生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究千層紙素A 抗宮頸癌的效應(yīng)及其作用機(jī)制

王玨

宿遷市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，江蘇 宿遷 223800

宮頸癌是一種始發(fā)于宮頸細(xì)胞的癌癥，但其通常會隨著時(shí)間的推移而緩慢發(fā)展[1]。發(fā)育異常的子宮頸細(xì)胞首先出現(xiàn)在子宮頸組織中，隨著時(shí)間的推移，如果不進(jìn)行干預(yù)或清除，異常細(xì)胞可能會變成癌細(xì)胞，并開始生長和擴(kuò)散到更深的子宮頸和周圍組織[2]。在目前的研究表明，宮頸癌多由高風(fēng)險(xiǎn)類型的人類乳頭瘤病毒（HPV）誘發(fā)，其中HPV16、HPV18 占到了70%[3]。定期接受宮頸癌篩查和接種HPV 疫苗被認(rèn)為是預(yù)防宮頸癌發(fā)生的有效手段[4]，但目前這2 種手段在我國的普及率較低[5]。目前治療宮頸癌的常規(guī)手段為手術(shù)治療、化療、放射療法及靶向治療[6-7]。千層紙素A 是一種從黃芩根皮中所提取的活性成分，多項(xiàng)研究表明千層紙素A 具有抗腫瘤、抗炎、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種藥理作用[8-10]。

SHC SH2 結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白1（SHCBP1）是細(xì)胞表面受體的重要蛋白[11]，它將激活的生長因子受體偶聯(lián)到表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細(xì)胞生長因子受體（FGFR）和胰島素受體等相關(guān)信號通路[12]。SHCBP1 在多種癌癥中如肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，目前有研究表明SHCBP1 的表達(dá)還與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）和免疫抑制基因（TGFBR1、PD-L1、TGFB1 等）呈正相關(guān)[13-15]，表明SHCBP1 與腫瘤免疫有著密切的關(guān)系。

目前對于千層紙素A 抗腫瘤作用研究得到了重點(diǎn)關(guān)注，但其作用的機(jī)制仍有待研究。本研究通過MTT 比色法證實(shí)了千層紙素A 可以抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖，并基于前期研究的基礎(chǔ)，通過Western blotting 實(shí)驗(yàn)分析千層紙素A 與SHCBP1 之間的關(guān)系。此外，對千層紙素A 與SHCBP1 進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分子對接，分析結(jié)合效能。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HeLa 細(xì)胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司；千層紙素A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，貨號480-11-5）購自成都普思生物科技股份有限公司；SHCBP1 抗體（貨號12672-1-AP）購自美國Proteintech 公司；DMSO（貨號ST038）、MTT 毒性檢測試劑盒（貨號C00098）、PBS（貨號C0221A）購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司；DMEM 培養(yǎng)基（貨號6122692）購自美國Gibco 公司；胎牛血清（貨號11011-8611）購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

超精密天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、多功能微孔板檢測儀（美國伯騰儀器有限公司）、雙紅外激光色成像儀（美國LI-COR 公司）；電泳儀（美國BIO-BAD 公司）。

1.2 數(shù)據(jù)集的研究

通過GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫檢索人宮頸癌相關(guān)數(shù)據(jù)集，最終選定GSE9750、GSE63678、GSE29570和人宮頸癌TCGA 數(shù)據(jù)（TCGA-CESC）作為研究數(shù)據(jù)集，其中對GSE63678 中非宮頸癌樣本進(jìn)行刪除。通過R 語言分別對GSE9750、GSE63678、GSE29570 進(jìn)行整理獲得基因表達(dá)矩陣，運(yùn)用生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)分析盒子（Sangerbox）[16]中COMBAT 法對3 個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行去批次效應(yīng)處理，獲得可進(jìn)行比較的3 個(gè)數(shù)據(jù)集基因表達(dá)矩陣集合，之后在基因表達(dá)矩陣中分析SHCBP1的表達(dá)量。同時(shí)，通過GEPIA 2 平臺（http://gepia2.cancer-pku.cn）[17]對TCGA 數(shù)據(jù)庫中TCGA-CESC 進(jìn)行研究，分析SHCBP1 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)；使用R 語言中IOBR 包在3 個(gè)GEO 數(shù)據(jù)集中，對22 種免疫細(xì)胞進(jìn)行Cibersort法分析。采用TISIDB 數(shù)據(jù)庫（http://cis.hku.hk/TISIDB）[18]分析SHCBP1 與免疫檢查點(diǎn)的聯(lián)系。

