壬二酸和水楊酸對痤瘡丙酸桿菌誘導的細胞炎癥因子及TLR4 蛋白表達的影響

宋莎莎，王永芳，陳毅，李新宇

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 皮膚病研究所，江蘇 南京 210042

痤瘡是皮膚科常見的一種慢性炎癥性疾病，主要發(fā)生于顏面和胸背多脂區(qū)，臨床主要表現為粉刺、丘疹、膿皰和結節(jié)等多形性皮損，好發(fā)于青春期，對青少年的心理和社交影響很大[1]。痤瘡的發(fā)病機制主要包括皮脂腺大量分泌，毛囊皮脂腺導管上皮過度角化，微生物尤其是痤瘡丙酸桿菌Propionibacterium acnes的定殖及炎癥和免疫反應。機體免疫細胞如角質形成細胞、單核細胞等在抵抗P.acnes等入侵過程中釋放白細胞介素（IL）-1、IL-8 和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子，這些炎癥因子將炎癥細胞趨化至毛囊周圍，引起炎性損傷[2]。

壬二酸又名杜鵑花酸，是一種來自杜鵑花的天然含有9 個碳原子的飽和直鏈二羧酸。壬二酸的抗炎和抗氧化特性已被證實，其外用可以治療酒糟鼻、尋常痤瘡、黃褐斑和炎癥后色素沉著等疾病[3]。《中國痤瘡治療指南（2019 修訂版）》推薦壬二酸是輕中度痤瘡的二線外用藥[4]。水楊酸最早是從柳樹皮中提取出的天然活性成分，屬于β-羥基酸，因其具有較好的脂溶性，更易深入毛囊皮脂腺深部而溶解粉刺，被廣泛用于治療痤瘡和脂溢性皮炎等疾病[5]。本研究體外觀察壬二酸和水楊酸對P.acnes的胞壁成分肽聚糖（PGN）和脂磷壁酸（LTA）、熱滅活P.acnes以及佛波醇酯（PMA）和細菌脂多糖（LPS）分別誘導的人角質形成細胞HaCaT 和人單核細胞THP-1 產生炎癥因子的影響，通過分子對接技術分析2 種藥與Toll樣受體4（TLR4）蛋白間的相互作用模式以及實驗驗證對HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料

壬二酸（質量分數99.15%，上海易恩化學技術有限公司，批號RH244687）；水楊酸（質量分數99.7%，山東新華制藥股份有限公司提供，批號21036）；人角質形成細胞永生化細胞株HaCaT、人單核細胞株THP-1（本室維持保存）；P.acnes（ATCC6919，本室維持保存）；PGN、LTA、PMA、LPS（美國Sigma 公司，貨號分別是69554、L3265、P1585、L4130）；DMEM、RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清、2-巰基乙醇（美國Gibco 公司）；腦心浸出液肉湯（BHI，青島高科園海博生物技術有限公司）；人IL-8、IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；4%多聚甲醛（南京森貝伽生物科技有限公司）；TLR4 抗體（美國Santa cruz 公司）；Cell Counting Kit-8、Triton X-100、山羊血清、Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）、DAPI 染色液、BCA 蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；ECL 顯色液（美國Thermo Fisher Scientific公司）；厭氧產氣袋和密封培養(yǎng)罐（日本三菱MGC）。酶標儀（瑞士Tecan 公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HaCaT細胞用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，THP-1 細胞用含10%胎牛血清、0.05 mmol/L 2-巰基乙醇的RPMI 1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，并以1∶3 每隔2～3 d 傳代1 次，取處于對數生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 滅活P.acnes的制備 挑取在厭氧條件下血瓊脂平皿中維持培養(yǎng)的P.acnes菌落接種于BHI 培養(yǎng)基，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)24 h，收集菌落，用無菌PBS 洗3 次，4 ℃下以4 000 r/min 離心15 min，調整菌液濃度至4.5×107CFU/μL，置于80 ℃水浴中滅活30 min。

