補肺活血膠囊對小鼠肺纖維化作用及機制

李鵬，劉怡，王鳳嬋，趙國靜，韓萍，周佩夏，葉海燕，王坤，胡海波，陸學超

青島大學附屬青島市海慈醫(yī)院 青島市中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266033

肺纖維化是許多間質(zhì)性肺部疾病的終末結局，可導致呼吸困難或呼吸衰竭，確診后平均預期壽命僅為3 年[1]。盡管當前有大量關于肺纖維化的研究，但通過化學藥治療肺纖維化的效果并不理想[2]。面對逐年上漲的肺纖維化發(fā)病率，以其關鍵發(fā)病機制為出發(fā)點，著力于研發(fā)高效治療藥物對于改善肺纖維化患者預后，提高其生活質(zhì)量具有重要的意義。

補肺活血膠囊由黃芪、赤芍、補骨脂組成，可益氣活血、補肺固腎，常用于臨床肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎等疾病的治療。研究表明，補肺活血膠囊可以減少肺組織中炎性因子的分泌，改善肺炎性損傷及纖維化樣變的程度[3]，一定程度上能延緩肺功能下降，改善臨床癥狀[4]。然而其具體的作用機制尚不明確。本研究擬通過博來霉素建立小鼠肺纖維化模型，并用補肺活血膠囊進行治療。通過小鼠存活率、鼠肺泡灌洗液（BALF）總細胞與總蛋白、肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）與羥脯氨酸（HYP）和肺組織病理學變化研究補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠的治療作用，并基于Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）通路研究補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，以期闡明補肺活血膠囊治療肺纖維化的機制，為補肺活血膠囊臨床應用治療肺纖維化提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

90 只SPF 級健康雄性C57BL/6 小鼠，體質(zhì)量20～22 g，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2019-0008。每5 只小鼠一籠，飼養(yǎng)于室溫（21±2）℃，相對濕度50%～60%，明暗12 h/12 h 的環(huán)境并使小鼠自由進食飲水。本研究經(jīng)青島市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會批準，審批號2024HC01LS12。

1.2 藥品與試劑

NLRP3 抑制劑MCC950（貨號S8930，美國Selleck 公司）；博來霉素（貨號M2100，美國AbMole公司）；補肺活血膠囊（規(guī)格0.35 g/粒，批號155532，廣東雷允上藥業(yè)有限公司）；BCA 法微量蛋白檢測試劑盒（貨號W041-1-1，南京建成生物工程研究所）；牛血清白蛋白（BSA，貨號W071-1-1，南京建成生物工程研究所）；Masson 染液（貨號D026-1-3，南京建成生物工程研究所）；蘇木素–伊紅（HE）染液（貨號D006-1-4，南京建成生物工程研究所）；HYP 檢測試劑盒（堿水解法，貨號A030-2-1，南京建成生物工程研究所）；羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶（HRP，貨號KS001，南京建成生物工程研究所）；羊抗兔IgG-HRP（貨號KS002，南京建成生物工程研究所）；抗體：β-肌動蛋白（β-actin，貨號3700）、E-鈣黏蛋白（E-cad，貨號14472）、波形蛋白（Vim，貨號3932）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA，貨號69319）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β，貨號3711）、NLRP3（貨號15101）、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC，貨號67824）、cleaved-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1，貨號89332）、mature-白細胞介素（IL）-1β（貨號63124）、mature-IL-18（貨號57058），Cell Signaling Technology；試劑盒：總RNA 提取試劑盒（貨號#DP419）、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號#KR116-02）、SYBR 擴增試劑盒（貨號#P205-02，天根生化科技（北京）有限公司）。

1.3 儀器

LP-5117 型多功能酶標儀（長春樂鏷科技有限公司）；PowerPAC Basic 電泳儀和ChemiDoc XRS凝膠成像自動分析儀（Bio-Rad 公司）；H3-18KR 型高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；MDF-C8V(N)型?80 ℃冷凍冰箱（日本SANYO 公司）；LEPGEN-96 熒光定量PCR 儀[樂普（北京）醫(yī)療器械股份有限公司]。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

