蒙藥角茴香配方顆粒指紋圖譜及含量測定研究

韓子璇，劉夢，楊立茹，李佳，康廷國*，張純剛，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6620；2.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長治 046000；3.祈蒙股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024330）

蒙藥材角茴香是蒙醫(yī)常用藥材，為罌粟科植物直立角茴香（或細(xì)葉角茴香）HypecoumerectumL.的干燥全草，別名咽喉草、山黃連等，主產(chǎn)于內(nèi)蒙古、河北、遼寧等地[1-2]。角茴香具有解毒、解熱、止痛等功效，含有生物堿類、黃酮類、糖類、酸類、微量元素等多種化學(xué)成分，其中的生物堿類成分具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、保肝等藥理作用，是角茴香的主要活性成分[3-5]。

蒙醫(yī)藥的理論基礎(chǔ)獨(dú)特，在劑型方面多以散劑、丸劑為主，而且在許多藥方、制劑中習(xí)慣性采用原粉入藥，導(dǎo)致蒙藥制劑服用口感差，患者依從性差。本課題組在前期研究中成功制備了角茴香配方顆粒，改善了原散劑的適口性，便于臨床調(diào)配。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室初步驗(yàn)證及試驗(yàn)生產(chǎn)，證實(shí)該顆粒符合蒙藥制劑企業(yè)的制劑需要與生產(chǎn)要求。

通過對角茴香藥材和相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前角茴香藥材收錄于2020版《內(nèi)蒙古蒙藥飲片炮制規(guī)范》，并規(guī)定HPLC法測定藥材中原阿片堿的含量不得少于0.3%[1]；文獻(xiàn)涉及有對角茴香中生物堿、黃酮類成分的提取、含量測定及指紋圖譜的研究，但文獻(xiàn)數(shù)量較少，且內(nèi)容不全，更無關(guān)于角茴香配方顆粒的研究[6-9]。為更好地對蒙藥角茴香配方顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，本研究建立蒙藥角茴香配方顆粒的HPLC指紋圖譜，并在此基礎(chǔ)上對指紋圖譜指認(rèn)的3種化學(xué)成分進(jìn)行含量測定，以期為蒙藥角茴香配方顆粒的質(zhì)量控制及蒙藥新劑型的發(fā)展提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

15批直立角茴香藥材細(xì)粉（批號：YL2022201、YL2022301、YL2022302、YL2022401～YL2022404、YL2022501～YL2022503、YL2022601～YL2022604、YL2022701，產(chǎn)地：祈蒙股份有限公司）；蘆?。ㄅ枺?00080-202012，純度：91.6%）、原阿片堿（批號：110853-201805，純度：99.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；黃連堿對照品（批號：F1111AS，純度＞98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙腈（色譜純，瑞典歐森巴克化學(xué)公司）；甲醇、乙酸銨（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸、鹽酸（分析純，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器

Y-2搖擺制粒機(jī)（上海天和制藥機(jī)械有限公司）；SG3300H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；CP225D十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；LC-1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，包括四元泵，VWD可變波長掃描紫外檢測器，Chemstations化學(xué)工作站）。

2 方法與結(jié)果

2.1 角茴香配方顆粒的制備

分別取15批過100目篩的角茴香藥材細(xì)粉各200.0 g，加入適量輔料混合均勻，再加入適量水為潤濕劑，用手不斷揉捏混勻得到“手握成團(tuán)，輕壓即散”狀態(tài)的軟材，通過搖擺制粒機(jī)制粒（14目篩網(wǎng)），收集所得顆粒，60℃下烘干。按照2020年版《中國藥典》四部通則0982雙篩分法整粒（能通過一號篩但不能通過五號篩），包裝，得到15批蒙藥角茴香配方顆粒，均符合制藥企業(yè)生產(chǎn)要求，批號為JHXPFKL-1～JHXPFKL-15。