1.2.3 細胞增殖活力 HaCaT細胞以2×105個/mL接種于96 孔培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，培養(yǎng)過夜后棄去孔內培養(yǎng)基，加入各濃度藥液0.2 mL；THP-1 細胞以3×105個/mL 接種于96 孔培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，培養(yǎng)過夜后每孔加入各濃度藥液0.1 mL。每組設4 個復孔，培養(yǎng)48 h 后加入10 μL CCK-8 溶液，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm 波長處檢測吸光度（A）值。

細胞存活率＝A給藥/A對照

1.2.4 HaCaT 細胞培養(yǎng)上清液中IL-8 含量 PGN＋LTA 誘導實驗設置為對照組（僅加培養(yǎng)基）、模型組（加培養(yǎng)基和刺激劑）、溶媒組（加含溶媒培養(yǎng)基和刺激劑）、壬二酸（62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL）組和水楊酸（31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL）組；P.acnes誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（62.50、31.25、15.63、7.81 μg/mL）組和水楊酸（31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL）組。細胞以3×105個/mL 接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，0.1 mL/孔，培養(yǎng)6 h 后更換無血清培養(yǎng)基進行饑餓培養(yǎng)，次日棄去孔內培養(yǎng)基，加入不同質量濃度的藥液0.1 mL/孔，孵育16 h 或6 h 后，棄去孔內溶液，加入PGN＋LTA（終質量濃度 12.5 μg/mL＋12.5 μg/mL）和不同質量濃度藥液共同作用24 h，或P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-8 含量。

1.2.5 THP-1 細胞培養(yǎng)上清中IL-1β 和TNF-α 含量 PMA＋LPS 誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL）組和水楊酸（500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 μg/mL）組；P.acnes誘導實驗設置為對照組、模型組、溶媒組、壬二酸（1 000.00、500.00、250.00、125.00 μg/mL）組和水楊酸（500.00、250.00、125.00、62.50 μg/mL）組。細胞用無血清RPMI 1640 培養(yǎng)基調整成12×105個/mL 或6×105個/mL 細胞懸液接種96 孔培養(yǎng)板，加入不同質量濃度的藥液孵育18 h 或6 h，繼續(xù)加入PMA＋LPS（終質量濃度100 ng/mL＋500 ng/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，或加入P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL或2.25×108CFU/mL）和不同質量濃度藥液共同作用48 h，收集細胞上清液，按ELISA 試劑盒說明檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 和TNF-α 含量。

1.2.6 分子對接分析壬二酸、水楊酸與TLR4 蛋白受體的分子間相互作用模式 利用PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）分別下載壬二酸、水楊酸的化學結構文件，再導入Chem 3D（v15.0）軟件生成3D 化學結構并使其能量最小化。通過RCSB PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載TLR4蛋白的晶體結構文件，采用PyMOL 軟件去除蛋白結構中的溶劑和有機物，然后利用AutoDock（v4.2.6）軟件對蛋白結構進行加氫、計算電荷、添加原子類型。由Autodock vina 分別實施壬二酸、水楊酸和TLR4 蛋白受體的分子對接，再利用PLIP 分別分析壬二酸、水楊酸和TLR4 蛋白受體對接的分子間相互作用模式，最后通過PyMOL 軟件可視化結果。

1.2.7 細胞免疫熒光檢測TLR4 蛋白表達 HaCaT細胞懸液1 mL（1×105個/mL）接種于直徑15 mm玻底培養(yǎng)皿，待細胞貼壁后加入藥液（壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL）孵育16 h，棄去孔內藥液后加入PGN＋LTA（終濃度50 μg/mL＋50 μg/mL）或P.acnes（終濃度2.25×109CFU/mL）及配制好的藥液（壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL），繼續(xù)作用24 h。無菌PBS 漂洗3 次，經4%多聚甲醛固定、0.5% Triton X-100 破膜、10%山羊血清封閉后，加入TLR4（1∶50）抗體，置4 ℃過夜，棄一抗，PBS 清洗，加入Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG（1∶500），避光孵育1 h，DAPI 核染5 min，激光共聚焦顯微鏡（×100）觀察并拍照。

