茯神裂環(huán)羊毛甾烷型化學(xué)成分研究

鄧子怡，郁陽，4，李莉，楊財(cái)子，孫云鵬，4，王國凱，3，4，劉勁松，4*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 300；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，合肥 300；3.中藥研究與開發(fā)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 300；4.中藥功效物質(zhì)組分校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 300）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf的干燥菌核，是一種寄生在松樹根部的好氣性、喜干燥的腐生真菌[1-2]。茯神（Poria cum Pini Radix）為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf菌核中抱有松根（即茯神木）的白色部分。茯神與茯苓雖均來源于茯苓菌核，但兩者功效卻有顯著差別。茯苓味甘淡，性平，具有利水滲濕、健脾等功效；茯神味甘淡，性平，具有安神寧心、利水等功效，多用于治療驚悸失眠、健忘、驚癇、小便不利等癥[3]。茯苓和茯神均具有較好的生物活性[4]，但茯神以寧心、安神見長，兩者的化學(xué)成分和含量差異可能是導(dǎo)致其功效不同的因素之一[5]。三萜類成分是茯神主要活性成分之一，大多以四環(huán)三萜的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)[6]，主要分為羊毛甾烷三萜烯型和3，4-裂環(huán)-羊毛甾烷三萜烯型兩種類型[7]。為進(jìn)一步探究茯神的化學(xué)成分，尋找其安神寧心的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組利用中藥化學(xué)分離手段和現(xiàn)代波譜學(xué)鑒定技術(shù)對(duì)茯神化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離鑒定出11個(gè)裂環(huán)羊毛甾烷型單體化合物，分別為茯苓新酸B（1）、茯苓新酸A（2）、茯苓新酸DM（3）、16α，27-二羥基-3，4-裂環(huán)羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸（4）、茯苓新酸ZC（5）、茯苓新酸ZM（6）、茯苓新酸E（7）、茯苓新酸D（8）、茯苓新酸ZG（9）、茯苓新酸M（10）、茯苓新酸L（11），結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 化合物1～11的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structures of compounds 1～11

1 材料

1.1 儀器

Bruker AVⅢ-600（德國Bruker公司）；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters AutoSpec Premier P776質(zhì)譜儀、Waters 1525半制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析柱；Waters Sunfire（250 mm×19 mm，5 μm）制備柱。

1.2 試藥

200～300目（50～71 μm）柱色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；45 mm Lichroprep RP-18反相柱色譜硅膠（日本Fuju Silysia化工有限公司）；Sephadex LH-20凝膠（美國CE公司）；色譜用甲醇、乙腈（英國歐普森公司）；氘代吡啶（美國Cambridge Isotope Laboratories公司）；其他試劑均為分析純。

樣品于2022年6月采集于安徽省金寨縣桃?guī)X鄉(xiāng)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定其基原為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf，為菌核中間抱有松根的白色部分。鑒定標(biāo)本（LA20221001）存于安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥與天然藥物化學(xué)教研室。

2 提取與分離

取茯神干燥藥材55 kg，粉碎至20目，用3倍量100%甲醇室溫下冷浸6次，每次24 h。合并提取液，減壓濃縮至無甲醇味，得浸膏800 g。再經(jīng)硅膠色譜柱二氯甲烷-甲醇（100∶0 ～0∶100）系統(tǒng)梯度洗脫，通過薄層色譜法（TLC）檢識(shí)，合并相似流分，得到9個(gè)流分段（A1 ～A9）。

流分段A8（4.5 g）經(jīng)ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脫，得到33個(gè)亞流分，即A8-1 ～A8-33。流分A8-33經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到8個(gè)流分，即A8-33-1～A8-33-8；A8-33-8經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，65∶35 ～80∶20）分離純化得化合物1（12.57 mg，7.3 min）和化合物2（7.65 mg，8.8 min）。流分A8-32經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到5個(gè)流分，即A8-32-1～A8-32-5；A8-32-3經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70∶30，10.2 min）分離純化得化合物3（5.82 mg）。A8-32-5經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70 ∶30，6.6 min）分離純化得化合物4（9.44 mg）。流分A8-31經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個(gè)流分，即A8-31-1～A8-31-6；A8-31-6經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分離純化得化合物5（3.63 mg，7.1 min）和化合物6（4 mg，7.5 min）。流分A8-30經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個(gè)流分，即A8-30-1 ～A8-30-6；A8-30-5經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分離純化得化合物7（33.5 mg，7.0 min）和化合物8（9.6 mg，7.6 min）。A8-30-3經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35，6.6 min）分離純化得化合物9（13.22 mg）。