2.2 色譜條件

采用COSMOSIL 5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈（A）-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，5%～6%A；5～15 min，6%～11.5%A；15～20 min，11.5%A；20～25 min，11.5%～17.5%A；25～30 min，17.5%A；30～35 min，17.5%～ 20%A；35～45 min，20%A；45～50 min，20%～ 25%A；50～55 min，25%A；55～60 min，25%～ 30%A；60～65 min，30%～5%A）；流速1.0 mL·min－1；柱溫28℃；檢測波長300 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.3 供試品溶液的制備

取蒙藥角茴香配方顆粒樣品，研細(xì)，精密稱定0.200 g，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50），超聲提取（100 W，40 kHz）30 min，放至室溫后定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得[10]。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取適量蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品分別置于10 mL量瓶中，用甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）超聲溶解，放至室溫后定容至刻度，分別得到質(zhì)量濃度為0.181、0.366、0.165 mg·mL－1的蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品儲備液。精密移取各儲備液適量于10 mL量瓶中，用甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）稀釋定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為54.28、183.14、16.45 μg·mL－1的混合對照品溶液。其中，蘆丁校正質(zhì)量濃度為49.72 μg·mL－1。

2.5 角茴香配方顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計(jì)算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD值均＜0.79%，相對峰面積RSD值均＜1.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析測定，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計(jì)算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果各共有峰的相對保留時間的RSD值均＜0.82%，相對峰面積的RSD值均＜1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計(jì)算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD值均＜0.91%，相對峰面積的RSD值均＜3.4%，表明角茴香配方顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 指紋圖譜的建立 取15批角茴香配方顆粒（JHXPFKL-1～JHXPFKL-15），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，得到指紋圖譜見圖1。

圖1 角茴香配方顆粒（S1）和混合對照品（S2）指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of hypecoum formula granules（S1）and mixed reference substances（S2）

2.5.5 共有峰標(biāo)記 以原阿片堿作為參考峰，標(biāo)定了18個共有峰，其中11號峰是蘆丁，13號峰是原阿片堿，16號峰是黃連堿，角茴香配方顆粒及混合對照品HPLC指紋圖譜見圖1。以13號峰（原阿片堿）為參照峰，18個共有峰相對保留時間的RSD均＜0.49%，相對峰面積的RSD在2.9%～28.3%。表明不同批次的角茴香配方顆?；瘜W(xué)成分種類相似，但成分含量存在一定差異。

2.5.6 相似度計(jì)算 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》2012版，導(dǎo)入15批角茴香配方顆粒的圖譜數(shù)據(jù)，采用“平均數(shù)”法生成對照圖譜R，經(jīng)多點(diǎn)校正、色譜峰匹配，得到15批角茴香配方顆粒的色譜圖見圖2。以對照圖譜R為參照，15批角茴香配方顆粒的相似度均在0.982以上，相似度見表 1。反映角茴香配方顆?；瘜W(xué)成分組成基本一致，整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，符合指紋圖譜研究要求。

表1 15批角茴香配方顆粒指紋圖譜相似度Tab 1 Fingerprint similarity of 15 batches of hypecoum formula granules

圖2 15批角茴香配方顆粒HPLC疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC overlapp fingerprint of 15 batches of hypecoum formula granules

2.6 角茴香配方顆粒有效成分的含量測定

2.6.1 專屬性考察 取空白溶劑（甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）、混合對照品溶液、角茴香配方顆粒供試品溶液（批號：JHXPFKL-1）適量，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖3。角茴香配方顆粒供試品與蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品在相同保留時間有相同色譜峰且分離度良好，空白溶劑在供試品及對照品色譜峰的保留時間處無干擾，說明該方法專屬性較好。

圖3 空白溶劑（A）、混合對照品溶液（B）、角茴香配方顆粒供試品（C）HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of blank solvent（A），mixed reference substances（B），and sample of hypecoum formula granules（C）

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，逐級稀釋并定容搖勻，得到含蘆?。ò葱Ｕ|(zhì)量濃度記）13.03、16.30、20.36、25.46、31.82、39.77、49.72 μg·mL－1，原阿片堿48.01、60.01、75.01、93.77、117.21、146.51、183.14 μg·mL－1，黃連堿3.45、4.31、5.39、6.74、8.43、10.53、16.45 μg·mL－1系列濃度的混合對照品溶液。依照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定蘆丁、原阿片堿、黃連堿的峰面積。分別以3種對照品的質(zhì)量濃度X（μg·mL－1）和峰面積Y繪制回歸曲線，得回歸方程如表2所示[10]。

