間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)杏仁過(guò)敏原Amandin

劉俊偉，吳雨晴，李明新，陸旸，任光達(dá)

（1.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)天津市食品質(zhì)量與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.華芯領(lǐng)創(chuàng)（天津）生物科技有限公司，天津 300451）

食物過(guò)敏是食品中的抗原物質(zhì)刺激人體免疫系統(tǒng)所產(chǎn)生的不良反應(yīng)，其中由免疫球蛋白（immunoglobulin E，IgE）介導(dǎo)的食物過(guò)敏反應(yīng)最為常見(jiàn)[1-2]。而食品中能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE 并使抗體進(jìn)一步誘導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞釋放介質(zhì)從而引起速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)被稱為食品過(guò)敏原[3]。目前已知的食物過(guò)敏反應(yīng)主要是由花生、堅(jiān)果、大豆、小麥、蛋類、奶類、魚(yú)類和甲殼類水產(chǎn)等引起[4]。在美國(guó)，多達(dá)600 萬(wàn)兒童和2 600 萬(wàn)成年人有食品過(guò)敏的情況[5-6]。研究表明，在我國(guó)的部分地區(qū)包括杏仁在內(nèi)的堅(jiān)果類食物已成為引發(fā)過(guò)敏性鼻炎和哮喘的危險(xiǎn)因素之一[7-8]。杏仁作為世界范圍最受歡迎的堅(jiān)果類之一，其過(guò)敏反應(yīng)已經(jīng)引起了人們的關(guān)注[9-11]。對(duì)于如何在食品加工過(guò)程中降低或者消除過(guò)敏原，相關(guān)機(jī)構(gòu)已開(kāi)展了一系列研究[12-13]。

Amandin 是杏仁的主要貯藏蛋白，是一種水溶性蛋白質(zhì)，屬于11S 球蛋白家族[14]。它含有人血清IgE 識(shí)別的主要反應(yīng)多肽，是杏仁的主要過(guò)敏原[15]。有研究表明，Amandin 的主要成分為prunin-1（Pru1）蛋白[16]。Pru1 單體由40 kDa 或42 kDa 酸性α 鏈和20 kDa 堿性β 鏈組成。這兩條鏈由不同的基因表達(dá)，其翻譯產(chǎn)物通過(guò)修飾后，將兩個(gè)肽鏈通過(guò)二硫鍵連接。有研究顯示，Amandin 具有較高的熱穩(wěn)定性，其結(jié)構(gòu)中的二硫鍵對(duì)穩(wěn)定性發(fā)揮著重要作用[17-18]。

目前，基于先進(jìn)的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)可以對(duì)杏仁過(guò)敏原進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，但其步驟繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力[19-20]。新興的多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需要，距商業(yè)化應(yīng)用還有一定距離[21]。而對(duì)于較為成熟的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）來(lái)說(shuō)，我國(guó)對(duì)杏仁過(guò)敏原Amandin 蛋白的檢測(cè)研究不多，尤其是市面上的商品化檢測(cè)試劑盒主要為國(guó)外的產(chǎn)品。因此，本研究在獲得抗Amandin 蛋白多克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立相關(guān)食物中杏仁過(guò)敏原的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法，以期為國(guó)產(chǎn)杏仁過(guò)敏原檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏仁：產(chǎn)自河北承德；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，99%）：德國(guó)Merck 公司；脫脂乳粉：美國(guó)BD 公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，98%）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish Peroxidase，HRP）-羊抗兔二抗（免疫親和純化）：美國(guó)Sigma 公司；單組份四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色液：湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；酶標(biāo)板：丹麥Nunc 公司；吐溫-20（tween-20，99%）、曲拉通X-100（Triton X-100，99%）：上海生工生物工程有限公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉（均為分析純）：天津渤化化學(xué)試劑有限公司；食品樣品：市售；花生全蛋白、芝麻全蛋白、核桃JugR1、β-乳球蛋白、酪蛋白、溶菌酶（2000 U/mg2）：天津科技大學(xué)食品安全研究室提供；大耳白兔：天津市百農(nóng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超純水系統(tǒng)（Milli-Q）：美國(guó)Millipore 公司；蛋白純化儀（AKTA Purifier）：美國(guó)GE 公司；酶標(biāo)儀（Infinite M1000 PRO）：美國(guó)Tecan 公司；離心機(jī)（SL16R）：美國(guó)Thermo 公司；微量可調(diào)移液器：美國(guó)eppendorf 公司；分析天平（BL610）：德國(guó)Sartorius 公司；磁力攪拌器（C-MAG）：德國(guó)IKA 公司；pH 計(jì)（PB-10）：德國(guó)Sartorious公司；電泳儀（JY200C）：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（QuickGel 6200）：北京普邁精醫(yī)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Amandin 蛋白的提取

