基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法探析厚樸三物湯治療便秘的機制研究

康蕾，梁磊，洪關(guān)婷，王一瓊，莘莉瓊，楊勇軍

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肛腸科，四川 南充 637000

便秘是常見的胃腸道疾病，主要臨床表現(xiàn)為大便干燥、排便時間延長、排便次數(shù)減少[1]，在中醫(yī)學(xué)屬“便秘”范疇。當今社會，隨著社會人口老齡化、生活習慣改變、生活壓力增大等各類因素，便秘發(fā)生率呈逐年上升的趨勢。研究表明，便秘對多種疾病的發(fā)生也有直接影響，如帕金森病、多種肛周疾病、乳腺疾病、冠心病等。西醫(yī)對便秘的治療主要以各類瀉劑為主，但療效欠佳，所以結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)及生物信息學(xué)探索更多中藥治療便秘的有效途徑是必要的。

《金匱要略》中首次記載厚樸三物湯，述其由大黃、枳實、厚樸3 味藥組成，厚樸為君，主氣，大黃為臣主瀉，枳實為佐藥主滯。該方立于“通”重在“行氣”，具有行氣導(dǎo)滯通便之功[2]。其方中重用厚樸，極大加強了該方行氣的功效。尤善治療實熱內(nèi)積，氣滯不行，氣滯重于實積之便秘。根據(jù)現(xiàn)有研究表明，其方中含有蘆薈大黃素、厚樸酚等成分，具有明顯的肌松弛、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、抗菌作用[3]，可增強胃腸蠕動、改善便秘。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過各數(shù)據(jù)庫、運用網(wǎng)絡(luò)技術(shù)構(gòu)建“藥物成分–靶點–信號通路–疾病”相互作用關(guān)系的方法，在對分析各類藥物作用發(fā)生機制的過程中有著重要意義。分子對接是一種用于藥物研究的方法，能夠識別具有治療意義的新化合物，并在分子水平上預(yù)測配體–靶點相互作用關(guān)系[4]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，篩選及分析厚樸三物湯治療便秘的有效成分及作用靶點，為臨床基礎(chǔ)研究以及中藥新藥的研發(fā)提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 厚樸三物湯有效化合物成分及相關(guān)靶點篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，檢索并獲得厚樸三物湯中大黃、枳實、厚樸3 味中藥的有效化合物及對應(yīng)的靶點，篩選后在Uiprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）中將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點轉(zhuǎn)化成規(guī)范的基因標識符。

1.2 便秘相關(guān)靶點篩選

以“constipation”為檢索詞，在 OMIM、GeneCards、PharmGKB、TTD、DrugBank 數(shù)據(jù)庫中查找有關(guān)便秘的相關(guān)靶點，在各數(shù)據(jù)庫獲取的數(shù)據(jù)再通過R 語言的“Venn”軟件包，去重后取交集并繪制韋恩圖。

1.3 厚樸三物湯成分與靶點的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將篩選的厚樸三物湯的有效成分及疾病關(guān)鍵靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建厚樸三物湯有效成分與靶點的可視化圖，運用插CytoNCAA 分析視圖的特征，設(shè)置節(jié)點值和自由度參數(shù)，以方便準確的觀察復(fù)方中主要有效成分。將1.2 項下獲得的便秘靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“人”模式，蛋白屬設(shè)為“home sapiens”，highest confidence＝0.95，其他參數(shù)不變，獲取蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。利用CytoNCA 進行拓撲分析，篩選其核心靶點。

1.4 關(guān)鍵靶點的基因本體（GO）及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用生物信息軟件包“ org.Hs.eg.db ”“enrichplot”“clusterProfiler”等數(shù)據(jù)包對厚樸三物湯有效成分和關(guān)鍵靶點進行GO 功富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值。以對GO 生物學(xué)過程中的生物過程（BP）、細胞成分（CC）、分子功能（MF）富集最高的前10 條繪制成條形圖。將KEGG 通路富集程度最高的前20 條繪制成高級氣泡圖。

1.5 分子對接驗證

在Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找關(guān)鍵靶點的2D 結(jié)構(gòu)，再通過ChemOffice 軟件進行轉(zhuǎn)化成3D 結(jié)構(gòu)。在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中檢索疾病關(guān)鍵靶點基因，找到對應(yīng)蛋白ID，在PDB（http://www.rcsb.org/）中下載關(guān)鍵靶點蛋白受體的3D 結(jié)構(gòu)，再利用Pymol、AutoDockTools 軟件進行對其進行去除水分子、原有配體和受體及分子的處理，進行加氫的處理后確定活性口袋。再運行Vina 對分子與靶點的最低結(jié)合能進行分析驗證，最后利用Pymol 軟件轉(zhuǎn)化成可視化圖。

