鐵調(diào)素水平與骨代謝相關(guān)性臨床及實驗研究

王一可 劉功穩(wěn) 王雄毅 張睿智 劉煒峰 謝伊代·如則 李俊杰 徐又佳,3*

1. 蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科,江蘇 蘇州 215000

2. 蘇州市中醫(yī)院,江蘇 蘇州 215000

3. 蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨質(zhì)疏松癥臨床中心,江蘇 蘇州 215000

鐵調(diào)素(Hepcidin)近幾年已成為國內(nèi)外研究熱點,不僅因為鐵調(diào)素是體內(nèi)降低鐵水平的“類激素”,還因為其在中風、炎癥和急性肝衰竭發(fā)病機制中存在許多重要影響作用[1-4]。鐵調(diào)素是機體鐵穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子,它是由肝細胞分泌的含有25個氨基酸的肽類激素;鐵調(diào)素能夠通過降解腸道上皮細胞表面的鐵轉(zhuǎn)運蛋白和腸腔內(nèi)鐵結(jié)合,抑制腸道對鐵的吸收,同時通過抑制腸道上皮細胞中的鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達和功能,減少鐵的釋放進入血液循環(huán)[5]。

目前鐵調(diào)素與骨代謝的相關(guān)性主要為鐵蓄積是骨質(zhì)疏松癥的獨立危險因素[6-7]。鐵調(diào)素的主要作用是在體內(nèi)通過降鐵進而挽救骨量。同時鐵蓄積對成骨細胞增殖和分化存在顯著抑制作用,最終抑制骨形成[8-9]。因而,鐵調(diào)素作為體內(nèi)影響鐵代謝的重要“類激素”,有許多關(guān)于“鐵調(diào)素-骨代謝”方面的研究:例如敲除小鼠體內(nèi)鐵調(diào)素基因,小鼠骨量顯著減低[10-11];在斑馬魚中敲除鐵調(diào)素同樣表現(xiàn)出成骨抑制等[12]。這些研究多是聚焦于鐵調(diào)素通過發(fā)揮降鐵作用,促進骨量恢復?；阼F調(diào)素與骨代謝存在相關(guān)性的基礎(chǔ)研究結(jié)果,本研究旨在探討不同骨密度人群中鐵調(diào)素水平是否存在差異,鐵調(diào)素除“降鐵作用”外,是否具有獨立促進細胞成骨分化的作用,進而分析血清鐵調(diào)素指標是否在骨質(zhì)疏松癥診療中具有臨床評估價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象及分組:收集蘇州大學附屬第二醫(yī)院骨科檢測過骨密度(DXA,雙能X線)的患者資料。納入標準:①年齡≥50歲絕經(jīng)后女性;②有DXA檢查數(shù)據(jù);③有總Ⅰ型膠原氨基末端前肽(P1NP)、I型膠原羧基末端肽(β-CTX)、25-羥基維生素D、甲狀旁腺素(PTH)和體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)等相關(guān)基線數(shù)據(jù)。排除標準:①患有骨骼系統(tǒng)疾病(骨腫瘤、骨骼細菌感染等);②屬于繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥;③合并鐵代謝異常疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織在1994年確定的骨質(zhì)疏松癥診斷標準,按骨密度T值將受試者分為兩組:①骨質(zhì)疏松組:髖部和腰椎任一受檢部位T值≤-2.5;②骨量正常組:T值>-1.0。

1.1.2實驗材料:小鼠顱頂成骨前體細胞MC3T3-E1購自普諾賽生物科技公司(中國);鐵調(diào)素購自伊萊瑞特生物科技股份有限公司(中國)。

1.1.3主要實驗試劑:α-MEM培養(yǎng)基(Gibco,美國);胎牛血清(Gibco,美國);胰蛋白酶(碧云天,中國);青霉素-鏈霉素雙抗溶液(Invitrogen, 英國);β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C(Sigma,美國);CCK-8試劑盒(碧云天,中國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天,中國);RNA提取試劑盒(諾唯贊,中國);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本);SYBR Green Supermix(Takara,日本);RT-PCR引物(金唯智,中國);茜素紅檢測試劑盒(Solarbio,中國);BMP2抗體(abcam,美國);P-SMAD1/5(CST,美國);SMAD5(CST,美國);GAPDH抗體(Affinity,中國);人鐵調(diào)素ELISA試劑盒(酶聯(lián)生物,中國)。

