蒙藥文冠木配方顆粒指紋圖譜及含量測定研究

劉夢，韓子璇，楊立茹，李佳，程嵐*，張純剛，2，3*（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6620；2.長治醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，山西 長治 046000；3.祈蒙股份有限公司，內(nèi)蒙古 赤峰 024330）

文冠木為無患子科植物文冠（Xanthoceras sorbifoliaBunge.）的干燥莖枝，蒙藥名為“森登”，可分為烏蘭-森登、沙日-森登、蘇木-森登等[1]。文冠木性涼、澀，味甘、微苦，具有祛風(fēng)除濕，消腫止痛，斂干黃水的功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕內(nèi)熱及皮膚濕熱等[2]?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn)文冠木具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保護(hù)血管等作用[3]。文冠木在臨床上的治療范圍涵蓋了巴達(dá)干癥、赫依癥、關(guān)節(jié)炎、各類熱癥、丹毒等病癥，療效顯著，同時也是“森登-4味湯”“文冠木十味湯”“云香十五味丸”的常用藥，擁有悠久的用藥歷史[2]。但目前關(guān)于蒙藥文冠木的藥典介紹及文獻(xiàn)研究都不夠全面，因此，本研究建立指紋圖譜和含量測定的HPLC方法，并對其中14種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定研究，以期為蒙藥材文冠木二次開發(fā)利用及藥典標(biāo)準(zhǔn)的提升提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SHIMADZULC-2010AHT高效液相色譜儀（日本島津公司，包括四元泵、UV紫外檢測器、Lab Solution工作站）；CP225D十萬分之一電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；SG3300H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Y-2搖擺制粒機(jī)（上海天和制藥機(jī)械有限公司）；WGL-230B電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品沒食子酸（批號：110831-201906，純度≥91.5%）、兒茶素（批號：110877-201604，純度≥99.2%）、表兒茶素（批號：110878-201703，純度≥99.2%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG，批號：112072-202101，純度≥98.0%）、鞣花酸（批號：111959-201903，純度≥88.8%）、蘆?。ㄅ枺?00080-202012，純度≥91.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；二氫楊梅素（批號：DSTSDE001201，純度≥98.0%，樂天美醫(yī)藥）；沒食子兒茶素（批號：CRN1039）、表沒食子兒茶素（批號：CRN0842）、二氫槲皮素（批號：CRN0451）、楊梅素（批號：CRN2642）、槲皮苷（批號：CRN0353）、槲皮素（批號：CRN1117）、柚皮素（批號：CRN0343）（純度≥98.0%，湖北萃園生物科技股份有限公司）。乙腈（瑞典歐森巴克化學(xué)公司，色譜純），甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純），磷酸（上海潤捷化學(xué)試劑有限公司），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），文冠木藥材細(xì)粉（批號WGM1～WGM15，祈蒙股份有限公司），經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)康廷國教授鑒定為無患子科植物文冠（Xanthoceras sorbifoliaBunge.）的干燥莖枝。

2 方法與結(jié)果

2.1 蒙藥文冠木配方顆粒的制備

稱取200.00 g文冠木細(xì)粉（過100目），加入適量輔料混合均勻，采用濕法制粒，選擇水作為潤濕劑，將黏度適中、混合均勻的軟材利用搖擺制粒機(jī)（14目篩）制成濕顆粒，后將其置于60℃的烘干箱中干燥，照粒度和粒度分布測定法（通則0928第二法雙篩分法）測定，得到15批文冠木配方顆粒（S1～S15）置于陰涼處備用。