1.3 分子對接

分別在AlphaFoldDB 和TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索SHCBP1 和千層紙素A 的PDB 格式與MOL2 格式文件，Pymol 對小分子與蛋白進(jìn)行脫水等處理，后導(dǎo)入Autodock 軟件中進(jìn)行分子模擬對接，將勢能最低的一個(gè)結(jié)果使用Pymol 進(jìn)行可視化輸出。

1.4 MTT 實(shí)驗(yàn)

1.4.1 含藥培養(yǎng)基配制 用精密天平精準(zhǔn)稱定2 mg千層紙素A，根據(jù)相對分子質(zhì)量加入相應(yīng)體積的DMSO 溶液配制成60 mmol/L 儲備液，通過稀釋法配制濃度為10、20、30 mmol/L 的含藥母液。

1.4.2 培養(yǎng)細(xì)胞 HeLa 細(xì)胞在含有5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)傳代后，以每孔1×104個(gè)接種入96 孔板中，每組副孔6 個(gè)，培養(yǎng)至70%～80%的密度。

1.4.3 加藥 取3 個(gè)5 mL 離心管，分別加入2 mL培養(yǎng)基，取2 μL 濃度為10、20、30 mmol/L 的含藥母液分別加入含培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，即為10、20、30 μmol/L 含藥培養(yǎng)基，另取一對照管加入相應(yīng)體積的DMSO。吸干原96 孔板中培養(yǎng)基，加入200 μL含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4.4 收樣 加入10 mL MTT 溶液（5 mg/mL）培養(yǎng)4 h，棄掉原培養(yǎng)基加入200 μL DMSO 溶液，充分溶解甲臜40 min 后490 nm 處測吸光度（A）值。

1.5 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)

HeLa 細(xì)胞在10、20、30 mmol/L 含藥培養(yǎng)基下培養(yǎng)24 h，對照組培養(yǎng)基加入相應(yīng)體積DMSO 同步培養(yǎng)，用含有1%的蛋白酶抑制劑（PMSF）的NP40裂解緩沖液提取HeLa 細(xì)胞的蛋白。采用BCA 法測定蛋白濃度。以30 μg 的蛋白量加入10%的膠中，100 V 條件下分離，在240 mA 下轉(zhuǎn)印90 min，經(jīng)封閉、洗膜、敷抗體等步驟后顯影。

1.6 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

通過Linkedomics[19]（http://www.linkedomics.org）獲取SHCBP1 共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)，并以熱圖的形式進(jìn)行可視化。并通過基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）進(jìn)一步分析SHCBP1 的生物學(xué)功能。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用R4.3.1 和GraphPad Prism 8 進(jìn)行分析。使用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)分析SHCBP1 的表達(dá)情況；使用斯皮爾曼的相關(guān)性分析來評估相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 SHCBP1 在宮頸癌中的表達(dá)情況

由于GEO 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)通常來自不同的實(shí)驗(yàn)室、不同的實(shí)驗(yàn)平臺和不同的時(shí)間點(diǎn)，因此存在很大的差異性。為了消除這些非生物學(xué)的技術(shù)性差異，需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，同時(shí)對于不同批次的GEO 數(shù)據(jù)還要進(jìn)行去批次效應(yīng)處理，使得各組數(shù)據(jù)具有可比性。首先對GSE9750、GSE63678、GSE29570 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和COMBAT 去批次，處理后的數(shù)據(jù)集中138 組數(shù)據(jù)（宮頸癌患者92 組，健康人46 組）幾乎在同一水平線上，均一性好，該組數(shù)據(jù)集的芯片數(shù)據(jù)可靠，可進(jìn)行后續(xù)分析。經(jīng)過線性模型擬合、貝葉斯檢驗(yàn)，獲得差異表達(dá)基因（DEGs），使用ggplot2 和cowplot 包繪制火山圖（圖1-A）。使用ggpubr 對SHCBP1 在GSE9750、GSE63678、GSE29570 合集中的表達(dá)進(jìn)行可視化（圖1-B），結(jié)果顯示，相較于健康受試者，宮頸癌患者的SHCBP1 顯著上升（P＜0.001）；同時(shí)對TCGA數(shù)據(jù)庫中307 例樣本（宮頸癌患者304 組，健康受試者3 組）的分析中，也顯示出相同的結(jié)果（P＜0.001）。

