基于UPLC特征圖譜的苦杏仁、桃仁及甜杏仁藥材鑒別研究

葉聰，謝翡翡，李國(guó)衛(wèi)，胡綺萍，童培珍，吳潤(rùn)松，羅文匯，孫冬梅*（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510006；.廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 5844）

苦杏仁、甜杏仁、桃仁均為薔薇科（Rosaceae）種子類中藥?？嘈尤蕿樗N薇科植物山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim、西伯利亞杏PrunussibiricaL.、東北杏Prunusmandshurica（Maxim.）Koehne 或杏PrunusarmeniacaL.的干燥成熟種子[1]；甜杏仁收載在甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)（2020年版）中[2]，為薔薇科植物杏Prunus armeniacaL.的干燥成熟種子，它的基原與苦杏仁的基原杏PrunusarmeniacaL.相同，但栽培方式不同，一般不作藥用，常作為食品、飲料的原料[1，3-4]；桃仁為薔薇科植物桃Prunuspersica（L.）Batsch 或山桃Prunusdavidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子。因3種藥材同為薔薇科植物種子類中藥，化學(xué)成分均以苦杏仁苷等苷類化合物為主，相似性較高，具有止咳平喘、潤(rùn)腸通便等相似功效，但現(xiàn)代研究表明甜杏仁較苦杏仁藥力緩和，苦杏仁偏降氣止咳，甜杏仁偏于潤(rùn)肺止咳，而桃仁長(zhǎng)于活血化瘀，兼具潤(rùn)腸通便、止咳平喘的功效，故三者不可混淆使用[5-7]。

苦杏仁、桃仁、甜杏仁的功能主治及臨床應(yīng)用范圍不同，但其外觀性狀相似，容易混淆，市場(chǎng)上存在將價(jià)格相對(duì)較低的苦杏仁摻入桃仁的問(wèn)題[8]，而目前3種藥材的鑒別主要采用主觀性較強(qiáng)、依賴傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)的性狀鑒別方法，不能有效保障苦杏仁、桃仁的用藥有效性、安全性和甜杏仁的食品安全性，亟須建立一種簡(jiǎn)便、快速、專屬性強(qiáng)的鑒別方法。本研究采用UPLC法建立了苦杏仁、甜杏仁、桃仁的特征圖譜鑒別方法，并對(duì)3種薔薇科種子類藥材的質(zhì)量進(jìn)行了綜合研究，以期為苦杏仁、甜杏仁、桃仁的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZU LC-40D XS型超高效液相色譜儀（日本島津公司）；Thermo QE Focus Orbitrap型高分辨質(zhì)譜（美國(guó)賽默飛公司）；ME204E萬(wàn)分之一天平、XP26百萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多公司），KQ500D數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HWS28型（恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司）。

1.2 試藥

苦杏仁苷（批號(hào)：110820-201808，含量：88.2%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；野黑櫻苷（批號(hào)：8781，含量：98.0%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）；15批甜杏仁藥材為薔薇科植物杏P.armeniacaL.的干燥成熟種子，10批苦杏仁藥材為薔薇科植物東北杏P.mandshurica（Maxim.）Koehne、山杏P.armeniacaL.var.ansu Maxim.的干燥成熟種子，10批桃仁藥材為薔薇科植物桃P.persica（L.）Batsch、山桃P.davidiana（Carr.）Franch.的干燥成熟種子，上述樣品均由廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，分別采集于河北、河南、山東、新疆、內(nèi)蒙古、山西、遼寧、陜西、甘肅等地，詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選擇Agilent ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～5 min，0%A；5～7 min，0%～3%A；7～20 min，3%～6%A；20～23 min，6%～80%A；23～28 min，80%A；28～30 min，80%～0%A；30～35 min，0%A）；流速為0.3 mL·min－1；柱溫為25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備

取苦杏仁苷、野黑櫻苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為49.79、10.03 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

藥材粉碎，過(guò)二號(hào)篩。取35批苦杏仁、桃仁、甜杏仁藥材粉末各約2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS條件

