Nrf2調(diào)控的氧化應激在Adropin抑制低氧肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用研究

陳昌貴，易春峰，王棟，余志華，賀立群（武漢市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022）

持續(xù)性低氧可導致肺血管重構，進而引起肺動脈血管阻力增加，過高的肺動脈阻力會導致肺動脈高壓（PH）形成，長期過高的肺動脈壓力會誘發(fā)患者出現(xiàn)難以控制的右心衰竭而死亡[1]。低氧肺動脈高壓（HPH）是常見的PH類型。低氧導致的肺血管重構是HPH形成的基礎，其病理改變主要表現(xiàn)為肺小動脈中膜及內(nèi)膜增厚、細胞外基質(zhì)沉積、管腔變窄甚至閉塞。氧化應激、炎癥、內(nèi)皮細胞功能障礙、肺動脈平滑肌細胞（PASMCs）過度增殖等促進低氧肺血管重構發(fā)生[2-3]。氧化應激能夠通過促PASMCs過度增殖，導致肺血管重構發(fā)生，在HPH的發(fā)生發(fā)展中起至關重要的作用，通過抗氧化劑抑制氧化應激能夠抑制PASMCs的增殖，從而抑制HPH形成[4-5]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是一種參與氧化應激的關鍵轉錄因子，其在細胞核內(nèi)與抗氧化響應元件結合促進下游抗氧化酶或蛋白的表達，發(fā)揮抗氧化作用[6]。Adropin是一種分泌蛋白，其由量動態(tài)平衡相關基因（Enho）編碼，在人類、大鼠和小鼠中具有相同的氨基酸序列[7]。Adropin與細胞增殖、內(nèi)皮細胞功能、氧化應激、炎癥、能量代謝等密切相關[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)Adropin可抑制主動脈平滑肌細胞（ASMCs）增殖及血管重構[8，11]。另有研究表明Adropin可激活Nrf2，抑制氧化應激，從而抑制非酒精性脂肪肝炎（NASH）[12]。而Adropin對低氧條件下PASMCs增殖及氧化應激的影響未見相關報道，因此本研究觀察Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及氧化應激的影響，并探討其可能的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體重170～190 g [北京維通利華動物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006]。

1.2 儀器

Dmil Led倒置熒光顯微鏡（Leica公司）；3131和311細胞培養(yǎng)箱 （Thermo公司）；Synergy HT多功能酶標儀（Bio-tek公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（BD公司）；Tanon-5200全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能公司）。

1.3 試藥

PBS（批號：P2272）、H2O2（批號：323381）、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC，批號：A0737）、Ⅰ型膠原酶（批號：SCR103）（Sigma公司）；Nrf2激活劑富馬酸二甲酯（DMF，批號：S2586）、Nrf2抑制劑ML385（批號：S8790）（Selleck公司）；重組Adropin（菲尼克斯醫(yī)藥公司）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（批號：CK04，Dojindo）；活性氧（ROS，批號：S0033S）、超氧化物歧化酶（SOD，批號：S0101S）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx，批號：S0058）、過氧化氫酶（CAT，批號：S0051）、丙二醛（MDA，批號：S0131S）等檢測試劑盒以及細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒（批號：P0028）（碧云天生物科技有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號：SH30023）、胰蛋白酶（Trypsin，批號：SH30042）、胎牛血清（批號：SH30070）（Hyclone公司）；細胞周期蛋白（Cyclin）D1（批號：55506）、Cyclin E（批號：20808）、Nrf2（批號：12721）、Lamin B1（批號：13435）、GADPH（批號：5174）等抗體（Cell Signaling Technology）。

2 方法

2.1 SD大鼠PASMCs原代培養(yǎng)

參考本研究課題組之前報道的方法[13]，采用0.2%Ⅰ型膠原酶體外消化分離SD大鼠的PASMCs。用含10%胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)PASMCs，當細胞傳至第3～4代性狀穩(wěn)定后用于本研究。顯微鏡觀察細胞為長梭形，顯“峰-谷”狀生長。通過免疫細胞化學法檢測SM-α-actin鑒定PASMCs純度[13]（本研究細胞純度＞95%）。