圖1 宮頸癌中SHCBP1 的表達(dá)情況Fig.1 Expression of SHCBP1 in cervical cancer

2.2 千層紙素A 對HeLa 細(xì)胞增殖和SHCBP1 蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，千層紙素A 在10 μmol/L 時(shí)即可對HeLa 細(xì)胞顯示出抑制作用；且各濃度千層紙素A 均可抑制SHCBP1 蛋白的表達(dá)（P＜0.05、0.001），見圖2、3。

圖2 千層紙素A 對HeLa 細(xì)胞增殖的影響（，n=6）Fig.2 Effect of oroxylin A on proliferation of HeLa cells(,n=6)

圖3 千層紙素A 對SHCBP1 蛋白表達(dá)的影響（，n=3）Fig.3 Effect of oroxylin A on the expression of SHCBP1 protein (,n=3)

2.3 千層紙素A 與SHCBP1 結(jié)合能分析

千層紙素A 與SHCBP1 的VAL-109、THR-191、VAL-187、GLN-190 存在氫鍵作用（圖4），其結(jié)合自由能為?7.3 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），該結(jié)果顯示千層紙素A 與SHCBP1 蛋白可以在自然情況下進(jìn)行結(jié)合，且對接結(jié)果良好。分子對接結(jié)果顯示，千層紙素A 與SHCBP1 有較穩(wěn)定的相互作用，進(jìn)一步說明SHCBP1 蛋白可能為千層紙素A 抗宮頸癌的潛在重要作用靶點(diǎn)。

圖4 千層紙素A 與SHCBP1 分子對接Fig.4 Molecular docking of oroxylin A with SHCBP1

2.4 SHCBP1 在CESC 中的生物學(xué)功能

為了進(jìn)一步評估SHCBP1 在CESC 中的生物學(xué)功能，本研究通過Linkedomics 分析了SHCBP1 在CESC 中的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，共得到與SHCBP1 正相關(guān)基因453 個(gè)，SHCBP1 負(fù)相關(guān)基因387 個(gè)。將前50個(gè)的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因以熱圖形式進(jìn)行展示（圖5）。隨后對SHCBP1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO 與KEGG 分析（圖6），其中分子功能（MF）涉及激酶活性（kinase activity）、激酶結(jié)合（kinase binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等；生物功能（BP）涉及細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)（cellular response to cytokine stimulus）、蛋白磷酸化反應(yīng)（protein phosphorylation）、磷酸化的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of phosphorylation）等；細(xì)胞組成（CC）涉及囊泡腔（vesicle lumen）、受體復(fù)合物（receptor complex）、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）等。KEGG 結(jié)果顯示，SHCBP1 及共表達(dá)基因富集在TNF 信號通路（TNF signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）等。

圖5 SHCBP1 在CESC 中排名前50 個(gè)的正相關(guān)（A）和負(fù)相關(guān)（B）基因熱圖Fig.5 Heat map of the top 50 positively (A) and negative (B) correlated genes ranked by SHCBP1 in CESC

圖6 SHCBP1 在CESC 中的GO（A）和KEGG（B）富集分析Fig.6 GO (A) and KEGG (B) analysis of SHCBP1 in CESC

2.5 SHCBP1 在CESC 免疫浸潤和免疫檢查點(diǎn)中的作用

腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TILs）可通過直接或間接作用參與腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展，是影響CESC 在內(nèi)的各種癌癥發(fā)展的獨(dú)立因素。本研究通過CIBERSORT 算法計(jì)算了GSE9750、GSE63678、GSE29570 中22 種免疫細(xì)胞的比例（圖7-A），發(fā)現(xiàn)活化的樹突狀細(xì)胞、靜息的樹突狀細(xì)胞、M0 型巨噬細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞的水平在CESC 中改變（圖7-B），表明免疫細(xì)胞在宮頸癌的發(fā)生中起到重要作用。此外，將數(shù)據(jù)集集合分為SHCBP1 高、低表達(dá)組，在SHCBP1 高表達(dá)組中活化的樹突狀細(xì)胞、M0 型巨噬細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、活化的CD4+T記憶細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞比例上調(diào)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息CD4+T 記憶細(xì)胞比例下調(diào)（圖7-C）。通過TISID 數(shù)據(jù)庫對SHCBP1與CESC 免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性分析得出，SHCBP1 與RAET1E、TGFB1、TGFBR1 表現(xiàn)出正相關(guān)，與TNFRSF14、LGALS9、VTCN1、CXCR4、HHLA2表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，SHCBP1 可能參與了CESC 免疫的調(diào)控，見圖8。

