負(fù)載3-甲基腺嘌呤介孔二氧化硅的制備與釋藥性能研究

韓卓越，王秀，巫業(yè)振，胡浩然，邢亞群（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 蚌埠 33000；.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蚌埠 33000）

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴性的細(xì)胞降解途徑，是機(jī)體內(nèi)存在的一種自我修復(fù)和維持生命的過程。自噬可以表現(xiàn)出多種功能形式，包括發(fā)揮促生存作用的細(xì)胞保護(hù)形式、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性形式和不具有保護(hù)作用的非保護(hù)形式[1]。3-甲基腺嘌呤（3-MA）是一種非特異性磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑，通常在體外用于抑制自噬[2]，可與抗腫瘤藥物聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同作用。研究表明早期自噬抑制劑 3-MA的使用可保護(hù)心肌細(xì)胞免受阿霉素誘導(dǎo)的心臟毒性[3]。3-MA 可增強(qiáng)順鉑耐藥下咽鱗狀癌細(xì)胞的化療敏感性[4]，還可促進(jìn)埃索美拉唑在胃癌細(xì)胞中的抗增殖活性[5]。廣泛使用3-MA可通過自噬激活顯著降低氯仿對(duì)小鼠的肝毒性[6]。此外，3-MA抑制自噬能夠在體外增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的人結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[7]。有研究已證明3-MA在體外和體內(nèi)均可抑制骨肉瘤的生長[8]?？梢?-MA在自噬相關(guān)的疾病中發(fā)揮了重要作用，盡管用途廣泛，但 3-MA只有在高濃度時(shí)才有效，并且在室溫下的溶解度很差[9]。因此，更有效、更特異性的遞送自噬抑制劑對(duì)于開發(fā)基于抑制自噬協(xié)同抗腫瘤的輔助治療方法至關(guān)重要。

在納米技術(shù)領(lǐng)域中已經(jīng)報(bào)道了許多納米載體，其中，介孔二氧化硅（MSN）納米粒子是現(xiàn)階段非常理想的新型藥物載體，其具有獨(dú)特的多孔結(jié)構(gòu)，良好的化學(xué)穩(wěn)定性、表面功能性和生物相容性，能確保多種藥物分子的可控釋放和藥物靶向性傳遞[10-11]。在納米載體基礎(chǔ)上通過靶向修飾可以改善藥物利用率，提高治療效果，并減少全身毒性相關(guān)的不良反應(yīng)。骨靶向藥物唑來膦酸（ZOL）是雙膦酸鹽的成員之一，對(duì)骨組織表現(xiàn)出良好的親和力，具有與焦磷酸鹽類似的調(diào)節(jié)骨骼礦化的能力，且比焦磷酸鹽更穩(wěn)定，其主鏈存在兩個(gè)膦酸基，可以與羥基磷灰石表面雙齒結(jié)構(gòu)中的二價(jià)鈣離子進(jìn)行螯合[12-13]。因此，ZOL是治療骨相關(guān)疾病靶向配體的最佳選擇。本研究設(shè)計(jì)了一種將ZOL連接在聚多巴胺（PDA）包覆的MSN納米粒上，并裝載3-MA，通過性質(zhì)表征及藥物在不同條件下的釋放行為研究，初步評(píng)價(jià)其基本性能。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器 ZNCL-GS智能磁力攪拌器（上海予申儀器有限公司）；5424R離心機(jī)（艾本德生命科學(xué)公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UV-3600紫外分光光譜儀（島津公司）；JEM-2100F透射電子顯微鏡（日本電子公司）；IS50紅外分光光譜儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試藥

3-MA（批號(hào)：C13979809）、ZOL（批號(hào)：C134-76263）、十六烷基三甲基氯化銨（CTAC，批號(hào)：C12197343）、正硅酸乙酯（TEOS，批號(hào)：C12561839）、三乙醇胺（TEA，批號(hào)：20210507）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF，批號(hào)：P2136663）、無水乙醇（批號(hào)：2211073501）、鹽酸多巴胺（批號(hào)：C12659279）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：P2087852）（上海麥克林）。N，N'-羰基二咪唑（CDI，批號(hào)：K00220563）、NH2-PEG-SH（批號(hào)：K00220819）（西安凱新生物）。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米制劑的制備