2.2 實驗分組

篩選Adropin抑制低氧誘導的PASMCs增殖及氧化應激最適濃度相關實驗分為7組：對照組（PBS）、H2O2干預組（10 μmol·L-1H2O2）、低氧組（PBS＋低氧）、NAC干預組（10 mmol·L-1NAC＋低氧）、Adropin干預組[不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）＋低氧]。

Adropin抑制PASMCs增殖及氧化應激機制相關實驗分為5組：對照組（PBS）、低氧組（PBS＋低氧）、DMF干預組（75 μmol·L-1DMF ＋低氧）、Adropin干預組（1000 nmol·L-1Adropin＋低氧）、Adropin＋ML385干預組（1000 nmol·L-1Adropin＋5 μmol·L-1ML385＋低氧）。各組細胞在給予低氧刺激前用不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化。低氧模擬條件為1% O2、5% CO2和94% N2。常氧模擬條件為含5% CO2的空氣。

2.3 CCK-8檢測細胞增殖

PASMCs以5×103/孔接種于96孔板中，細胞經(jīng)不同干預處理后，每孔加入10 μLCCK-8溶液后37℃繼續(xù)孵育3 h，并設定空白組為對照（100 μLDMEM/F12培養(yǎng)基＋10 μLCCK-8溶液），測定450 nm波長處吸光度（OD值），實驗組細胞的相對增殖率（%）＝[（OD實驗組-OD空白組）/（OD對照組-OD空白組）×100%]，每組重復6次。

2.4 細胞內(nèi)ROS的檢測

通過二乙酰二氯氫化熒光素（DCFH-DA）探針聯(lián)合熒光酶標儀測定細胞內(nèi)ROS水平。細胞接種于24孔板，各組細胞經(jīng)不同干預措施處理后，吸出培養(yǎng)基，加入10 μmol·L-1無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA，37℃孵育20 min之后將培養(yǎng)基吸出，PBS洗滌3次后，置于熒光酶標儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）下檢測ROS水平，每組重復6次。

2.5 試劑盒檢測SOD、GPx、CAT、MDA的水平

細胞接種于6孔板，各組細胞經(jīng)不同干預措施處理后，細胞裂解液或樣品制備液充分裂解細胞后測定SOD、GPx、CAT、MDA的相對水平，通過BCA法測定細胞總蛋白濃度標準化實驗結果，每組重復6次。

2.6 流式細胞儀檢測細胞周期

用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基將PASMCs制作成細胞懸液，以1.5×105/孔接種于6孔板，不同干預處理后，胰酶消化收集細胞，70%乙醇固定后4℃過夜。離心后加入預冷的PBS重懸細胞，再次離心后棄上清液，加入碘化丙啶染色液，37℃避光孵育30 min，后冰浴避光保存，24 h內(nèi)通過流式細胞儀檢測細胞周期，每組重復3次。

2.7 Western blot檢測Nrf2、Cyclin D1和Cyclin E表達

PASMCs以1.5×105/孔接種于60 mm培養(yǎng)皿，各組細胞經(jīng)不同干預處理后，使用細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白；使用細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒提取細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度。將各組細胞蛋白稀釋成相同濃度，取等量蛋白加樣（約15 μg），通過10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉移至硝化纖維素膜中，采用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜后加入一抗（Nrf2、Cyclin D1和Cyclin E的稀釋倍數(shù)為1∶1000，Lamin B1與GAPDH稀釋倍數(shù)1∶2000），4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫下孵育1 h，采用ECL法檢測蛋白的相對表達，通過Tanon GIS軟件處理數(shù)據(jù)，每組重復3次。

2.8 統(tǒng)計學處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差 （±s）表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗；P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產(chǎn)生的影響