UPLC條件同“2.1”項(xiàng)下，用0.2%甲酸代替0.2%磷酸；質(zhì)譜采用ESI離子源，噴霧電壓3.24 kV，毛細(xì)管溫度為350℃，輔助氣溫度設(shè)置為350℃，采用正、負(fù)離子掃描模式，F(xiàn)ull MS全波長(zhǎng)掃描模式，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍m/z：100～1000，分辨率為70 000，二級(jí)質(zhì)譜采用Top 20數(shù)據(jù)依賴模式選擇母離子進(jìn)行裂解，碰撞能量為梯度碰撞電壓20 eV、30 eV、50 eV。

2.5 特征圖譜研究

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取甜杏仁（編號(hào)：N1）粉末按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以7號(hào)苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.10%，相對(duì)峰面積RSD為0.04%～1.4%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取甜杏仁粉末（編號(hào)：N1）按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以7號(hào)苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.02%～0.10%，相對(duì)峰面積RSD為0.44%～1.8%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取甜杏仁粉末（編號(hào)：N1）按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以7號(hào)苦杏仁苷色譜峰為參照峰（S），計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.61%，相對(duì)峰面積RSD為1.3%～2.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 特征圖譜建立 取表1中35批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。分別將10批苦杏仁（東北杏、山杏）、10批桃仁（桃、山桃）、15批甜杏仁（杏）的圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件”（2012版），以N1、K1、T1樣品作為參照?qǐng)D譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正和峰匹配，采用中位數(shù)法分別生成甜杏仁（R1）、桃仁（R2）、苦杏仁（R3）的對(duì)照特征圖譜，如圖1所示；35批不同品種藥材疊加譜圖如圖2所示；分別計(jì)算相同品種的相似度系數(shù)，10批苦杏仁相似度均在0.942以上，10批桃仁相似度均在0.994以上，15批甜杏仁相似度均在0.946以上，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2?？嘈尤屎?個(gè)特征峰、桃仁含有6個(gè)特征峰、甜杏仁含有6個(gè)特征峰，三者含有5個(gè)共有峰，分別為峰1、峰3、峰5、峰6、峰7?？赏ㄟ^(guò)峰4區(qū)分苦杏仁（東北杏、山杏）與甜杏仁（杏），可通過(guò)峰2區(qū)分苦杏仁（東北杏、山杏）與桃仁（桃、山桃）。

圖1 甜杏仁（R1）、桃仁（R2）、苦杏仁（R3）對(duì)照特征圖譜Fig 1 Reference characteristic chromatogram of sweet apricot kernel（R1），Persicae Semen（R2），and Armeniacae Semen Amarum（R3）

圖2 35批薔薇科種子類藥材UPLC疊加圖Fig 2 Overlay of UPLC for 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

表2 不同品種藥材樣品特征圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Evaluation of similarity of characteristic chromatogram of different varieties of medicinal materials samples

2.5.5 共有峰指認(rèn) 取苦杏仁、桃仁、甜杏仁藥材（K1、T1、N1）粉末，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，得到的總離子流色譜圖（TIC）如圖3所示。根據(jù)目標(biāo)峰的一級(jí)和二級(jí)信息與mzVault標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)匹配分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)研究，指認(rèn)出峰1為扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷，峰3為扁桃酸-β-龍膽二糖苷，峰5為野黑櫻苷，峰6為L(zhǎng)-苦杏仁苷，峰7為苦杏仁苷。色譜峰的詳細(xì)質(zhì)譜信息見(jiàn)表3。

表3 甜杏仁樣品中色譜峰質(zhì)譜指認(rèn)結(jié)果Tab 3 Identification of chromatographic peaks and mass spectrometry in sweet apricot kernel

取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。通過(guò)甜杏仁藥材供試品與對(duì)照品的UPLC色譜圖比對(duì)，進(jìn)一步證實(shí)峰5為野黑櫻苷，峰7為苦杏仁苷，結(jié)果見(jiàn)圖4。因苦杏仁苷為苦杏仁、桃仁、甜杏仁主要有效成分之一，且其分離度較好，峰面積最大，穩(wěn)定性較高，故選擇苦杏仁苷色譜峰為參照峰S。

圖4 甜杏仁樣品（N1）和對(duì)照品（R）UPLC圖Fig 4 UPLC of sweet apricot kernel（N1）and reference（R）