1.3.1.1 脫脂杏仁粉的制備

采用有機(jī)溶劑正己烷去除脂肪[15]，取適量杏仁去皮并充分研磨，以料液比1∶10（g/mL）加入正己烷，恒溫磁力攪拌脫脂3 h，抽濾棄去有機(jī)溶劑，重復(fù)脫脂直至有機(jī)層澄清透亮。將沉淀置于通風(fēng)櫥過(guò)夜，得到脫脂杏仁粉，經(jīng)過(guò)充分研磨后置于-20 ℃保存待用。

1.3.1.2 Amandin 蛋白的提取

Amandin 結(jié)合文獻(xiàn)[22-23]的方法，通過(guò)水提方式獲得目標(biāo)蛋白。取100 g 脫脂杏仁粉加入3 L 蒸餾水，室溫下通過(guò)磁力攪拌提取蛋白1 h。將混合物低溫離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min），取上清液。重復(fù)1 次上述提取方法，合并2 次離心后的上清溶液，用0.45 μm纖維素膜過(guò)濾得到澄清的淡黃色液體，4 ℃放置過(guò)夜后低溫離心（4 ℃，10 000 r/min，30 min）得到乳白色沉淀。將沉淀溶解于pH7.4 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，蒸餾水室溫透析9 h 后得到目標(biāo)蛋白，分裝后-20 ℃保存。

1.3.1.3 Amandin 蛋白的鑒定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）電泳試驗(yàn)。配制12%分離膠和5%濃縮膠，Amandin 蛋白與上樣緩沖液、β-巰基乙醇的體積比為5∶4∶1。將蛋白樣品100 ℃沸水浴5 min 后，4 ℃10 000 r/min離心5 min，每孔樣品上樣量為10 μL，預(yù)染Marker 為5 μL。電泳儀設(shè)定恒壓80 V 跑完濃縮膠后，調(diào)整電壓至120 V 直至電泳結(jié)束。凝膠染色2 h，脫色1 h 后觀察凝膠成像結(jié)果。

1.3.2 抗Amandin 抗體的制備與純化

將弗氏佐劑與Amandin 混合后免疫大耳白兔。免疫3 次后耳緣靜脈取血測(cè)定抗體效價(jià)。若效價(jià)超過(guò)1∶1×105后，取全血并分離血清。將兔子抗血清通過(guò)Protein A-Sepharose 4B 親和層析柱純化得到多克隆抗體。

1.3.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化

1.3.3.1 抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

將Amandin 蛋白分別以濃度為1.000、0.500、0.125 μg/mL 的溶液包被到酶標(biāo)板上。用1% BSA 封閉后，分別加入稀釋1 000、3 000、9 000、27 000、81 000倍的抗體溶液。室溫孵育1 h 后，加入HRP-羊抗兔二抗。加入底物顯色后，通過(guò)吸光值A(chǔ)450選擇較為合適的抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)。

1.3.3.2 緩沖液pH 值的優(yōu)化

將PBS 緩沖液的pH 值分別調(diào)到5.7、7.4 和9.5，并用其分別稀釋蛋白樣品，形成濃度梯度。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 的方法測(cè)定抑制率曲線的IC50值，并據(jù)此選取合適的緩沖液pH 值。