ROS激活劑H2O2（10 μmol·L-1）和低氧刺激PASMCs 24 h后，其增殖增強（P＜0.05），抗氧化劑NAC（10 mmol·L-1）及不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）干預24 h后均能夠顯著抑制PASMCs增殖（P＜0.05），且隨著Adropin濃度升高，其抑制細胞增殖作用增強（見圖1A）。H2O2和低氧刺激PASMCs 24 h后，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加，抗氧化劑NAC及不同濃度的Adropin干預24 h后可抑制細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生（P＜0.05），且隨著Adropin濃度升高其抑制ROS產(chǎn)生作用增強（見圖1B），說明Adropin抑制低氧誘導的PASMCs增殖與抑制ROS產(chǎn)生有關。

圖1 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產(chǎn)生的影響（n＝6）Fig 1 Effect of Adropin on the proliferation and ROS production in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

3.2 Adropin對氧化應激的影響

低氧孵育PASMCs 24 h后，細胞核與細胞質(zhì)Nrf2的表達均下調(diào)（P＜0.05），Nrf2激活劑DMF（75 μmol·L-1）及Adropin干預均能促進細胞核及細胞質(zhì)中Nrf2的表達（P＜0.05），Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上調(diào)細胞核及細胞質(zhì)中Nrf2表達的作用（P＜0.05）（見圖2）。低氧孵育PASMCs 24 h后，細胞內(nèi)SOD、GPx和CAT的活性下降，MDA和ROS水平升高（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后，細胞內(nèi)SOD、GPx、CAT活性升高，MDA和ROS水平下降（P＜0.05）；而ML385（5 μmol·L-1）能夠逆轉Adropin抑制氧化應激的作用（P＜0.05）（見圖3）。

圖2 Adropin對低氧誘導的PASMCs中Nrf2表達的影響（n＝3）Fig 2 Effect of Adropin on the expression of Nrf2 in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

圖3 Adropin對低氧誘導的PASMCs中氧化應激的影響（n＝6）Fig 3 Effect of Adropin on the oxidative stress in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

3.3 Adropin對細胞周期的影響

低氧孵育PASMCs 24 h，G0/G1期的PASMCs減少，S期＋G2/M期的比例增多（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后G0/G1期細胞比例增加，S期＋G2/M期細胞比例減少（P＜0.05）；而ML385能夠逆轉Adropin阻滯細胞周期的作用（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 Adropinn對低氧誘導的PASMCs中細胞周期的影響（n＝3）Fig 4 Effect of Adropin on the cell cycle progression in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

3.4 Adropin對Cyclin D1和Cyclin E表達的影響

低氧刺激PASMCs 24 h后，Cyclin D1和Cyclin E的表達上調(diào)（P＜0.05）；DMF及Adropin干預后，Cyclin D1和Cyclin E的表達下調(diào)（P＜0.05）；而ML385能夠逆轉Adropin抑制Cyclin D1和Cyclin E表達的作用（P＜0.05）（見圖5）。

圖5 Adropin對低氧誘導的PASMCs中Cyclin D1和Cyclin E表達的影響（n＝3）Fig 5 Effect of Adropin on the expression of Cyclin D1 and Cyclin E in hypoxia-induced PASMCs（n＝3）

3.5 Adropin對PASMCs增殖的影響

DMF及Adropin干預后能夠抑制低氧誘導的PASMCs增殖，而ML385能夠逆轉Adropin抑制PASMCs增殖的作用（見圖6）。

圖6 Adropin對低氧誘導的PASMCs增殖的影響（n＝6）Fig 6 Effect of Adropin on the proliferation in hypoxia-induced PASMCs（n＝6）