1.1.4主要實驗儀器:CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific,美國);多功能酶標儀(BioTek,美國);倒置相差顯微鏡(Carl Zeiss,德國);熒光定量PCR儀(ABI,美國);Western Blot成像系統(tǒng)(上海吉盛,中國)。

1.2 方法

1.2.1血清鐵調(diào)素蛋白水平檢測:收集兩組受試者血清,置于-80 ℃保存;運用ELISA試劑盒檢測鐵調(diào)素,標準曲線制備及樣品測定方法按照說明書操作;在450 nm波長處檢測OD值,根據(jù)標準曲線計算各孔濃度。

1.2.2CCK-8實驗:將MC3T3-E1細胞以5×107/孔的密度接種于96孔板中。將鐵調(diào)素重組蛋白溶于無菌PBS中。細胞分盤接種24 h后更換含有不同濃度鐵調(diào)素(0、1、5、10、50 ng/mL)的α-MEM培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)72 h后,加入CCK-8溶液并在細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。用酶標儀測定溶液在450 nm波長下的吸光度。

1.2.3RT-PCR實驗:將MC3T3-E1細胞以5×105/孔分盤接種于12孔板中,用含有不同濃度鐵調(diào)素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨分化7 d,按照試劑盒說明書提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA后進行RT-PCR。采用 2-ΔΔCt法計算靶基因的表達水平,引物序列信息見表 1。

表1 各基因的引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4Western Blot:將MC3T3-E1細胞以5×105/孔接種于12孔板中,用含有不同濃度鐵調(diào)素(0、1、5、10 ng/mL)的成骨誘導培養(yǎng)基進行成骨分化7 d,用含有PI、PPI的RIPA緩沖液制備蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白在10 %聚丙烯酰胺膠中電泳,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上轉(zhuǎn)膜2 h,室溫下使用5 %脫脂奶粉封閉1 h,用相應兔抗鼠一抗BMP2(1∶1 000)、P-SMAD1/5(1∶1 000)、SMAD5(1∶1 000)、GAPDH(1∶3 000), 4 ℃過夜,TBST洗膜,室溫下二抗(1∶5 000)孵育1 h。采用ECL化學發(fā)光法顯影,采用ImageJ軟件對各條帶灰度值進行定量測定。

1.3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計分析均使用SPSS22.0版、GraphPad Prism 9.0版進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)、R語言繪制圖表。計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布方差齊,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用ANOVA分析?；赗語言,采用Pearson相關(guān)分析進行變量相關(guān)關(guān)系分析,利用隨機森林算法分析各變量對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要性。P<0.05,認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般數(shù)據(jù)比較

本研究共入組73例,其中骨量正常組35例、骨質(zhì)疏松組38例。兩組的年齡、身高、體重、BMI相比,未見明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 兩組間基礎(chǔ)指標比較Table 2 Comparison of basic indicators between two

2.2 骨代謝指標比較

兩組受試者總Ⅰ型膠原氨基末端前肽(P1NP)、I型膠原羧基末端肽(β-CTX)、25-羥基維生素D、甲狀旁腺素(PTH)之間比較未見明顯差異(P>0.05),見表3。

表3 兩組間骨代謝指標比較Table 3 Comparison of bone metabolism indicators between two

2.3 鐵調(diào)素水平比較

收集受試者血清進行分析,結(jié)果顯示,骨量正常組鐵調(diào)素水平顯著高于骨質(zhì)疏松組(P<0.000 1),見圖1。

2.4 鐵調(diào)素和腰椎、髖部骨密度間的相關(guān)性

Pearson相關(guān)系數(shù)模型檢驗分析顯示,血清鐵調(diào)素濃度和髖部骨密度T值間呈現(xiàn)中度正相關(guān)性 (R=0.567 ,P<0.001),血清鐵調(diào)素濃度和腰椎骨密度T值間呈現(xiàn)中度正相關(guān)性(R=0.524 ,P<0.001),見圖2。