2.2 色譜條件

色譜柱：COSMOSIL 5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）柱；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（1～6 min，10%～13%A；6～11 min，13%A；11～25 min，13%～20%A；25～40 min，20%～40%A；40～50 min，40%A；50～60 min，40%～10%A）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱定對照品適量，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲（100 W，頻率40 kHz，下同）15 min，放冷至室溫，加甲醇定容，配制沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、EGCG、二氫楊梅素、鞣花酸、蘆丁、二氫槲皮素、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、柚皮素校正濃度分別為120.00、157.00、1315.00、320.00、252.00、150.00、186.00、105.00、100.00、100.00、100.00、67.00、150.00、250.00 μg·mL－1的單一對照品儲備液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取15批蒙藥文冠木配方顆粒適量，研細(xì)，精密稱取約0.500 g，置于10 mL量瓶中，精密稱定，加90%甲醇適量，超聲30 min，放冷至室溫，用90%甲醇定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 混合對照品溶液的制備 精密稱取各單一對照品儲備液適量，加甲醇配制為校正質(zhì)量濃度分別為4.80、18.37、153.40、28.67、64.75、6.06、30.00、5.25、3.92、11.57、5.40、7.14、15.00、4.30 μg·mL－1的混合對照品儲備液，于4℃保存，待用。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 參照物峰的選擇 表兒茶素（8號峰）在15批樣品中圖譜中分離度好，穩(wěn)定性較優(yōu)，故選其作為色譜參照物峰，以計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一批文冠木配方顆粒（S1）供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣檢測，計算各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果15批樣品中的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均≤2.0%，表明供試品在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好[4]。

2.4.3 精密度試驗 取同一批文冠木配方顆粒（S1）制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。結(jié)果15批樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均≤1.4%，表明儀器精密度良好[5]。

2.4.4 重復(fù)性試驗 按“2.3.2”項下方法制備6份文冠木配方顆粒（S1），進(jìn)樣檢測，計算得到15批樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均≤1.7%，表明該方法重復(fù)性良好[6]。

2.4.5 指紋峰的指認(rèn) 按“2.3.2”項下方法制備供試品，按“2.2”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖，與混合對照品色譜圖比對保留時間，共指認(rèn)14個共有峰，見圖1。

圖1 文冠木配方顆粒中色譜峰指認(rèn)Fig 1 Chromatographic peak identification of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.4.6 指紋圖譜的建立 制備15批文冠木配方顆粒供試品溶液，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖。利用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）對色譜圖進(jìn)行分析，以S1為參照圖，采用平均數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正后，進(jìn)行Mark峰匹配，系統(tǒng)生成15批配方顆粒的色譜圖和對照圖譜，標(biāo)定21個共有峰，并與混合對照品的色譜圖對比，指認(rèn)14個色譜峰，分別為沒食子酸、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、EGCG、二氫楊梅素、鞣花酸、蘆丁、二氫槲皮素、槲皮苷、楊梅素、槲皮素、柚皮素。15批文冠木配方顆粒指紋圖譜見圖2。

圖2 15批文冠木配方顆粒指紋圖譜Fig 2 Fingerprint of 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5 15批蒙藥文冠木配方顆粒含量測定

2.5.1 專屬性考察 取混合對照品儲備液、90%甲醇（空白溶劑）及供試品溶液適量，進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖見圖3，14個色譜峰峰形良好，無雜峰干擾，表明本方法專屬性較強(qiáng)[7]。

圖3 文冠木配方顆粒指紋圖譜專屬性考察Fig 3 Specific test for fingerprint of Xanthoceras sorbifolia formula particles

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項下單一對照品儲備液，加甲醇定容于10 mL量瓶中，再用甲醇逐級稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，得到校正濃度分別為各對照系列濃度。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，見表1。

表1 回歸方程及線性范圍Tab 1 Regression equation and linearity

2.5.3 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的6份文冠木配方顆粒，按對照品加入量與樣品相應(yīng)成分含量為1∶1的比例精密加入對照品溶液，按“2.3.2”項下方法處理后，進(jìn)樣檢測，計算加樣回收率，結(jié)果14種對照品平均加樣回收率均在99.83%～106.96%，RSD值均≤1.8%[8]。

2.5.4 系統(tǒng)適用性考察 按照上述洗脫條件檢測對照品和供試品溶液，記錄色譜圖，見圖4。結(jié)果顯示14個色譜峰峰形尖銳，對稱性好；與前后峰的分離度均＞1.5，達(dá)到基線分離；理論塔板數(shù)不低于3000[9]。

圖4 系統(tǒng)適用性試驗色譜圖Fig 4 Chromatogram of the system suitability test

2.6 15批文冠木配方顆粒含量測定

精密稱定15批文冠木配方顆粒0.500 g，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計算15批文冠木配方顆粒中14種成分的含量，結(jié)果見表2。

表2 15批文冠木配方顆粒14種成分含量測定結(jié)果(%)Tab 2 Content of 14 components in 15 batches of Xanthoceras sorbifolia formula granules (%)