1.2.8 壬二酸和水楊酸組合物對不同刺激劑誘導HaCaT 產生IL-8 及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α的影響 將壬二酸和水楊酸按15∶1 的比例配制成組合物，即質量濃度為125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 μg/mL。組合物對不同刺激劑誘導后HaCaT細胞產生IL-8 以及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α的影響，實驗步驟同1.2.4 和1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析比較總體的組間差異，再采用LSD-t檢驗進行兩兩比較。

2 結果

2.1 壬二酸和水楊酸對HaCaT 和THP-1 細胞增殖的影響

細胞分別經62.50～1 000.00 μg/mL 的壬二酸和水楊酸作用48 h 后，發(fā)現壬二酸質量濃度為1 000.00、500.00 μg/mL 時，HaCaT 細胞的存活率分別為16%、35%，而壬二酸質量濃度為250.00 μg/mL 及以下時，HaCaT 細胞的存活率均高于75%；相同受試質量濃度范圍內的壬二酸對THP-1 細胞活力無明顯影響。1 000.00 μg/mL 水楊酸作用48 h，HaCaT 細胞存活率為43%，THP-1 細胞存活率為61%，而在500 μg/mL 及以下質量濃度，2 種細胞的存活率均高于75%，見圖1。

圖1 CCK-8 法檢測藥物作用48 h 對HaCaT 細胞和THP-1 細胞增殖的影響（，n＝3）Fig.1 Effect of drugs on the cell proliferation in HaCaT and THP-1 cells by CCK-8 method (，n＝3)

因此，在后續(xù)的HaCaT 細胞實驗中，選擇壬二酸62.50 μg/mL、水楊酸31.25 μg/mL 為最大實驗質量濃度；THP-1 細胞實驗中壬二酸的最大實驗質量濃度為1 000.00 μg/mL，水楊酸為500.00 μg/mL。

2.2 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后HaCaT細胞產生IL-8 的影響

如圖2 所示，不同受試濃度的壬二酸、水楊酸對PGN＋LTA 或熱滅活P.acnes誘導后HaCaT 細胞產生IL-8 均表現出一定的抑制作用，PGN＋LTA誘導后，壬二酸：半數效應濃度（EC50）為5.17 μg/mL，水楊酸EC50為3.50 μg/mL。熱滅活P.acnes誘導后，壬二酸EC50為2.76 μg/mL，水楊酸EC50為2.80 μg/mL。且隨著藥物濃度的增加，IL-8 含量明顯下降，抑制作用呈劑量相關性。

圖2 壬二酸和水楊酸對PGN＋LTA（A）或熱滅活P. acnes（B）誘導后的HaCaT 細胞產生IL-8 的影響（，n＝3）Fig.2 Effects of azelaic acid and salicylic acid on IL-8 production in HaCaT cells induced by PGN+LTA (A) and heat inactivated P. acnes (B) stimulants (，n＝3)

2.3 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后THP-1細胞產生IL-1β 和TNF-α 的影響

如圖3 所示，不同受試濃度的壬二酸、水楊酸對PMA＋LPS 或熱滅活P.acnes誘導后的THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α 均有一定的抑制作用。PGN＋LTA 誘導后壬二酸抑制THP-1 細胞產生IL-1β，壬二酸EC50為1.05 μg/mL，水楊酸EC50為2.16 μg/mL，PGN＋LTA 誘導后壬二酸抑制THP-1 細胞產生TNFα，壬二酸EC50為3.74 μg/mL；水楊酸的抑制率均＞90%；熱滅活P.acnes誘導后抑制THP-1 細胞產生IL-1β 中，壬二酸EC50為3.04 μg/mL，水楊酸EC50為2.17 μg/mL；熱滅活P.acnes誘導后抑制THP-1 細胞產生TNF-α 中，壬二酸EC50為4.05 μg/mL，水楊酸EC50為3.02 μg/mL。且隨著藥物濃度的增加，IL-1β 和TNFα 含量均明顯下降，呈量效關系。