流分段A7（6.3 g）經(jīng)ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脫，得到31個(gè)亞流分，即A7-1 ～A7-31。流分A7-26經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱（甲醇）分離，得到6個(gè)流分，即A7-26-1～A7-26-6；A7-26-3經(jīng)半制備型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，40∶60 ～55∶45）分離純化得化合物10（14.1 mg，8.7 min）和化合物11（7.4 mg，9.8 min）。

3 結(jié)構(gòu)解析

化合物1：黃色粉末。分子式C30H44O5。ESI-MSm/z：483 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝6.2 Hz，1H，H-11），5.27 （d，J＝4.0 Hz，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.6 Hz，1H，H-28a），4.74 （1H，s，H-28b），4.50 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），2.91 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-20），2.83（dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.33 （t，J＝8.2 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.59 （s，3H，H-26），1.57 （s，3H，H-27），1.47 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為茯苓新酸B。

表1 化合物1～6的13C-NMR數(shù)據(jù) (150 MHz，C5D5N)Tab 1 13C-NMR data for compounds 1～6 (150 MHz，C5D5N)

化合物2：白色無定形粉末。分子式C31H46O5。ESI-MSm/z：497 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝4.9 Hz，1H，H-11），5.27（s，1H，H-7），4.96 （s，1H，H-31a），4.83 （s，1H，H-31b），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.49 （q，J＝12.3，9.8 Hz，1H，H-16），2.93 （td，J＝11.3 Hz，1H，H-16），2.84 （t，J＝8.7 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝7.6 Hz，1H，H-5），2.26 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-25），1.72 （s，3H，H-29），1.47 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19），0.97 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-27），0.96 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-26）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為茯苓新酸A。

化合物3：白色無定形粉末。分子式C32H48O6。ESI-MSm/z：527 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （s，1H，H-31a），5.29 （s，1H，H-11），5.27 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-31b），5.17（s，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.5 Hz，1H，H-28a），4.76 （m，1H，H-28b），4.54 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），3.62 （s，3H，H-OMe），3.01 （s，1H，H-20），2.89 （dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.27 （d，J＝7.5 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-26），1.55 （s，3H，H-27），1.43 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為茯苓新酸DM。

化合物4：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （t，J＝6.9 Hz，1H，H-24），5.00（s，1H，H-28a），4.90 （s，1H，H-28b），4.53 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27a），4.48 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-16），4.44 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27b），2.93 （t，J＝11.2 Hz，1H，H-20），2.79 （dd，J＝11.2，5.8 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝12.9 Hz，1H，H-5），1.97 （s，3H，H-26），1.80 （s，3H，H-29），1.50 （s，3H，H-30），1.14 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為16α，27-二羥基-3，4-裂環(huán)羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸。

化合物5：白色無定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.87 （d，J＝7.4 Hz，1H，H-28a），5.34（s，H，H-24），5.33 （s，H，H-11），5.28 （s，1H，H-7），5.23 （s，1H，H-28b），4.51 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），4.26 （d，J＝3.4 Hz，2H，H-29），1.81（s，3H，H-26），1.74 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.07 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為茯苓新酸ZC。

化合物6：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.75 （s，1H，H-28a），5.35 （d，J＝8.6 Hz，1H，H-24），5.15 （s，1H，H-28b），4.48 （m，1H，H-16），1.62 （s，3H，H-27），1.60 （s，3H，H-26），1.48 （s，3H，H-30），1.17 （s，3H，H-18），1.05 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表1。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為茯苓新酸ZM。

化合物7：白色無定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.45 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-24），5.30（d，J＝7.7 Hz，1H，H-11），5.26 （d，J＝8.8 Hz，1H，H-7），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.51 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-27a），4.47 （m，3H，H-16），4.42 （d，J＝11.6 Hz，1H，H-27b），1.95 （s，3H，H-26），1.71 （s，3H，H-29），1.46 （s，3H，H-30），1.06 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表2。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為茯苓新酸E。