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)H2O2及低氧均能夠誘導PASMCs增殖及ROS生成，不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）及抗氧化劑NAC均可抑制低氧誘導PASMCs的增殖及ROS產(chǎn)生，且Adropin抑制PASMCs增殖及ROS產(chǎn)生的作用具有濃度依賴性。本研究還發(fā)現(xiàn)，Adropin和Nrf2激活劑DMF干預均可通過激活Nrf2上調(diào)PASMCs內(nèi)SOD、GPx和CAT的活性，降低MDA與ROS水平，而Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上述作用。進一步研究表明，DMF和Adropin能夠通過抑制Cyclin D1與Cyclin E的表達，阻滯細胞周期于G0/G1期，從而抑制PASMCs增殖，而ML385能夠逆轉Adropin上述作用。這說明Adropin通過抑制氧化應激，阻滯細胞周期，從而抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。

持續(xù)低氧可誘導PASMCs異常增殖，導致肺血管重構及HPH形成。體外研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的低氧（1%～10%）刺激PASMCs后，其增殖率與氧濃度成負相關[14]，因此本研究采用1% O2誘導PASMCs增殖，建立細胞模型。細胞實驗中發(fā)現(xiàn)Adropin可通過抑制ERK1/2活化抑制人ASMCs的增殖和遷移。動物實驗發(fā)現(xiàn)，向Apoe-/-小鼠腹腔注射Adropin可抑制主動脈粥樣硬化的發(fā)展，并減少斑塊內(nèi)單核細胞/巨噬細胞浸潤和平滑肌細胞數(shù)量，抑制血管重構[8]。研究發(fā)現(xiàn)Adropin與冠心病患者冠狀動脈內(nèi)新生內(nèi)膜面積成負相關，體外培養(yǎng)大鼠ASMCs發(fā)現(xiàn)，Adropin能夠抑制血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的ASMCs增殖[11]。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的Adropin（100、300、1000 nmol·L-1）可抑制低氧誘導的PASMCs增殖，且具有濃度依賴性。

細胞增殖與細胞能否順利通過細胞周期的各個階段密切相關。G1期能否進入S期是決定細胞增殖的關鍵。一旦G1期細胞進入S期，細胞周期可正常進行，且不再受有絲分裂原調(diào)控。本研究表明，低氧能夠誘導PASMCs有絲分裂增強，減少G0/G1期細胞比例，同時增加S＋G2/M期的細胞比例，而Adropin干預后能夠逆轉低氧誘導PASMCs有絲分裂的作用，增加G0/G1期細胞比例，同時減少S＋G2/M期的細胞比例。研究發(fā)現(xiàn)，Adropin能夠通過阻滯細胞周期于G0/G1期，抑制AngⅡ誘導的RASMCs增殖[11]。Cyclin是細胞周期調(diào)控系統(tǒng)的關鍵蛋白。Cyclin E和Cyclin D1與細胞周期蛋白依賴蛋白（CDK）2和CDK4/6結合形成復合物促進G1期細胞進入S期，進而促進有絲分裂[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)Adropin可抑制Cyclin D1和Cyclin E的表達。因此推測，Adropin通過抑制Cyclin D1和Cyclin E的表達，抑制細胞周期進程，從而抑制低氧PASMCs增殖。