將C57BL/6 小鼠隨機分為對照組、模型組、NLRP3 抑制劑（MCC950）組及補肺活血膠囊低、中、高（0.32、0.63、1.26 g/kg）組，每組15 只。通過對小鼠氣管內(nèi)單次注射2.5 mg/kg 博來霉素來誘導肺纖維化。對照組小鼠接受單次氣管內(nèi)注射等體積的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。在接受氣管注射后第1 天開始，MCC950 組每天ip 10 mg/kg MCC950，補肺活血膠囊組每天分別ig 0.32、0.63、1.26 g/kg補肺活血膠囊。補肺活血膠囊劑量根據(jù)等效劑量換算公式（等效劑量＝成人每日劑量/70×9.1）計算得出，其中中劑量為人等效劑量，低劑量為等效劑量的1/2 倍，高劑量為等效劑量的2 倍。給藥前確定小鼠體質(zhì)量，以便準確計算所需藥物量。將膠囊中的細粉顆粒按照高劑量濃度溶于生理鹽水，之后使用生理鹽水分別梯度稀釋為中劑量和低劑量，按照每只小鼠接受0.2 mL 藥物溶液進行配制。對照組與模型組每天分別ig 等體積的生理鹽水，整個給藥過程持續(xù)21 d。給藥過程中，每天統(tǒng)計各組小鼠存活的數(shù)量。在接受氣管注射后第22 天，小鼠以頸椎脫臼法被處死，稱質(zhì)量并收集樣本。

2.2 肺組織標本采集與病理學染色

小鼠處死后，切開胸腔并充分暴露頸部氣管。結扎右肺后，用4 ℃的PBS 對左肺進行3 次灌洗，每次0.5 mL，回收的液體即為BALF，灌洗后的左肺摘下在?80 ℃冰箱保存。然后將BALF 在4 ℃下以150×g離心5 min，并將灌洗液的上清液儲存在?80 ℃，用總蛋白測定試劑盒分析總蛋白含量。將BALF 樣品的細胞顆粒重新懸浮在PBS 中進行細胞計數(shù)。

BALF 收集完成后，摘取結扎的右肺放入4%多聚甲醛固定，取下葉稱取濕質(zhì)量（W），然后置于60 ℃烘箱中烘干72 h 后稱取干質(zhì)量（D），計算肺組織濕干質(zhì)量比（W/D）。剩余右肺嵌入石蠟包埋后，制成3 μm 的切片進行染色。進行蘇木精–伊紅（HE）染色和Masson 染色，通過光學顯微鏡觀察結果以評估肺部炎癥和膠原沉積的水平。采用Szapiel 量化方法對HE 染色進行評估[5]，采用改良的Ashcroft 量化方法對Masson 染色進行評估[6]。

2.3 肺組織HYP 測定

精準稱量30 mg 肺組織，使用生化試劑盒測定肺部膠原蛋白主成分HYP 的水平。HYP 氧化后與二甲氨基苯甲醛反應顯紫紅色，用酶標儀在550 nm波長處測定。

2.4 qRT-PCR 檢測EMT 相關蛋白的mRNA 表達

使用總RNA 提取試劑盒從肺組織及細胞中獲得總RNA。再使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。使用qPCR 法測定E-cad、Vim、α-SMA、TGF-β1mRNA表達量。引物序列見表1，使用2?ΔΔCt法基于β-actin計算目標mRNA 相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2.5 Western blotting 檢測EMT 以及NLRP3 信號通路相關蛋白表達

將肺組織及細胞放入含1 mmol/L PMSF 的冰冷的RIPA 緩沖液中進行超聲均質(zhì)提取總蛋白。使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定上清液中的蛋白濃度。提取的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE 分離后電轉(zhuǎn)到PVDF膜。使用5%脫脂奶粉溶液封閉膜1 h，隨后用Ecad、VIM、α-SMA、TGF-β1、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、cleaved-IL-1β、cleaved-IL-18 的抗體在4 ℃下培養(yǎng)過夜。用TBST 清洗3 次孵育后的膜，然后用HRP 標記的二抗在室溫下培養(yǎng)1 h，再次洗膜后經(jīng)ECL 化學發(fā)光顯影，最后使用Image J 軟件對條帶進行量化分析。

2.6 統(tǒng)計學分析

采用Excel 2019 和SPSS Pro 在線數(shù)據(jù)分析平臺進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。