圖2 鐵調(diào)素和腰椎、髖部骨密度的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of hepcidin and bone mineral density of lumbar spine and hips

2.5 隨機森林算法評估

運用R語言的隨機森林算法進行分析,觀察誤差率(Error)隨決策樹數(shù)目(ntree)的變化情況(ntree值取400～600時誤差率趨于穩(wěn)定)就可評估自變量對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松預測的重要性,見圖3。因本研究ntree選擇為400,得到最佳模型?；诖?根據(jù)各自變量通過隨機森林中的基尼系數(shù),得到各項指標重要性排序。分析后發(fā)現(xiàn)鐵調(diào)素的基尼系數(shù)大于4,證明鐵調(diào)素在骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的影響作用。

圖3 隨機森林算法評估自身指標在疾病預測中的作用

2.6 CCK-8檢測鐵調(diào)素對MC3T3-E1細胞的增殖作用

用不同濃度鐵調(diào)素(0、1、5、10、50 ng/mL)分別處理MC3T3-E1細胞72 h。結(jié)果顯示,鐵調(diào)素濃度在0～10 ng/mL對MC3T3-E1細胞增殖沒有明顯促進或抑制。當鐵調(diào)素濃度高于10 ng/mL時,對細胞的增殖具有顯著的抑制作用。見圖4。

圖4 鐵調(diào)素對MC3T3-E1細胞增殖的影響Fig.4 Effects of hepcidin on the proliferation in MC3T3-E1 cells

2.7 RT-PCR檢測MC3T3-E1成骨基因的表達

用含有不同濃度鐵調(diào)素(0、1、5、10 ng/mL)成骨誘導培養(yǎng)基誘導MC3T3-E1成骨分化7 d后,RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因表達。結(jié)果顯示在5、10 ng/mL濃度時,鐵調(diào)素顯著上調(diào)了早期成骨基因ALP和Runx2的表達。見圖5。

圖5 鐵調(diào)素對MC3T3-E1細胞成骨分化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effects of hepcidin on the translation expression of osteogenic differentiation related genes in MC3T3-E1 cells

2.8 蛋白質(zhì)印跡法檢測成骨相關(guān)信號通路變化

通過Wester-Blot檢測鐵調(diào)素對成骨分化相關(guān)通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5表達的影響。結(jié)果顯示,在濃度為5、10 ng/mL時鐵調(diào)素促進了成骨分化相關(guān)通路蛋白BMP2、P-SMAD1/5和SMAD5的表達。結(jié)果表明鐵調(diào)素通過激活BMP-SMAD通路來促進成骨分化。見圖6。

圖6 鐵調(diào)素對MC3T3-E1細胞成骨分化相關(guān)通路蛋白的表達Fig.6 Hepcidin regulates the expression of osteogenic differentiation-related pathway proteins in MC3T3-E1 cells

3 討論

在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥診療過程中,血清生物標志物可幫助醫(yī)生開展臨床評估。因此,近些年探索新的骨代謝相關(guān)指標研究越來越多。根據(jù)已有的動物、細胞實驗報道,鐵調(diào)素與骨量、骨代謝存在相關(guān)性[9,13-14]。但是骨質(zhì)疏松癥人群血清鐵調(diào)素水平如何變化,鐵調(diào)素是否具有直接調(diào)控骨量的作用,目前尚無文獻報道。