圖3 壬二酸和水楊酸對PMA＋LPS（A）或熱滅活P. acnes（B）誘導后THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α 的影響（，n＝3）Fig.3 Effects of azelaic acid and salicylic acid on expression of IL-1β and TNF-α in THP-1 cells after induced by PMA+LPS(A) and heat inactivated P. acnes (B) stimulants (，n＝3)

2.4 壬二酸和水楊酸與TLR4 蛋白的分子間相互作用模式分析

如圖4 所示，壬二酸可通過氫鍵、疏水相互作用、鹽橋相互作用與TLR4 蛋白受體結合，親和力為?27.72 kJ/mol；水楊酸可通過氫鍵、疏水相互作用、鹽橋相互作用、π-堆積（平行）作用與TLR4 蛋白受體結合，親和力為?31.5 kJ/mol。結果表明，壬二酸、水楊酸均能與TLR4 蛋白受體有效地結合。

圖4 壬二酸和水楊酸與TLR4 蛋白受體的分子對接Fig.4 Molecular docking of azelaic acid,salicylic acid and TLR4 protein receptor

2.5 壬二酸和水楊酸處理后對HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達的影響

與對照組相比，PGN＋LTA 或P.acnes刺激后細胞表面TLR4 蛋白熒光強度明顯增高（P＜0.01），62.50 μg/mL 壬二酸預處理后，PGN＋LTA 刺激的HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白表達明顯降低（P＜0.01）；而31.25 μg/mL 水楊酸預處理后能明顯降低滅活后的P.acnes誘導的細胞表面TLR4 蛋白表達（P＜0.05），見圖5、6。

圖6 壬二酸和水楊酸對不同刺激劑誘導后HaCaT 細胞TLR4 相對蛋白表達量的影響（，n＝3）Fig.6 Effects of azelaic acid and salicylic acid on relative protein level of TLR4 in HaCaT cells induced by different stimulants (，n＝3)

2.6 壬二酸和水楊酸及兩者15∶1 組合物對刺激劑誘導后炎癥因子EC50 值比較

根據ELISA 結果計算EC50值發(fā)現，對PGN＋LTA 聯合刺激以及P.acnes滅活菌誘導HaCaT 細胞產生IL-8，兩者聯合應用后效價強度增高，同時組合物對于P.acnes滅活菌誘導THP-1 細胞產生IL-1β 的抑制作用也表現出顯著的聯合應用優(yōu)勢，見表1。

表1 壬二酸和水楊酸及兩者組合物對刺激劑誘導后炎癥因子EC50 值比較Table 1 Comparison on EC50 values of azelaic acid,salicylic acid and their mixture on inflammatory factor induced by stimulants

3 討論

痤瘡俗稱粉刺、青春痘，是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚疾病，發(fā)病因素較多，主要影響皮脂腺豐富的區(qū)域，嚴重的可導致疤痕和毀容，是一種對患者的心理和身體健康有較大影響的疾病。P.acnes是體表的正常菌群之一，為革蘭陽性厭氧菌，是痤瘡發(fā)病和炎癥維持的關鍵因素之一。P.acnes通過激活與痤瘡相關的關鍵細胞上Toll 樣受體（TLRs）表達，可轉錄激活轉錄因子蛋白家族（NFκB）信號通路，誘導下游促炎細胞因子如IL-1、IL-8、IL-6 和TNF-α 等表達，引起炎癥反應[6]，是天然免疫系統(tǒng)的重要模式識別分子。角質形成細胞是人類皮膚中抵御外源性病原體的第一道屏障，細胞中TLRs 可識別廣泛的微生物或其成分的配體，包括PGN、LTA、LPS 和細菌脂蛋白等[7]。P.acnes的主要胞壁成分PGN 和LTA 能刺激免疫細胞釋放炎癥介質，LPS 作為革蘭陰性菌的組成部分亦是一種免疫刺激因子[8]。TLR4 是角質形成細胞表面存在的TLRs 中的一個亞型。過往研究報導LPS 和LTA 均能觸發(fā)TLR4 的激活，導致下游IL-8 產生的級聯反應[9-10]。本研究中細胞免疫熒光結果也已證實，給予PGN＋LTA 聯合應用刺激，或用滅活P.acnes刺激后均能上調HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白的表達。