3 結果

3.1 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠存活率的影響

給藥結束后，對照組小鼠存活率為100%，模型組小鼠存活率為47%，MCC950 和補肺活血膠囊干預可顯著增加肺纖維化小鼠存活率。MCC950 組存活率為67%，補肺活血膠囊0.32、0.63、1.26 g/kg組存活率分別為60%、67%、73%，見圖1。

圖1 肺纖維化小鼠存活率（n=15）Fig.1 Survival rate of mice with pulmonary fibrosis (n=15)

3.2 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠體質(zhì)量、肺組織W/D 的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊1.26 g/kg 組體質(zhì)量顯著升高（P＜0.01）；MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖2。

圖2 肺纖維化小鼠體質(zhì)量和肺組織W/D（，n=15）Fig.2 Body mass and W/D of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.3 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠BALF 總細胞數(shù)和總蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組BALF 總細胞數(shù)顯著降低（P＜0.05、0.01）；MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組總蛋白濃度顯著降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 BALF 總細胞數(shù)和總蛋白濃度（，n=15）Fig.3 Total cell count and total protein concentration of BALF (,n=15)

3.4 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠肺組織病理的影響

HE 染色顯示，對照組肺組織未發(fā)現(xiàn)肺泡炎性滲出及纖維化病變，肺泡結構清晰；模型組肺部結構發(fā)生了扭曲，肺間質(zhì)細胞數(shù)量增加，纖維組織增生、纖維化，肺泡腔增大、融合；MCC950、補肺活血膠囊干預后，肺纖維化小鼠肺組織病理化程度減輕，肺組織結構完整度提升，肺泡間隔厚度減少，炎性細胞浸潤減少。與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊各劑量組Szapiel 評分顯著降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 肺纖維化小鼠肺組織HE 染色及Szapiel 量化評分（，n=15）Fig.4 HE staining and Szapiel quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

Masson 染色顯示，對照組小鼠肺組織結構形態(tài)正常；模型組肺間質(zhì)中存在明顯的藍色膠原蛋白沉積，呈大片束狀及片狀分布，肺組織纖維化程度嚴重；MCC950、補肺活血膠囊干預后肺纖維化小鼠肺組織中藍色膠原蛋白沉積減少，肺纖維化程度明顯減輕。與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊各劑量組Ashcroft 評分顯著降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 肺纖維化小鼠肺組織Masson 染色及Ashcroft 量化評分（，n=15）Fig.5 Masson staining and Ashcroft quantitative score of lung tissue of mice with pulmonary fibrosis (,n=15)

3.5 補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠HYP 的影響

與模型組比較，MCC950 組和補肺活血膠囊0.63、1.26 g/kg 組HYP 含量顯著降低（P＜0.05、0.01），見圖6。

圖6 肺纖維化小鼠HYP 含量（，n=15）Fig.6 HYP content in mice with pulmonary fibrosis(,n=15)

3.6 補肺活血膠囊對EMT 相關蛋白mRNA 和蛋白表達的影響

qRT-PCR 結果顯示，與模型組相比，MCC950組、補肺活血膠囊各劑量組中的Vim、α-SMA、TGFβ1 mRNA 表達明顯降低，E-cad mRNA 表達明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖7。

圖7 補肺活血膠囊對EMT 相關mRNA 的影響（，n=15）Fig.7 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related mRNA (,n=15)

Western blotting 結果顯示，與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組的Vim、α-SMA、TGF-β1 蛋白表達明顯降低，E-cad 表達水平明顯升高（P＜0.05、0.01），見圖8。

圖8 補肺活血膠囊對EMT 相關表達蛋白的影響（，n=15）Fig.8 Effect of Bufei Huoxue Capsules on EMT-related expression proteins (,n=15)

3.7 補肺活血膠囊對NLRP3 信號通路表達蛋白的影響

與模型組相比，MCC950 組、補肺活血膠囊各劑量組的NLRP3、ASC、mature-Caspase-1、mature-IL-1β、mature-IL-18 蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05、0.01），見圖9。

圖9 補肺活血膠囊對NLRP3 信號通路表達蛋白的影響（，n=15）Fig.9 Effect of Bufei Huoxue capsule on NLRP3 signaling pathway (,n=15)