2.5.6 聚類分析 將35批樣品的7個(gè)特征峰峰面積（缺失峰的峰面積以0計(jì)算）導(dǎo)入Bioinformatics（www.bioinformatics.com.cn），并對(duì)相同特征峰的峰面積進(jìn)行樣品間z-score歸一化處理，繪制得峰面積熱圖如圖5所示，圖中方格顏色及深淺代表樣品之間特征峰的峰面積差異，峰面積的差異可以反映相對(duì)含量的差異。由圖可見(jiàn)，除峰2外，苦杏仁、桃仁的特征峰峰面積總體上相較甜杏仁更高，且可見(jiàn)甜杏仁特征峰峰面積與其余兩者之間的差異更明顯。采用SPSS 25.0軟件對(duì)35批樣品色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以7個(gè)特征峰為變量（缺失峰的峰面積以0計(jì)算）、以平方歐氏距離為區(qū)間，采用組間連接法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。同一品種不同產(chǎn)地的苦杏仁、甜杏仁、桃仁藥材質(zhì)量均較為一致?？梢?jiàn)當(dāng)組間距離為5時(shí)，35批樣品被分為3類，15批甜杏仁被聚為Ⅰ類，10批苦杏仁被聚為Ⅱ類，10批桃仁被聚為Ⅲ類。當(dāng)組間距離為10時(shí)，桃仁和苦杏仁被聚集為一類，而甜杏仁單獨(dú)聚為另一類，說(shuō)明相較于甜杏仁，桃仁與苦杏仁的上述7個(gè)特征峰對(duì)應(yīng)的化合物相對(duì)含量更為相近，進(jìn)一步證實(shí)苦杏仁與甜杏仁雖然來(lái)源、功效相近，但由熱圖分析可見(jiàn)其特征峰所代表的化合物成分相對(duì)含量具有一定的差異，基于峰面積的聚類分析可以通過(guò)這些差異準(zhǔn)確地將10批苦杏仁和15批甜杏仁聚類為兩組。聚類分析結(jié)果與特征圖譜鑒別一致。

圖5 35批薔薇科種子藥材7個(gè)特征峰峰面積熱圖Fig 5 Heat maps of 7 characteristic peak areas of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

圖6 35批薔薇科種子藥材聚類分析結(jié)果Fig 6 Cluster analysis of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

2.5.7 正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA） 以7個(gè)特征峰的峰面積作變量（缺失峰的峰面積以0計(jì)算），采用SIMCA為14.1對(duì)35批樣品色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行判別分析，得到2個(gè)主成分，各主成分因子載荷圖見(jiàn)圖7，色譜峰7距離原點(diǎn)最遠(yuǎn)，說(shuō)明苦杏仁苷成分含量為分類3種薔薇科藥材的重要變量。建立的OPLS-DA模型的R2X為0.938，R2Y為0.884，Q2為0.861，均＞0.5，說(shuō)明所建立的模型預(yù)測(cè)能力及穩(wěn)定性較好。通過(guò)200次置換檢驗(yàn)得到R2在Y軸上的截距為－0.042，小于0.3，說(shuō)明模型擬合較好；Q2在Y軸上的截距為－0.261，小于0.05，說(shuō)明模型未過(guò)度擬合，置換檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。35批樣品得分圖見(jiàn)圖9，可見(jiàn)35批樣品被聚為3類，15批甜杏仁聚為一類，10批苦杏仁聚為一類，10批桃仁聚為一類，實(shí)現(xiàn)了3種薔薇科藥材的區(qū)分；為進(jìn)一步明確區(qū)別不同品種藥材的標(biāo)志性成分，以VIP值＞1作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了1個(gè)差異性成分，為峰7，即苦杏仁苷，進(jìn)一步證實(shí)苦杏仁苷對(duì)區(qū)分3種薔薇科藥材的貢獻(xiàn)較大，VIP值圖見(jiàn)圖10。

圖7 因子載荷圖Fig 7 Factor load diagram

圖8 置換檢驗(yàn)結(jié)果Fig 8 Replacement test results

圖9 35批薔薇科種子藥材OPLS-DA 散點(diǎn)圖Fig 9 Scatter plot of OPLS-DA for 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

圖10 35批薔薇科種子藥材OPLS-DA VIP值圖Fig 10 OPLS-DA VIP values of 35 batches of Rosaceae seed medicinal materials