2.1.1 MSN的制備 按照文獻(xiàn)[14]的方法，并進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，簡要方法如下：取適量CTAC置量瓶中加入去離子水（20 mL）混合均勻，加入TEA（0.06 g），在95℃油浴，攪拌1 h后逐滴加入TEOS（1.5 mL），滴加完畢后繼續(xù)攪拌1 h，冷卻至室溫，離心收集，沉淀醇洗3次。然后在酸性乙醇溶液中60℃冷凝回流4 h，去除致孔模板劑CTAC，離心收集，乙醇洗滌兩次。同樣的提取工藝重復(fù)兩次。離心后的沉淀冷凍干燥24 h，最終得到白色粉末MSN。

2.1.2 PDA的包覆 參考文獻(xiàn)[15]已有的方法：將100 mg MSN完全溶解在50 mL Tris-HCl緩沖液中（pH 8.5），加入50 mg鹽酸多巴胺，室溫有氧條件下攪拌（200 r·min－1）4～6 h后，離心 10 min，沉淀用去離子水洗滌兩次，最終產(chǎn)物冷凍干燥，記為MSN@PDA。

2.1.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的制備

① 活化ZOL：將ZOL（100 mg）與適量TEA溶解在DMF中，加入CDI（90 mg，無水），密閉氮?dú)獗Ｗo(hù)，60℃油浴，攪拌反應(yīng)24 h。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)未反應(yīng)完的TEA。沉淀物用乙腈洗滌兩次以去除多余的CDI，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到純活性沉淀物 ZOL[16]。

② 活化ZOL與NH2-PEG-SH連接：將純活性沉淀物ZOL（22.6 mg）溶解在適量DMSO和TEA中，將分子量為2000的NH2-PEG-SH（質(zhì)量濃度為2 mg·mL－1）滴加到溶液中，在密閉的氮?dú)庀路磻?yīng)12 h。反應(yīng)混合物在蒸餾水中透析48 h以去除多余的活性ZOL，得到ZOL-PEG-SH[17]。

③ MSN@PDA-PEG-ZOL的制備：將上述所得化合物溶解在20 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）中，加入100 mg MSN@PDA，室溫?cái)嚢柽^夜。然后，將溶液在4℃下以12 000 r·min－1離心10 min，得到MSN@PDA-PEG-ZOL，用去離子水洗滌三次后，冷凍干燥。

2.2 3-MA的包封率（EE）及載藥量（DL）的測定

2.2.1 3-MA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 稱取5 mg 3-MA于25 mL量瓶中，加去離子水配制200 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 μg·mL－1的系列工作液，使用紫外檢測，波長為273 nm。以3-MA濃度（C）設(shè)為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明3-MA在1～50 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為A＝0.0841C＋0.0159（R2＝0.9995）。

2.2.2EE和DL的測定 取3-MA對(duì)照品溶解在去離子水中，分別配制50、100、200、500、1000μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取20 mg MSN 分別放在20 mL的離心管中，依次加入10 mL不同濃度的3-MA標(biāo)準(zhǔn)溶液，水浴超聲至MSN完全分散，室溫下攪拌24 h后，離心收集上清液，用去離子水洗滌沉淀兩次。洗滌液與上清液的合并液用于載藥量和包封率的測定[18]；沉淀冷凍干燥后備用，記為MSN@3-MA。

取合并液適量，0.45 μm微孔濾膜過濾，用去離子水稀釋至適宜濃度，測定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算3-MA濃度，EE和DL分別按公式（1）、（2）計(jì)算。

式中3-MA的含量記為W1（g），MSN@3-MA稱重記為W2（g），初始3-MA投入量記為W3（g）。

結(jié)果如圖1和表1所示，3-MA在273 nm處存在特征峰，而MSN@3-MA的UV曲線中存在3-MA的特征峰，證明3-MA加載在納米粒子中。不同3-MA濃度的DL和EE如表1所示，在50～1000μg·mL－1范圍內(nèi)，DL隨濃度的增加而增加，濃度在1000 μg·mL－1時(shí)，EE為（90.87±0.05）%，DL為（37.55±0.02）%。