本研究檢測了絕經(jīng)后女性血清鐵調(diào)素水平,比較骨量正常、骨質(zhì)疏松癥兩組鐵調(diào)素平均值,結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松癥組的鐵調(diào)素水平顯著低于骨量正常組,這一結(jié)果初步提示骨質(zhì)疏松癥存在鐵調(diào)素水平降低現(xiàn)象。隨后分析了鐵調(diào)素與腰椎、髖部骨密度的相關(guān)性,結(jié)果顯示骨密度(腰椎及髖部)均隨體內(nèi)鐵調(diào)素水平升高而增加;這提示體內(nèi)鐵調(diào)素水平和骨量存在正相關(guān)關(guān)系,且這種相關(guān)性和鐵蓄積沒有關(guān)聯(lián)。本研究還檢測了絕經(jīng)后女性其他血清骨代謝指標(P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD),為比較鐵調(diào)素、P1NP、β-CTX、PTH、25OH-VitD與本研究組人群骨密度變化的相關(guān)性,筆者采用隨機森林算法進行自變量評估。結(jié)果顯示,當骨密度作為特征變量,在自變量中,鐵調(diào)素指標與骨密度相關(guān)性最顯著(基尼系數(shù)9.5)[15]。P1NP、β-CTX常常作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨代謝高轉(zhuǎn)換評估指標,但患者個體差異較大,易收到藥物影響[16]。而本研究組的結(jié)果中,P1NP、β-CTX與骨密度相關(guān)性沒有鐵調(diào)素顯著。綜合本組研究結(jié)果,筆者認為,人群血清鐵調(diào)素與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松存在一定相關(guān)性,進一步開展多中心、連續(xù)年齡等臨床研究對了解鐵調(diào)素作為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的評估指標有較好的臨床意義。

已有研究認為鐵調(diào)素在肝臟的表達是通過BMP2-SMAD信號通路進行調(diào)控的,BMP與肝細胞膜上的BMP受體結(jié)合,該受體磷酸化胞漿SMAD,這些SMAD易位至與SMAD4復合的細胞核,進而激活鐵調(diào)素基因的轉(zhuǎn)錄 ;鐵調(diào)素是目前發(fā)現(xiàn)的唯一在鐵穩(wěn)態(tài)中負性調(diào)節(jié)因子,其降鐵作用非常明確[9,17]。鐵調(diào)素與鐵螯合劑(DFO)在鐵蓄積狀態(tài)的骨代謝研究中,除了降低體內(nèi)鐵蓄積作用之外,還存在刺激血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、提高缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)表達、促進骨骼的血管生長等作用[18-19]。另外,鐵調(diào)素直接干預研究也比較有意義。Li 等[20]研究認為鐵調(diào)素缺乏可通過FOXO3a干擾Wnt/β-catenin通路導致骨量丟失;Guo等[21]研究認為鐵調(diào)素可促進破骨前體細胞增值和分化,在骨穩(wěn)態(tài)中有負性調(diào)節(jié)作用;Ma 等[22]研究認為鐵調(diào)素基因敲除小鼠可呈現(xiàn)低骨量表型。因此,目前研究顯示鐵調(diào)素在骨穩(wěn)態(tài)中有比較明顯作用,但在骨形成、骨吸收過程中的確切功能仍有待進一步研究。

本研究的細胞實驗中,筆者考慮鐵調(diào)素肝臟表達主要由BMP-SMAD通路調(diào)控 ;同時考慮在骨骼代謝中,BMP2是骨基質(zhì)中必須生長因子,且BMP-SMAD信號通路可調(diào)控下游靶基因促進骨細胞形成[23]。因此,采用鐵調(diào)素干預成骨前體細胞,希望了解鐵調(diào)素是否可能通過反饋機制進而激活BMP-SMAD信號通路促進成骨細胞活性。細胞實驗結(jié)果顯示,低濃度的鐵調(diào)素可以促進成骨前體細胞(MC3T3-E1)骨形成;與對照組相比,加入低濃度的鐵調(diào)素重組蛋白的MC3T3-E1細胞在mRNA層面呈現(xiàn)更高水平的ALP和Runx2表達,成骨活性增加;另一方面,在MC3T3-E1細胞中加入低濃度的鐵調(diào)素重組蛋白,與對照組相比,細胞的BMP2、P-SMAD1/5和SMAD蛋白表達量顯著增加。這些結(jié)果表明,鐵調(diào)素可能通過調(diào)節(jié)BMP2-SMAD通路活性,進而促進MC3T3-E1細胞成骨分化。

綜上,本研究發(fā)現(xiàn)人群血清鐵調(diào)素水平和骨量呈正相關(guān),成骨前體細胞實驗提示鐵調(diào)素可能通過激活BMP2-SMAD1/5信號通路促進成骨分化。本次研究結(jié)果初步說明鐵調(diào)素水平與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān),也為進一步探討鐵調(diào)素作為臨床評估指標提供了部分實驗依據(jù)。