3 討論

3.1 色譜條件的考察

本研究考察了不同流動(dòng)相（乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液）及檢測(cè)波長(zhǎng)（PDA檢測(cè)器波長(zhǎng)范圍：190～400 nm）下各色譜峰的峰形和分離效果，最終確定以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相體系，在210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)條件下色譜圖中色譜峰分離度較好，響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)。

3.2 提取方法的選擇

本研究以“色譜峰總峰面積/稱樣量”及色譜圖峰形為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定提取溶劑70%甲醇，提取方式為加熱回流，提取時(shí)間為30 min，作為3種薔薇科藥材特征圖譜的供試品溶液制備方法。

3.3 特征圖譜結(jié)果分析

本研究建立了35批薔薇科藥材的特征圖譜，確定甜杏仁藥材含有6個(gè)特征峰、苦杏仁含有7個(gè)特征峰、桃仁含有6個(gè)特征峰。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)、相關(guān)文獻(xiàn)研究及質(zhì)譜指認(rèn)初步指認(rèn)其中5個(gè)共有峰，分別為扁桃酸酰胺-β-龍膽二糖苷（峰1）、扁桃酸-β-龍膽二糖苷（峰2）、野黑櫻苷（峰5）、L-苦杏仁苷（峰6）、苦杏仁苷（峰7），通過(guò)對(duì)照品進(jìn)一步證實(shí)峰5為野黑櫻苷，峰7為苦杏仁苷。野黑櫻苷在體內(nèi)可作為原形成分被吸收，具有抗纖維化的作用[11]；苦杏仁苷代謝分解后產(chǎn)生的極微量氫氰酸有鎮(zhèn)咳平喘之用，但過(guò)量則會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生毒害[6]。本研究構(gòu)建3種薔薇科種子藥材的特征圖譜可通過(guò)觀察峰2、峰4的存在區(qū)分甜杏仁（杏）、苦杏仁（東北杏、山杏）、桃仁（桃、山桃），但這2個(gè)色譜峰的指認(rèn)還有待進(jìn)一步研究鑒定。由熱圖分析可見(jiàn)10批苦杏仁與15批甜杏仁的苦杏仁苷相對(duì)含量差異較大，可進(jìn)一步對(duì)苦杏仁苷進(jìn)行定量分析，通過(guò)苦杏仁苷的含量鑒別基原相同的甜杏仁與苦杏仁。

3.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

本研究采用聚類分析和OPLS-DA分析2種方法對(duì)3種薔薇科藥材進(jìn)行了判別分析。在組間距離為5時(shí)，35批薔薇科藥材準(zhǔn)確聚為3大類，15批甜杏仁藥材N1～N15聚為Ⅰ類，10批苦杏仁藥材K1～K5聚為Ⅱ類，10批桃仁藥材T1～T5聚為Ⅲ類，說(shuō)明甜杏仁、苦杏仁、桃仁等不同品種藥材之間化學(xué)成分差異較大，提示準(zhǔn)確鑒別3種薔薇科種子對(duì)苦杏仁、桃仁的用藥安全性及臨床有效性具備重要意義。根據(jù)基于特征峰峰面積的OPLS-DA分析，甜杏仁、桃仁、苦杏仁分別聚集成3大類，結(jié)果與特征圖譜分析、聚類分析相互印證。VIP值在OPLS-DA分析中用來(lái)衡量變量對(duì)于區(qū)分兩個(gè)或多個(gè)類別的重要性，VIP值越高，表示該化合物對(duì)于區(qū)分不同類別的貢獻(xiàn)越大，VIP值高的化合物通?？梢哉f(shuō)明該化合物的含量差異是區(qū)別兩個(gè)類別的重要因素。以VIP值＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出苦杏仁、桃仁、甜杏仁的差異性標(biāo)志物為苦杏仁苷（峰7），提示苦杏仁苷含量的差異是區(qū)別3種藥材的重要因素。

4 結(jié)論

本研究建立了苦杏仁、桃仁、甜杏仁的UPLC特征圖譜鑒別方法，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)比較了3種藥材之間的化學(xué)成分差異，可以快速、準(zhǔn)確區(qū)分甜杏仁、苦杏仁、桃仁藥材，為3種薔薇科藥材的鑒別和薔薇科種子藥材資源的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。