表2 各成分線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 2 Linearity of each component

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取同一份角茴香配方顆粒供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），依照“2.2”項(xiàng)下色譜方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄蘆丁、原阿片堿、黃連堿峰面積，結(jié)果RSD值分別為0.49%、0.15%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算蘆丁、原阿片堿、黃連堿平均含量分別為0.15%、0.54%、0.05%，RSD值分別為0.22%、0.56%、0.90%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），分別于第0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，記錄蘆丁、原阿片堿、黃連堿峰面積，結(jié)果RSD值分別為0.72%、0.41%、0.95%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收試驗(yàn)[11]精密稱取6份已知含量的角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1），每份0.100 g。按供試品中指標(biāo)成分量與加入對照品量之比1∶1原則，分別在每份樣品顆粒中加入適量的蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品。按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液進(jìn)樣測定，計(jì)算3種成分的加樣回收率。結(jié)果顯示，蘆丁、原阿片堿、黃連堿的平均加樣回收率分別為101.57%、107.44%、101.44%，RSD值分別為0.78%、0.96%、1.7%，表明該方法回收率良好。

2.6.7 樣品含量測定 取15批角茴香配方顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，分別計(jì)算蘆丁、原阿片堿、黃連堿的含量，結(jié)果見表3。15批角茴香配方顆粒中蘆丁的含量為0.12%～0.23%、原阿片堿的含量為0.50%～0.54%、黃連堿的含量為0.04%～0.05%，表明各批次顆粒間3種成分含量有一定差異，但整體含量較穩(wěn)定。

表3 15批角茴香配方顆粒中3種成分的含量測定結(jié)果Tab 3 Content of 3 chemical ingredients in 15 batches of hypecoum formula granules

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本課題組在前期研究中分別對乙腈-1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%醋酸（三乙胺調(diào)pH 5.0）、甲醇-0.3%三乙胺、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）作為流動相進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）作為流動相時色譜峰較多、分離度較好且基線穩(wěn)定，故選用此流動體系。同時，對不同溫度（25、28、30℃）、不同檢測波長（280、289、300 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）等條件進(jìn)行考察。結(jié)果不同溫度條件下，出峰時間與各峰之間分離度有一定差異，25、30℃條件下存在部分色譜峰峰高不明顯或分離度不夠的情況，故選擇柱溫為28℃。檢測波長為300 nm時，指紋圖譜整體峰高比例較好且溶劑峰影響較小，故選擇檢測波長為300 nm。

3.2 指紋圖譜的建立及含量測定結(jié)果分析

指紋圖譜技術(shù)兼具模糊性、整體性與差異性，可在成分不明確的情況下區(qū)分藥材種屬、反映藥材整體質(zhì)量，適用于成分復(fù)雜或?qū)φ掌凡蛔愕闹兴幖爸兴幹苿┑馁|(zhì)量研究[12]。角茴香作為一種天然藥物，物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，僅采用單一指標(biāo)很難綜合考察其質(zhì)量。因此本研究建立角茴香配方顆粒指紋圖譜，并對其中有效成分含量進(jìn)行測定，更加科學(xué)、全面地考察角茴香配方顆粒的質(zhì)量。

生物堿是角茴香的主要藥效成分，其中的原阿片堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎的藥理作用。黃酮類是角茴香中除生物堿外的另一主要化學(xué)成分，因此，在指認(rèn)原阿片堿、黃連堿的基礎(chǔ)上，增加黃酮類成分蘆丁色譜峰的指認(rèn)，并對3種有效成分進(jìn)行含量測定，可更加完善對蒙藥角茴香配方顆粒的化學(xué)表征。建立的蒙藥材角茴香配方顆粒指紋圖譜及含量測定結(jié)果顯示，制備的15批角茴香配方顆粒質(zhì)量穩(wěn)定，符合質(zhì)量要求，可為后續(xù)角茴香藥材及制劑的質(zhì)量研究提供參考。