2 結(jié)果

2.1 厚樸三物湯有效活性成分及對應(yīng)靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為篩選條件，獲得厚樸三物湯有效活性成分，符合篩選條件的有效成分共39 個，其中大黃16 個，厚樸2 個，枳實21 個，見表1?；钚猿煞謱?yīng)靶點139 個。

表1 厚樸三物湯有效成分Table 1 Effective components of Houpu Sanwu Decoction

2.2 厚樸三物湯治療便秘的潛在靶點

從在GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank 5 個數(shù)據(jù)庫中，獲取便秘的靶點分別為5 298、361、357、11、84 個，去掉重復(fù)化合物后后取并集，還剩余1 585 個，見圖1。將厚樸三物湯主要有效成分的作用靶點與疾病的靶點數(shù)據(jù)取交集，最終獲得厚樸三物湯作用于便秘的潛在靶點對應(yīng)57 個，有效成分26 個，以韋恩圖的形式展現(xiàn)交集靶點，見圖2。

圖1 便秘相關(guān)靶點Fig.1 Targets associated with constipation

圖2 厚樸三物湯治療便秘作用靶點Fig.2 Target of Houpu Sanwu Decoction in treatment of constipation

2.3 成分–靶點網(wǎng)絡(luò)分析

在Cytoscape 數(shù)據(jù)庫中，將26 個與便秘相關(guān)的有效成分、57 條相關(guān)基因?qū)霕?gòu)建活性成分–靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3?？梢娡粋€疾病靶點可與不同的活性成分相對應(yīng)，不同的靶點也可對應(yīng)相同的活性成分，厚樸三物治療便秘具有多個靶點、多種成分特點。

圖3 活性成分–靶點圖Fig.3 Active ingredients–target plot

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析與核心靶點篩選

將厚樸三物湯主要有效成分作用靶點與便秘疾病靶點取交集所獲得的57 個靶點導(dǎo)入數(shù)String據(jù)庫，選擇最低互助評分為0.9，去除游離點，得到55 個節(jié)點和1 334 條邊，見圖4。將String 數(shù)據(jù)庫中得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用CytoNCA 進行篩選及可視化處理，如圖5 所示，其連接點數(shù)目較高的靶點基因有白細胞介素（IL）-1B、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3、細胞周期素D1（CCND1）、腫瘤蛋白P53（TP53）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶體增殖物激活受體G（PPARG）、表皮生長因子受體（EGFR）、胞間黏附分子-1（ICAM1）、MAPK14、原癌基因（MYC）、血紅素加氧酶1（HMOX1）、雌激素受體1（ESR1）、前列腺素內(nèi)過氧化物酶2（PTGS2）、MAPK8、蛋白激酶B1（Akt1）、MAPK1、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2），這些靶點是厚樸三物湯治療便秘的關(guān)鍵靶點。

圖4 厚樸三物湯蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Protein PPI network of Houpo Sanwu Decoction

圖5 核心靶點基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Core target gene network

2.5 關(guān)鍵靶點的GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

將20 個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入利用DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 富集分析和KEGG 通路分析，以P＜0.05 為閾值篩選，得出BP 包含對營養(yǎng)素水平的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)、對氧氣水平的反應(yīng)、對紫外線的反應(yīng)、對藥物的反應(yīng)等2 008 條，CC 包含隔膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔、核封裝等67 個，MF 主要涉及磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合蛋白、核受體活動、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、泛素蛋白連接酶結(jié)合等123 條。分別取富集最顯著的前10 條經(jīng)行可視化分析，見圖6。對KEGG 通路進行篩選，以P＜0.05 為篩選條件，得到153 條信號通路，厚樸三物湯治療便秘涉及的主要有內(nèi)分泌抗藥性、人巨細胞病毒感染、膀胱癌、直腸癌、卡波西肉瘤、皰疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小細胞肺癌等信號通路。根據(jù)靶點數(shù)目及P值取前富集顯著的前30 條進行可視化，見圖7。

