結果表明微波輔助提取法的最佳提取條件為料液比1∶20、微波提取時間15 min、微波功率550 W、提取次數(shù)2次，在此條件下做重復試驗，桑黃菌絲多糖得率為（5.67±0.03）%。表6結果表明超聲波輔助酶法的最佳提取條件為料液比1∶20、超聲波提取時間40 min、超聲波功率300 W、加酶量0.15%，在此條件下做重復試驗，桑黃菌絲多糖得率為（6.58±0.01）%。

2.2? 被測桑黃樣品菌絲多糖成分分析

通過HPLC外標法分別對單糖標準品和桑黃菌絲多糖樣品進行測試分析，結果如圖2所示。圖2a為12種單糖標準品呈現(xiàn)的12個主色譜峰，圖中顯示出峰時間按順序排列分別為甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖。圖2b顯示測試樣品中所含單糖的出峰時間，能準確地測定桑黃菌絲多糖中單糖的組成情況。

2.3? 桑黃菌絲多糖抗氧化能力測定

2.3.1? 桑黃菌絲多糖對羥自由基的清除率。

由圖3可知，桑黃菌絲多糖對羥自由基的清除率隨濃度的增加而升高，濃度在0.05～0.50 mg/mL時羥自由基清除率上升較快，之后羥自由基清除率上升速度放緩，在1.25 mg/mL時羥自由基清除率達到31.95%。相比VC對照組，VC濃度在0.75 mg/mL時羥自由基清除率達到了99.64%，而桑黃菌絲多糖的羥自由基清除率為29.33%，桑黃菌絲多糖對羥基自由基清除效果并不是很明顯。

2.3.2? 桑黃菌絲多糖對超氧陰離子自由基的清除率。

由圖4可知，桑黃菌絲多糖對超氧陰離子的清除率都隨濃度的增加而升高，但升高的速度較緩。桑黃菌絲多糖的濃度在0.05～0.25 mg/mL時超氧陰離子清除率上升較快，之后超氧陰離子清除率上升速度有所減緩，在1.25 mg/mL時超氧陰離子清除率達到32.50%，但對比VC濃度在1.25 mg/mL時的清除率（97.54%），桑黃菌絲多糖對超氧陰離子清除效果明顯弱于VC。

2.3.3? 桑黃菌絲多糖的還原力。

由圖5可知，桑黃菌絲多糖的還原力隨濃度的增加而升高。桑黃菌絲多糖的濃度在0.05～0.50和1.00～1.25 mg/mL 時還原力的上升速度較快；濃度在0.50～1.00 mg/mL時還原力上升速度放緩，在1.25 mg/mL 時桑黃菌絲多糖的還原力達到37.03%，而相比VC濃度在0.50 mg/mL時還原力為98.27%，桑黃菌絲多糖的還原力效果略弱于VC。

3? 結論與討論

3.1? 不同提取方法桑黃菌絲多糖含量分析

選擇合適的多糖提取方法，能充分提高多糖的得率，對活性成分的高效獲得和保持有效有重要意義。多糖的提取方法有溶劑浸提法、超聲波提取法、微波提取法、酶法和超臨界萃取法［13］。目前，試驗用得較多的是溶劑浸提法、超聲波提取法和微波提取法［14］。該研究通過不同的提取方法，選擇適合桑黃多糖的最佳提取方法，并測定桑黃菌絲體和菌液的多糖含量，為桑黃多糖的研究提供理論基礎。

竇茜茜等［15］通過熱水浸提法得到桑黃子實體多糖提取的最佳工藝條件：料液比1∶15、浸提時間8 h、浸提溫度100? ℃、浸提3次，得率為3.26%。徐衛(wèi)東等［16］利用響應面優(yōu)化法對桑枝多糖提取條件進行研究，得到最佳提取條件：料液比1∶20、提取溫度100 ℃、浸提時間2.5 h、提取2次，桑枝多糖得率為6.15%。李瑞雪等［7］在單因素試驗的基礎上利用多因素正交試驗對桑黃菌絲體中桑黃多糖的提取條件進行研究，得到熱水浸提取桑黃多糖的最佳條件：料液比1∶14、提取溫度60 ℃、提取時間2.5 h、提取3次，多糖得率為4.97%。對比前人研究，該試驗采用料液比1∶15、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h、提取2次對桑黃菌絲體進行多糖提取，在此條件下桑黃菌絲多糖得率為（5.01±0.02）%。導致結果的差距可能是提取條件的不同以及桑黃品種之間多糖含量存在差異。

時東方等［9］以桑黃菌絲為原材料，確定了微波輔助提取法的最佳工藝，并通過研究表明微波輔助提取法在提取時間和提取率上優(yōu)于熱水浸提法。秦俊哲等［8］通過對桑黃子實體多糖提取的研究，得出提取多糖的最佳工藝條件：微波處理時間5.1 min、微波功率540 W、提取2次，得率為4.18%。對比前人研究，該試驗微波輔助提取法的最佳提取條件為：料液比1∶20、微波提取時間15 min、微波功率550 W、提取次數(shù)2次，在此條件下桑黃菌絲多糖得率為（5.67±0.03）%，從試驗結果得知微波輔助法在提取時間上有明顯優(yōu)勢，且提取率較熱水浸提法更優(yōu)，這與時東方等［9］的觀點相同。

長城等［17］通過4種方式對桑黃子實體中多糖工藝的提取進行研究，得出超聲波提取法的最佳條件：超聲時間25 min、液料比400∶1（mL∶g）、超聲功率60 kHz。傅海慶等［18］研究得到桑黃菌絲多糖提取的最佳工藝條件：超聲波功率210 W、提取時間60 min、料液比1∶50（g∶mL），提取率為12.78%。對比前人研究，該試驗超聲波輔助酶法的最佳提取條件為料液比1∶20、超聲波提取時間40 min、超聲波功率300 W、加酶量0.15%，在此條件下做重復試驗，桑黃菌絲多糖得率為（6.58±0.01）%。導致結果的差距可能是提取條件的不同以及桑黃品種之間多糖含量存在差異。

3.2? 桑黃樣品菌絲多糖成分分析

許謙［19］以桑黃菌絲體為材料，利用硅膠薄層分析的方法分析桑黃多糖的主要組成成分，試驗得出桑黃菌絲體多糖的單糖組成初步確定有D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。魏靜等［20］通過對桑黃菌絲體多糖（P1B）進行結構測定，結果表明P1B為單一組分，分子量為27 365 D，主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖3種已知單糖和甲基-α-D-吡喃甘露糖苷一種推測成分組成的雜多糖。對比前人研究，該試驗結果表明桑黃菌絲體多糖主要單糖成分有甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，單糖成分基本一致。

3.3? 桑黃菌絲多糖抗氧化能力分析

該試驗結果表明桑黃菌絲多糖均有一定的抗氧化能力，但相較VC，桑黃菌絲多糖的抗氧化能力效果略弱。應瑞峰等［21］通過比較桑黃子實體與不同階段桑黃菌絲多糖的抗氧化活性，表明桑黃菌絲體多糖活性會因不同生長期而存在差異。因此，在今后的研究中，遵循桑黃菌絲多糖的變化規(guī)律，深入研究桑黃菌絲的培育復壯，培育出活性更強的桑黃菌絲，為桑黃發(fā)展提供可靠的理論依據(jù)。

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