大量研究表明，氧化應激在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用。無論是PAH患者，還是野百合堿或低氧誘導的PH動物模型，均發(fā)現(xiàn)氧化應激明顯增加[17]。ROS是參與氧化應激的主要分子之一，包括超氧陰離子（O2-）、羥基（OH-）、H2O2和次氯酸（HOCl）[18]。低氧能夠通過下調(diào)抗氧化相關酶活性（SOD、GPx和SOD等）和上調(diào)NADPH氧化酶 （NOXs）活性，導致PASMCs產(chǎn)生過量的ROS，從而誘導氧化應激[19]。ROS是重要的細胞內(nèi)信號分子，低水平ROS對維持細胞正常生理功能極為重要，病理條件下可使ROS的生成增強，誘導細胞增殖、凋亡抵抗。氧化應激能夠通過促進炎癥反應，損傷內(nèi)皮細胞，促進PASMCs異常增殖，導致低氧肺血管重構發(fā)生，從而誘導HPH發(fā)生發(fā)展，通過抗氧化劑降低ROS水平后可抑制PASMCs增殖以及HPH形成[19-20]。此外，ROS可通過活化細胞內(nèi)信號通路如ERK1/2和P38，促進PASMCs增殖[21-22]。SOD可將超氧化自由基分解為H2O2，GPx可以催化GSH與H2O2或其他有機過氧化物的反應，生成氧化型谷胱甘肽和H2O，CAT是H2O2酶，能夠催化H2O2產(chǎn)生H2O與O2[18]。SOD缺乏時，PASMCs增殖增強，恢復SOD活性能夠減輕肺動脈重塑[23-24]。氧化應激時能導致細胞脂質(zhì)過氧化，而MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其與氧化應激相關，PAH患者血清中MDA水平升高[25]。低氧能夠誘導PASMCs內(nèi)SOD、GPx和CAT活性下降，ROS和MDA水平升高，促進氧化應激，而通過藥物抑制氧化應激能夠抑制低氧誘導的PASMCs增殖[24，26]。本研究發(fā)現(xiàn)ROS激活劑H2O2及低氧均能夠促進PASMCs的增殖及ROS生成，不同濃度的Adropin及抗氧化劑NAC均可抑制低氧誘導的PASMCs增殖及ROS產(chǎn)生，且Adropin抑制PASMCs增殖及ROS產(chǎn)生的作用具有濃度依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn)Adropin能夠增強SOD、GPx和CAT活性，降低MDA水平。有研究表明Adropin可減輕棕櫚酸誘導肝細胞和庫普弗細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，從而抑制NASH[10]。在糖尿病腎病小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)Adropin可抑制腎臟的氧化應激，改善腎功能[27]。在NASH小鼠模型中研究發(fā)現(xiàn)，敲除Adropin顯著加劇了肝臟脂肪變性及氧化應激，而腹腔注射外源性Adropin可減輕肝細胞的氧化應激，抑制NASH的進展[12]。

Nfr2是參與氧化應激的關鍵轉錄因子。Keap1是Nrf2的抑制劑，在Nrf2活性的調(diào)節(jié)中起著關鍵作用。在細胞質(zhì)內(nèi)Nrf2與Keap1蛋白結合，活性受到抑制，并被降解。當Nrf2與Keap1解離后會進入細胞核，與抗氧化響應元件結合促進SOD、GPx和CAT等抗氧化蛋白的表達[6]。缺氧誘導PASMC內(nèi)ROS產(chǎn)生，而ROS能夠抑制Keap1與Nrf2在細胞質(zhì)內(nèi)解離，從而抑制Nrf2的激活[26，28]。使用siRNA敲除Nrf能顯著促進PASMCs內(nèi)ROS的產(chǎn)生，誘導PASMCs增殖[29]。在低氧誘導的PASMCs氧化應激模型中發(fā)現(xiàn)，Nrf2特異性抑制ML385能夠抑制SOD、GPx和CAT活性，促進MDA及ROS產(chǎn)生[26]。在NASH模型研究中發(fā)現(xiàn)，Adropin可通過激活Nrf2，抑制氧化應激[12]。本研究發(fā)現(xiàn)Adropin或Nrf2激活劑DMF干預能夠通過激活Nrf2，增強SOD、GPx和CAT活性，抑制氧化應激，并抑制Cyclin D1與Cyclin E的表達，進而阻滯細胞周期，抑制低氧條件下PASMCs的增殖，而Nrf2抑制劑ML385能夠逆轉Adropin上述作用。這說明Adropin可通過抑制氧化應激，抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)Adropin可通過抑制氧化應激抑制低氧誘導的PASMCs增殖，其機制可能與激活Nrf2有關。Adropin可能是治療和預防低氧肺血管重構新的藥物。本研究單從細胞水平探討Adropin對低氧肺血管重構的影響，下一步將在動物實驗中驗證Adropin對低氧誘導的HPH大鼠肺血管重構的影響，在動物水平探討Adropin對低氧肺血管重構及氧化應激的影響。