4 討論

博來霉素作為一種化學治療性抗生素，被廣泛應用于肺纖維化動物模型的制作[11]。本研究通過博來霉素建立肺纖維化模型小鼠。MCC950 與補肺活血膠囊給藥治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質(zhì)量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細胞與總蛋白、羥脯氨酸含量均明顯降低，肺纖維化進程明顯改善，補肺活血膠囊治療效果明顯。

后續(xù)本研究探討了補肺活血膠囊對肺纖維化小鼠EMT 的影響，結果顯示，補肺活血膠囊干預后可提高肺纖維化小鼠肺組織E-cad 表達，降低VIM、α-SMA、TGF-β1 表達。過度的EMT 在肺纖維化發(fā)展中起到了關鍵性的作用。EMT 是上皮細胞表型的轉(zhuǎn)變，這個過程中上皮細胞失去其部分特征和標記從而獲得間質(zhì)細胞的標記，在各種損傷刺激下分化的上皮細胞經(jīng)過表型轉(zhuǎn)化可形成大量的成纖維細胞以及肌成纖維細胞，而肌成纖維細胞則可以通過細胞外基質(zhì)（ECM）的過度積累促進肺纖維化的發(fā)展[12]。在EMT 過程中，上皮細胞基因表達受到抑制導致上皮細胞標記物如E-cad 蛋白表達減少，間質(zhì)細胞基因表達激活導致間質(zhì)細胞標記物如Vim、α-SMA、蛋白表達增加[13]，因此可以通過檢測相關蛋白以及mRNA 的變化來表征EMT 的發(fā)生發(fā)展。TGF-β1 是ECM 過度積累、成纖維細胞增殖和分化為肌成纖維細胞的主要誘導劑，即肺纖維化中誘導EMT 發(fā)生的關鍵因子，抑制TGF-β1 的表達可改善EMT 的發(fā)展[14-15]。

近年來有許多研究證實EMT 的促進可能與激活NLRP3 炎癥小體信號通路有關，這種變化會加劇腫瘤細胞的侵襲與遷移，而其在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用鮮有研究[16-18]。NLRP3 炎癥小體是由NLRP3、ASC、Caspase-1 組成的多蛋白復合物，當NLRP3 被激活時會促進NLRP3 炎癥小體各組分（NLRP3、ASC、Caspase-1）的組裝，進而激活 pro-Caspase-1 形成具有活性的 cleaved-Caspase-1，對炎癥因子IL-1β 和IL-18 進行切割并使其成熟，mature-IL-1β 可以刺激TGF-β1 合成，而TGF-β1 是EMT 發(fā)生發(fā)展的關鍵性因子，TGF-β1 合成增加將加劇肺泡EMT 進程，從而加速肺纖維化形成，抑制NLRP3 可以明顯緩解肺纖維化[19-21]。本研究結果顯示，與模型組相比，補肺活血膠囊可以下調(diào)NLRP3 相關蛋白的表達，下調(diào)肺纖維化小鼠體內(nèi)炎癥反應，表明NLRP3 途徑可能是補肺活血膠囊抗肺纖維化的重要調(diào)節(jié)通路。MCC950 是一種有效的特異性NLRP3 炎癥小體小分子抑制劑，抑制原理與其直接結合NLRP3 中NACHT 結構域的Walker B 基序繼而阻斷ATP 水解有關，此外其對NLRP1、NLRC4、AIM2 等炎癥小體的激活沒有影響[22-23]。因此本研究選取MCC950 作為陽性對照藥物對比補肺活血膠囊對NLRP3 的抑制作用，結果顯示MCC950 可抑制NLRP3 通路活化及EMT 發(fā)生，同時對肺纖維化小鼠具有治療作用，而補肺活血膠囊與MCC950 干預對肺纖維化小鼠EMT 及治療作用的影響無明顯差異。

綜上所述，通過補肺活血膠囊治療后，肺纖維化小鼠生存率明顯提高，體質(zhì)量明顯增加，肺組織W/D、BALF 總細胞與總蛋白、HYP 含量均明顯降低，肺纖維化進程明顯改善。因此可以證實補肺活血膠囊可以通過調(diào)控NLRP3 通路介導的EMT 抑制減輕博來霉素誘導的肺纖維化程度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突