表1 不同濃度3-MA的EE及DLTab 1 Encapsulation rate and drug loading amount of different mass ratios of 3-MA

圖1 3-MA、MSN、MSN@3-MA的UV圖譜Fig 1 UV spectrum of 3-MA，MSN，and MSN@3-MA

2.3 MSN@PDA-PEG-ZOL的表征分析

2.3.1 核磁共振氫譜（1H-NMR）分析 取制得的產(chǎn)物適量，在DMSO中檢測，檢測條件為 500 MHz，利用核磁共振氫譜儀對(duì)樣品進(jìn)行測定。結(jié)果如圖2 所示，ZOL結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氫的位置見圖2A，羥基活潑氫在譜圖中未出峰，圖2B中ZOLPEG-SH氫譜圖出現(xiàn)與ZOL結(jié)構(gòu)中相應(yīng)氫的位置一致，證實(shí)兩藥合成成功。

圖2 ZOL（A）與ZOL-PEG-SH（B）的1H-NMR 譜圖Fig 2 1H-NMR of ZOL（A）and ZOL-PEG-SH（B）

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FT-IR） ZOL與NH2-PEG-SH、ZOL-PEG-SH的紅外吸收光譜如圖3所示。ZOL-PEG-SH在3143 cm－1、1580 cm－1、1545 cm－1、629 cm－1出現(xiàn)了與ZOL結(jié)構(gòu)中咪唑環(huán)化學(xué)基團(tuán)的吸收峰一致的峰。在1635 cm－1出現(xiàn)了吸收峰與酰胺（C＝O）的伸縮振動(dòng)有關(guān)的吸收峰，表明形成了新的酰胺鍵，證實(shí)了兩藥成功合成。MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖如圖4所示，納米粒子均在1054 cm－1和965 cm－1處出現(xiàn)吸收峰，分別為Si-O-Si伸縮振動(dòng)和硅醇基振動(dòng)。包覆PDA后，在1633 cm－1處的峰歸屬于芳環(huán)骨架的伸縮振動(dòng)，3385 cm－1處的寬吸收峰歸屬于N-H/O-H的伸縮振動(dòng)，證明PDA包覆在MSN表面。而MSN@PDA-PEG-ZOL在1457 cm－1和1349 cm－1處出現(xiàn)的峰表明目標(biāo)配體ZOL存在于納米粒子表面上。

圖3 ZOL、NH2-PEG-SH和ZOL-PEG-SH的FT-IR光譜圖Fig 3 FT-IR spectra of ZOL，NH2-PEG-SH and ZOL-PEG-SH

圖4 MSN、MSN@PDA和MSN@PDA-PEG-ZOL的FT-IR光譜圖Fig 4 FT-IR spectra of MSN，MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

2.3.3 透射電子顯微鏡（TEM）分析 取適量納米粒子進(jìn)行了TEM分析，觀察其納米粒子形態(tài)、尺寸大小。從圖5A中可以看到 MSN 表面清晰的介孔結(jié)構(gòu)，其形態(tài)為分散均勻的球體，圖5B中可以看到PDA包覆后MSN的表面覆蓋了一層薄膜，介孔結(jié)構(gòu)被掩蓋，表明PDA成功包覆。

圖5 MSN（A）和MSN @PDA（B）的TEM照片F(xiàn)ig 5 TEM diagram of MSN（A）and MSN@PDA（B）

2.3.4 馬爾文粒度電位儀分析納米粒子的粒徑及Zeta電位 結(jié)果如圖6所示，MSN的粒徑為118 nm，電位為－（24.2±0.4）mV，MSN@PDA粒徑為148 nm，電位為－（10.8±0.2）mV，MSN@PDA-PEG-ZOL粒徑為（229.1±8.8） nm，電位為－（30.3±0.6）mV，這是由于ZOL在溶液中呈負(fù)電性，也說明ZOL成功修飾在納米粒子表面，納米粒子的多分散性指數(shù)（PDI）在0.21～0.42（在可接受的大小范圍內(nèi)）。