1.3.3.3 競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間的優(yōu)化

Amandin 將競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間分別限定為30、45、60 min，優(yōu)化結(jié)果通過(guò)抑制率曲線的IC50值的大小進(jìn)行判斷。

1.3.3.4 交叉反應(yīng)測(cè)定

選取部分食品過(guò)敏原及蛋白進(jìn)行抗體交叉反應(yīng)的測(cè)定，包括花生全蛋白、芝麻全蛋白、核桃JugR1、β-乳球蛋白、酪蛋白、溶菌酶。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法分別測(cè)定6 種蛋白的IC50值，記為a，并與Amandin 蛋白抑制率曲線的IC50值（b）相比，該方法與其他蛋白的交叉反應(yīng)率（X，%）計(jì)算公式如下。

X=b/a× 100

1.3.4 樣品處理與基質(zhì)影響消除

選擇不含有杏仁成分的餅干、面包和冰淇淋作為樣品。其中餅干和面包分別稱取1.0 g 樣品，粉碎后加入20 mL 含0.5% 明膠的Triton X-100/PBS 溶液，旋渦振蕩2 min 后過(guò)濾，濾液可直接用于檢測(cè)。稱取1.0 g 冰淇淋樣品，加入19 mL 含0.5%明膠的Tritonx-100/PBS溶液，旋渦振蕩2 min，4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，取上清液用于檢測(cè)。

1.3.5 添加回收試驗(yàn)

分別向餅干、面包和冰淇淋樣品中加入一定量的Amandin 蛋白，使樣品分別含有10、20、40 μg/g Amandin 蛋白。采用1.3.4 的方法處理樣品后進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算回收率，并以此判斷檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

1.3.6 Amandin 蛋白穩(wěn)定性測(cè)定

將Amandin 蛋白分別置于4 ℃和37 ℃環(huán)境中保存。在保存1、3、5 d 和7 d 后，分別取出進(jìn)行ELISA檢測(cè)，通過(guò)吸光值A(chǔ)450的變化判斷蛋白活性是否穩(wěn)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品至少重復(fù)測(cè)定3 次，取平均值，采用SPSS 16.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Amandin 蛋白的提取與鑒定

通過(guò)SDS-PAGE 電泳對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 純化后Amandin 的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE of purified Amandin

由圖1 可知，在40 kDa 和20 kDa 附近有比較深的條帶，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道的Amandin 蛋白的酸性α 鏈和堿性β 鏈的分子量一致，說(shuō)明本試驗(yàn)有效地提取出了目的蛋白。同時(shí)，其他蛋白條帶較淺，說(shuō)明純化后還有其他雜蛋白，但目的蛋白含量較高，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化

本研究通過(guò)棋盤滴定的方式，選取ELISA 顯色結(jié)果中吸光值A(chǔ)450為1.0～1.5 所對(duì)應(yīng)抗原包被濃度和抗體稀釋倍數(shù)為最適參數(shù)，如表1所示。

表1 包被抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimization of coating antigen concentration and antibody dilution fold

由表1 可知，有3 組參數(shù)符合要求：包被原濃度為1.000 μg/mL，抗體稀釋81 000 倍；包被原濃度為0.500 μg/mL，抗體稀釋81 000 倍；包被原濃度為0.125 μg/mL，抗體稀釋27 000 倍。在此基礎(chǔ)上，本研究選擇了IC50值較低的試驗(yàn)組（包被原濃度為0.500 μg/mL，抗體稀釋81 000 倍）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 緩沖液pH 值的優(yōu)化

試驗(yàn)體系中pH 值的高低將直接關(guān)系抗體活性，從而影響檢測(cè)靈敏度。本研究將緩沖液的pH 值分別調(diào)整為5.7、7.4 和9.5。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 試驗(yàn)，根據(jù)抑制率曲線中IC50值大小，選取較為合適的pH 值，結(jié)果如圖2所示。