痤瘡的治療主要包括口服藥、外用藥及物理治療等，外用藥治療中的維甲酸應用較多，但該藥易引起局部刺激。抗生素對痤瘡的治療雖然有效，但隨之而來的耐藥性亦成為一個巨大的挑戰(zhàn)[11-12]，尋找和使用安全有效的局部用藥一直是臨床治療痤瘡的重要需求。

壬二酸具有多種藥理作用，能夠抑制線粒體代謝和微生物蛋白的合成，具有抗炎、抗菌以及改變毛囊表皮過度增殖和炎癥反應等活性，有利于痤瘡的治療[13-15]。作為一種非甾體類、亦具有抗炎活性的物質，水楊酸還有抑制真菌和細菌的作用，同時具有低濃度下調節(jié)角質細胞、高濃度松解剝脫角質細胞能力及美白作用，它在治療痤瘡的同時也對痤瘡炎癥后的色素沉著有淡化作用[16-17]，因此應用較為廣泛。但是2 種藥物治療痤瘡的機制有必要進一步研究。本研究結果表明，壬二酸和水楊酸對P.acnes成分PGN＋LTA，或P.acnes本身誘導的HaCaT 細胞產生IL-8，以及THP-1 細胞產生IL-1β 和TNF-α，均具有較強的抑制作用。分子對接結果表明，壬二酸、水楊酸均能與TLR4 蛋白受體有效地結合。體外實驗進一步表明，壬二酸、水楊酸對上述刺激劑誘導下的HaCaT 細胞表面TLR4 蛋白的表達也有明顯的下調作用，這些結果均提示，壬二酸和水楊酸能抑制P.acnes引起的角質形成細胞表面TLR4 蛋白的表達，以及下游促炎因子IL-8 的產生，和抑制P.acnes誘導的單核細胞IL-1β 和TNF-α 的產生，這可能是2 種藥物在臨床上治療痤瘡有效的機制之一。

另外，本研究還發(fā)現將壬二酸和水楊酸按15∶1聯合處理細胞后，再測定PGN＋LTA 或P.acnes誘導的HaCaT 細胞產生IL-8 的水平以及P.acnes誘導的THP-1 細胞IL-1β 的產生，發(fā)現聯合用藥時的效價強度優(yōu)于單獨用藥。這一結果也提示，壬二酸與水楊酸的聯合作用可能更有利于發(fā)揮痤瘡治療中的抗炎效果。在痤瘡治療中壬二酸可能對皮脂的產生并不表現抑制作用[18]，而水楊酸為一種脂溶性物質，它可與毛囊中的表皮脂質和皮脂腺脂質相溶，具有良好的溶解角質和消除粉刺的特性[19-20]，結合以上的結果，本研究將壬二酸與水楊酸聯合應用，不僅利用了各自的作用特點，同時在對抗痤瘡促炎因子的產生中更有優(yōu)勢。

綜上所述，壬二酸和水楊酸能抑制P.acnes引起的角質形成細胞和單核巨噬細胞中促炎因子的產生，同時還能減少角質形成細胞表面TLR4 蛋白的表達，從而發(fā)揮治療痤瘡的作用。2 種藥物聯合應用后治療痤瘡的其他機制仍值得深入探討。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突