圖6 MSN和MSN@PDA、MSN@PDA-PEG-ZOL的粒徑（A）和電位（B）Fig 6 Particle size（A）and potential（B）of MSN，MSN@PDA and MSN@PDA-PEG-ZOL

2.3.5 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的穩(wěn)定性 連續(xù)7 d觀察納米粒子MSN@PDA-PEG-ZOL在37℃的水中及PBS中的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明在兩種介質(zhì)中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL均能保持良好的粒徑大小，說明納米顆粒在體內(nèi)及體外環(huán)境下都較穩(wěn)定。

圖7 MSN@PDA-PEG-ZOL在水及PBS中的粒徑Fig 7 Particle size of MSN@PDA-PEG-ZOL in water and PBS

2.4 體外藥物釋放考察

考察MSN@3-MA-PDA與MSN@3-MA-PDAPEG-ZOL在不同pH緩沖液中的釋藥性。分別取三組樣品適量，每組平行三份，每份8 mg，精密稱定。于2 mL PBS中超聲至完全溶解，放入透析袋（截?cái)喾肿恿?500）。透析袋浸泡在18 mL的PBS（pH為5.0、6.0、7.4）中，調(diào)整轉(zhuǎn)速為200 r·min－1。于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 取樣 1 mL，同時(shí)迅速補(bǔ)加同等體積溶出介質(zhì)。使用紫外分光光度法測定3-MA含量，并使用公式（3）計(jì)算出不同時(shí)間累計(jì)釋放率（CRP）。

式中，Ve為每次所取出的PBS溶液體積（L）；V0為緩沖溶液總體積（L）；Ci為第i次取出溶液的3-MA濃度（mg·mL－1）；n為取液次數(shù)；m3-MA為藥物載體所負(fù)載的3-MA總質(zhì)量（mg）。

如圖8所示，圖8B中MSN@3-MA-PDA-PEGZOL在pH 7.4的PBS溶液中釋藥緩慢，平均釋放率僅為（16.99±0.15）%，而在酸性條件下，3-MA的釋放度增加，在pH 5.0的PBS溶液中釋放率達(dá)到（65.11±1.64）%。說明MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL有利于藥物在腫瘤微環(huán)境中的釋放。

圖8 MSN@3-MA-PDA（A）與MSN@3-MA-PDA-PEG-ZOL（B）在pH 5.0、6.0、7.4條件下的藥物釋放曲線Fig 8 Release curves of MSN@3-MA-PDA（A）and MSN@3-MAPDA-PEG-ZOL（B）in PBS（pH 5.0，6.0，and 7.4）

3 討論

本文使用模板劑法制備了MSN，將PDA包覆MSN納米粒子后，在其表面修飾ZOL與NH2-PEGSH的連接物，制得具有骨靶向性與pH響應(yīng)性的載藥納米顆粒MSN@PDA-PEG-ZOL。通過1H-NMR、FT-IR證實(shí)ZOL與NH2-PEG-SH連接成功。采用TEM、FT-IR、動(dòng)態(tài)光散射粒徑分布儀（DLS）等表征手段對(duì)MSN@PDA-PEG-ZOL合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)與性能分析。結(jié)果表明該納米顆粒的粒徑及Zeta電位分別為（229.1±8.8）nm、－（30.3±0.6）mV；通過浸漬離心法負(fù)載3-MA，結(jié)果表明，這種多功能MSN納米顆粒具有高包封率和高載藥量，并在體內(nèi)外具有較好的穩(wěn)定性。

MSN表面包覆的PDA具有pH響應(yīng)性，在酸性條件下溶解釋放藥物，而本試驗(yàn)的體外釋藥結(jié)果也初步證實(shí)了在腫瘤微環(huán)境中釋藥量明顯高于在正常生理環(huán)境下的釋藥量，這在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)將繼續(xù)深入研究該納米顆粒在小鼠體內(nèi)藥效學(xué)及體內(nèi)外靶向性，進(jìn)一步證實(shí)納米粒子對(duì)腫瘤的靶向性，為后續(xù)骨相關(guān)疾病的治療與自噬抑制劑的遞送奠定研究基礎(chǔ)。