表2 化合物7～11的13C-NMR數(shù)據(jù) (150 MHz，C5D5N)Tab 2 13C-NMR data for compounds 7～11 (150 MHz，C5D5N)

化合物8：白色無定形粉末。分子式C31H46O6。ESI-MSm/z：513 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.48 （s，1H，H-11），5.33 （d，J＝5.1 Hz，1H，H-11），5.29 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-7），5.16 （s，1H，H-31b），4.83 （d，J＝2.9 Hz，1H，H-28a），4.76 （d，J＝2.7 Hz，1H，H-28b），4.53（dd，J＝8.4，6.1 Hz，1H，H-16），3.01 （m，1H，H-20），2.89 （ddd，J＝10.8，6.0，2.7 Hz，1H，H-17），2.34 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-5），1.73 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-27），1.54 （s，3H，H-26），1.49 （s，3H，H-30），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表2。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為茯苓新酸D。

化合物9：白色無定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.34 （s，1H，H-11），5.29 （m，1H，H-7），4.82 （s，1H，H-28a），4.76 （s，1H，H-28b），4.50 （t，J＝9.5 Hz，1H，H-16），1.75 （s，3H，H-29），1.49 （s，3H，H-30），1.36 （s，6H，H-26，27），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表2。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為茯苓新酸ZG。

化合物10：白色無定形粉末。分子式C30H46O7。ESI-MSm/z：517 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.33 （brs，1H，H-11），5.27 （brs，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （m，1H，H-16），3.84 （m，1H，H-24），1.73 （s，3H，H-28），1.49 （s，6H，H-27，30），1.45 （s，3H，H-26），1.07 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表2。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為茯苓新酸M。

化合物11：白色無定形粉末。分子式C31H46O7。[α]25D30.8 （c 0.7，CH3OH）；ESI-MSm/z：529 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.60 （s，1H，H-31a），5.33 （d，J＝4.6 Hz，1H，H-31b），5.32 （s，1H，H-11），5.28 （d，J＝3.8 Hz，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），1.74 （s，3H，H-28），1.66 （s，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）數(shù)據(jù)見表2。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為茯苓新酸L。同時(shí)針對(duì)C-25位立體構(gòu)型確定，將化合物11與Mo2（OAc）4試劑以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑混合后測定ICD圖譜（見圖2）。圖中314 nm處Cotton效應(yīng)為負(fù)，根據(jù)Snatzke經(jīng)驗(yàn)規(guī)則[12]，該二醇體系的二面角扭角為逆時(shí)針方向，從而確定化合物中C-25位的絕對(duì)構(gòu)型為25R。

圖2 化合物11與Mo2（OAc）4的配合物在DMSO中的CD圖譜Fig 2 CD spectra of in situ formed Mo2（OAc）4 complexes of 11 recorded in DMSO

4 討論

臨床用藥中的茯苓皮、茯苓和茯神均來源于茯苓菌核，但藥用部位不同，功效作用也不相同，茯神長于寧心益智從而安神，茯苓長于健脾滲濕，赤茯苓長于行水利濕、益心潤肺，茯苓皮長于利水消腫。茯苓的主要化學(xué)成分為多糖、三萜類、甾醇等。王宏俠[13]的研究表明茯苓皮、茯神、茯苓中總?cè)坪恳来紊?，按植物形態(tài)學(xué)由內(nèi)及外的順序，茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮中3，4-裂環(huán)-羊毛甾茯苓三萜類化合物含量相對(duì)增高，而閉環(huán)羊毛甾茯苓三萜類化合物含量相對(duì)降低，通過主成分分析（PCA）法尋找的茯神、茯苓、茯苓皮差異化合物為茯苓新酸D、松苓酸，通過t-檢驗(yàn)尋找的茯神與茯苓、茯苓皮的差異化合物為26-羥基茯苓新酸G、16-α-乙酰氧基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸、羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸[13]。

三萜類成分類型和含量可能為茯神功效區(qū)別于茯苓的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。本研究從茯神中分離得到11個(gè)裂環(huán)羊毛甾烷類化合物，其中6個(gè)化合物為首次從茯苓的藥用部位茯神中得到，進(jìn)一步豐富了茯神的化學(xué)成分種類，可為今后發(fā)掘茯神安神寧心的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。