圖7 KEGG 富集分析圖Fig.7 KEGG enrichment analysis

2.6 分子對接

將自由度較高的的活性成分蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素與2.4 項下篩選的核心基因IL-1B、VEGFA、MAPK3 進行分子對接，并利用pymol 軟件進行可視化分析，見圖8、表2。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素與各核心靶點基因有較好的結(jié)合活性，提示蘆薈大黃素與上述靶點相互作用較大可能為厚樸三物湯治療便秘的重要機制，值得做進一步的實驗驗證。

圖8 分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking model diagram

表2 厚樸三物湯治療便秘核心有效成分與靶點結(jié)合能Table 2 Houpu Sanwu Decoction for treating constipation core active ingredient and target binding energy

3 討論

厚樸三物湯為治療便秘的有效方，具有通便瀉熱，消滯除滿功效。中醫(yī)認為便秘不僅與自身體質(zhì)有關(guān)，還與環(huán)境、飲食等外在因素有關(guān)。氣血虧虛虛、脾腎陽虛、陰血虧虛等為便秘的常見病機，其病位在大腸，且涉及肺、脾、腎等臟腑[5]。據(jù)歷代醫(yī)家總結(jié)及現(xiàn)代臨床實踐表明，厚樸三物湯主要對氣滯型便秘療效顯著，但治療機制至多為尚未清楚。故本研究通過各中藥數(shù)據(jù)庫，對藥物的有效成分、疾病的靶點經(jīng)行查找分析，以發(fā)現(xiàn)成分于靶點相互關(guān)系，為厚樸三物湯治療便秘使用提供理論依據(jù)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)篩選，得到厚樸三物湯的有57個活性成分，其中關(guān)鍵成分為蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素。研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈大黃素可能是通過增加肌間的神經(jīng)叢P 物質(zhì)（SP）、血管活性腸肽（VIP）的含量，以進一步增強腸道動力來緩解便秘[6]；Zheng 等[7]報道，蘆薈大黃素也可以通過上調(diào)便秘小鼠腸組織中水通道蛋白3（AQP3）表達來改善胃腸蠕動而促進排便。木犀草素屬天然黃酮類化合物，經(jīng)研究其可以通過L 型鈣離子通道來調(diào)節(jié)腸道平滑肌運動，也能夠通過降低平滑肌細胞的Akt 磷酸化水平，抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 通路激活，起到抑制平滑肌增殖的作用以達到治療便秘的作用[8]。柚皮素可調(diào)節(jié)血清中胃腸代謝相關(guān)成分的產(chǎn)生。研究顯示柚皮素緩便秘癥狀的機制可能與上調(diào)lop 誘導(dǎo)便秘小鼠的Cajal 間質(zhì)細胞和AQP3的表達增加相關(guān)[9]。因此蘆薈大黃素、木犀草素、柚皮素極大可能為治療便秘的關(guān)鍵有效成分，為臨床新藥的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示，厚樸三物湯中有效化合物成分可能是通過IL-1B、VEGFA、MAPK3 等關(guān)鍵靶點起作用，IL-1B 可以顯著增加腸上皮細胞中抗菌肽的表達，降低腸道炎癥致病菌的存活率，減輕炎癥對腸道環(huán)境的干擾[10]。MAPK3 是MAPK 家族成員。在便秘模型大鼠結(jié)腸組織中，通過阻斷MAPK信號通路，可以下調(diào)APQ3、APQ4 的表達，有效減少腸道對水分重新吸收，減少便秘的發(fā)生[11]。

VEGFA 可促進新生血管形成，厚樸三物湯中的有效成分可能通過調(diào)節(jié)VEGFA 水平，以改善腸神經(jīng)營養(yǎng)支持，促進腸道蠕動，以進一步緩解便秘。通過KEGG 富集分析可知，以上關(guān)鍵靶點作用于便秘有多條通路途徑，主要包括內(nèi)分泌抗藥性、人巨細胞病毒感染、膀胱癌、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、IL-17、丙型肝炎、小細胞肺癌等信號通路。進一步說明厚樸三物湯治療便秘很可能是通過免疫抑制、抗炎作用、抗病毒、抗腫瘤等多種方式發(fā)揮作用。通過分子對接將厚樸三物湯有效成分與關(guān)鍵靶點進行對接，結(jié)果顯示二者能穩(wěn)定結(jié)合，進一步說明厚樸三物湯有效成分能在體內(nèi)穩(wěn)定的發(fā)揮治療作用。本研究表明，厚樸三物湯治療便秘具有多成分、多靶點、多通路的特點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突