2.7 化學(xué)模式識別分析

2.7.1 相似度評價 將15批文冠木配方顆粒色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜圖相似度評價系統(tǒng)》（2012年版），選定信號吸收和峰形較優(yōu)、穩(wěn)定性良好的21個色譜峰，系統(tǒng)自動計算生成15批配方顆粒的相似度，結(jié)果相似度均大于0.900，說明蒙藥文冠木配方顆粒的制劑工藝具有良好的穩(wěn)定性，但峰面積大小存在差異，說明各批次間成分存在差異。

2.7.2 聚類分析 將15批文冠木配方顆粒峰面積導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用組間連接的聚類方法，以歐氏距離為測量區(qū)間，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見圖5。15批配方顆粒（S1～S15）分為3類，S1～S5、S10、S7、S12～S13、S15為Ⅰ類，S9、S11、S14為Ⅱ類，S6、S8為Ⅲ類，顆粒間質(zhì)量差異較大，與相似度評價結(jié)果一致。原料藥材的產(chǎn)地、采收期、加工方式等都會影響藥材質(zhì)量，說明僅以一個或多個指標(biāo)成分不能完全評價文冠木配方顆粒的質(zhì)量，需要通過指紋圖譜最大程度地反映整體的特征信息。

圖5 15批文冠木配方顆粒聚類分析圖Fig 5 Cluster analysis of 15 batches of formula granules

3 討論

3.1 試驗條件的考察

考察了流動相系統(tǒng)（乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%醋酸水、乙腈-0.2%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水），柱溫（20、30、40℃），檢測波長（250、270、280、300 nm），流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）對含量測定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.1%磷酸水溶液，流速1.0 mL·min－1，檢測波長270 nm條件下各特征峰響應(yīng)值高，基線平穩(wěn)。比較不同提取溶劑（80%乙醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、100%甲醇），不同料液比（1∶10、1∶12、1∶20、1∶25）和不同提取時間（30、45、60 min）對文冠木配方顆粒的提取效果，結(jié)果確定料液比1∶20，以90%甲醇超聲提取30 min時所測成分的含量及分離情況最佳，雜峰干擾少。

3.2 文冠木配方顆粒指紋圖譜和含量測定結(jié)果分析

15批文冠木配方顆粒的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度較高，均在0.900以上。由指紋圖譜分析可知15批文冠木配方顆粒所含化學(xué)成分種類基本一致，但峰面積大小存在差異，聚類分析與相似度評價均提示各批次間成分含量存在一定差異性。目前市場流通的文冠木來源產(chǎn)地較為分散，地理環(huán)境影響了文冠木內(nèi)代謝產(chǎn)物的生成和積累，并且各省市對藥材驗收的標(biāo)準(zhǔn)和限度各不相同，無法對文冠木進(jìn)行客觀準(zhǔn)確的質(zhì)控，是文冠木質(zhì)量不穩(wěn)定及開發(fā)利用受限的重要原因。

本研究在指紋圖譜中共確認(rèn)21個特征峰，指認(rèn)出14個峰并進(jìn)行含量測定，文冠木中含量最多的是黃酮類化合物，主要為黃酮化合物和二氫黃酮化合物，包括含量較高表沒食子兒茶素、二氫楊梅素、二氫槲皮素、楊梅素等，是文冠木發(fā)揮抗炎、抗氧化、改善心血管系統(tǒng)的指標(biāo)成分[10]；沒食子酸作為有機(jī)酸類化合物也對細(xì)菌、真菌等具有抑制作用；表兒茶素、兒茶素、鞣花酸等多酚類化合物則使文冠木具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化及抗腫瘤等生物活性[11]，同時表兒茶素還具有抗凝血的作用等[12]。因此在指紋圖譜基礎(chǔ)上進(jìn)一步對14種指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定，為文冠木下一步的質(zhì)量評價和藥理活性研究奠定基礎(chǔ)。由于含量測定與指紋圖譜所用色譜條件相同，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗等方法學(xué)考察內(nèi)容在指紋圖譜中已考察且符合要求，因此，含量測定的方法學(xué)考察僅進(jìn)行了線性關(guān)系、專屬性和回收試驗等內(nèi)容。