圖7 GEO 數(shù)據(jù)集中免疫細(xì)胞比例（A）、免疫細(xì)胞浸潤情況（B）和免疫細(xì)胞表達(dá)差異（C）Fig.7 Proportion of immune cells (A),infiltration of immune cells (B),and differences in immune cell expression (C) in GEO data sets

圖8 SHCBP1 與CESC 中的免疫檢查點(diǎn)之間的關(guān)系Fig.8 Relationship between SHCBP1 and immune checkpoints in CESC

3 討論

從中藥中分離和鑒定具有抗癌活性的化合物，成為宮頸癌的治療的一種新的研究思路[20-21]。千層紙素A 作為一種從黃芩中提取到的活性化合物，在皮膚癌、乳腺癌、肺癌、肝癌中有顯著抑制作用[8]，但在宮頸癌中的研究缺失。本研究表明，千層紙素A 可以濃度相關(guān)性地抑制Hela 細(xì)胞的增殖。此外基于前期的研究基礎(chǔ)，本研究對千層紙素A 是否調(diào)控SHCBP1 開展了進(jìn)一步的研究。通過對GEO 及TCGA 數(shù)據(jù)集的研究，發(fā)現(xiàn)SHCBP1 在宮頸癌中是顯著高表達(dá)的，之后為了驗(yàn)證實(shí)千層紙素A 是否能夠抑制SHCBP1 這一猜想，進(jìn)行了Western blotting實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也顯示，10 μmol/L 千層紙素A 即顯示出對SHCBP1 的抑制作用。此外，為了更好的評估千層紙素A 與靶點(diǎn)SHCBP1 之間的結(jié)合效能，分子對接結(jié)果表明千層紙素A 與SHCBP1 在多個(gè)位點(diǎn)形成氫鍵，結(jié)合能為?7.3 kcal/mol，表明SHCBP1 可能是千層紙素A 的重要的潛在作用靶點(diǎn)。為深入探究SHCBP1 作為治療靶點(diǎn)的作用機(jī)制，首先對其在宮頸癌中的生物學(xué)功能開展分析，通過對SHCBP1共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的分析獲知SHCBP1及其共表達(dá)基因參與了TNF、HIF-1、IL-17 等多個(gè)信號通路，而TNF、HIF-1 和IL-17 信號通路均參與宮頸癌炎癥的發(fā)生，表明SHCBP1 可能參與調(diào)節(jié)宮頸癌的炎癥反應(yīng)。在多個(gè)研究中，千層紙素A 在腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗炎作用[14]，因此推斷其抗炎機(jī)制可能與抑制SHCBP1 有關(guān)。

美國食品藥品管理局批準(zhǔn)帕博利珠單抗聯(lián)合伴或不伴貝伐珠單抗的化療用于一線治療證實(shí)為腫瘤表達(dá)PD-L1 的持續(xù)性、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者[22]。這是首個(gè)被批準(zhǔn)用于這些患者一線治療的抗PD-1 組合療法，展示了免疫檢查點(diǎn)抑制劑在治療CESC 中的重要作用。本研究中，SHCBP1 與RAET1E、TGFB1、TNFRSF14、CXCR4 等多個(gè)免疫檢查點(diǎn)相關(guān)，這些免疫檢查點(diǎn)蛋白參與了人體先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，在機(jī)體中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[23-25]。免疫細(xì)胞浸潤與腫瘤炎癥反應(yīng)息息相關(guān)，通過對22 種免疫細(xì)胞的分析，也獲悉多種免疫細(xì)胞與SHCBP1 的表達(dá)相關(guān)，其中與SHCBP1 顯著正相關(guān)的巨噬細(xì)胞，主要分為M0 型、M1 型和M2 型，在宮頸癌中分泌各種促炎因子，參與了腫瘤發(fā)生、發(fā)展。以上均表明SHCBP1 可能在CESC免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，值得進(jìn)一步的研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突