圖2 緩沖液pH 值的優(yōu)化Fig.2 Optimization of buffer pH

由圖2 可知，該檢測(cè)方法在中性（pH7.4）條件下的IC50值最低，弱酸性（pH5.7）與中性接近，這表明該體系對(duì)于弱酸環(huán)境有一定耐受能力，而堿性（pH9.5）條件對(duì)檢測(cè)靈敏度有一定影響。因此，該方法確定pH 值為7.4。

2.4 競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間的優(yōu)化

不同的競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間得到的不同抑制率曲線如圖3所示。

圖3 競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間的優(yōu)化Fig.3 Optimization of competitive incubation time

由圖3 可知，孵育60 min 的抑制率曲線中，IC50值為0.61 μg/mL，低于孵育45 min 和30 min 抑制率曲線的IC50值。因此，該研究確定的競(jìng)爭(zhēng)孵育時(shí)間為60 min。

2.5 交叉反應(yīng)率的結(jié)果分析

本研究選取6 種食品過(guò)敏原及相關(guān)蛋白對(duì)抗體的交叉反應(yīng)率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 交叉反應(yīng)率測(cè)定結(jié)果Table 2 Cross reaction rate

由表2 可知，6 種蛋白與制備的抗Amandin 抗體交叉反應(yīng)率均低于0.1%，這表明抗體有較好的特異性，建立的檢測(cè)方法具有較好的專一性。

2.6 樣品基質(zhì)影響的消除

標(biāo)準(zhǔn)曲線與不同樣品的基質(zhì)曲線對(duì)比結(jié)果如圖4所示。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與不同樣品的基質(zhì)曲線對(duì)比Fig.4 Comparison between standard curve and matrix curves of different samples

在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)Amandin 的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法的靈敏度（IC50）為（0.66±0.04）μg/mL，檢出限為（0.08±0.04）μg/mL。由圖4可知，以0.5% 明膠的triton X-100/PBS 溶液為樣品稀釋液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線和3 種樣品基質(zhì)曲線的重合性較好，可有效消除樣品的基質(zhì)效應(yīng)。

2.7 添加回收試驗(yàn)結(jié)果分析

檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度通過(guò)回收率進(jìn)行評(píng)估。通過(guò)向不含有Amandin 蛋白的樣品中添加一定濃度的目標(biāo)蛋白，利用已建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法對(duì)樣品進(jìn)行處理和檢測(cè)，根據(jù)測(cè)定值和理論值之比計(jì)算回收率。樣品回收率測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 樣品回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Recoveries of samples

由表3 可知，該檢測(cè)方法的回收率為68.22%～114.00%。

2.8 蛋白穩(wěn)定性分析

本研究使用的Amandin 蛋白為自行從杏仁樣品中提取，其能否長(zhǎng)期保存并用于檢測(cè)，需要通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)定進(jìn)行評(píng)估，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

圖5 Amandin 蛋白穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Stability of Amandin

由圖5 可知，37 ℃和4 ℃分別保存一周后的蛋白性質(zhì)相差不大，其變異系數(shù)均不超過(guò)14%，這表明通過(guò)提取方法得到的Amandin 蛋白的降解速率較低、熱穩(wěn)定性較好。這對(duì)于開(kāi)發(fā)Amandin 檢測(cè)試劑盒將發(fā)揮重要作用，有助于延長(zhǎng)試劑盒的貨架期。

3 結(jié)論

本研究分離純化了杏仁過(guò)敏原Amandin 蛋白，制備了抗Amandin 蛋白多克隆抗體，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)Amandin 蛋白的方法，其靈敏度（IC50）為（0.66±0.04）μg/mL，檢出限為（0.08±0.04）μg/mL。該方法對(duì)餅干、面包和冰淇淋3 種食品的添加回收率為68.22%～114.00%。本研究為杏仁過(guò)敏原Amandin 蛋白的快速檢測(cè)、開(kāi)發(fā)商業(yè)化Amandin 檢測(cè)試劑盒提供參考。