發(fā)酵乳后酸化的影響因素及其控制措施

朱曼，李寶磊，侯保朝，洪維錬，何劍，張宇，姜毓君，滿(mǎn)朝新*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；2.國(guó)家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心，上海 201111）

發(fā)酵乳是指牛（羊）乳或乳粉經(jīng)乳酸菌發(fā)酵工藝而制成的一類(lèi)乳制品[1]，其含有豐富的活性蛋白質(zhì)、碳水化合物以及維生素和礦物質(zhì)，并且具有較高的生物利用率，對(duì)人體健康具有積極的影響，因此發(fā)酵乳在人們?nèi)粘Ｉ钪械牡匚恢饾u提高[2]。近年來(lái)，我國(guó)乳制品行業(yè)持續(xù)發(fā)展，產(chǎn)量穩(wěn)步提升。發(fā)酵乳制品雖然對(duì)人體具有積極的影響，但因其活性乳酸菌代謝活動(dòng)的持續(xù)進(jìn)行，產(chǎn)品在儲(chǔ)存、運(yùn)輸以及銷(xiāo)售過(guò)程中易產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的品質(zhì)。

后酸化是指發(fā)酵乳在發(fā)酵結(jié)束后至食用前的階段中，因乳酸菌繼續(xù)生長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)酵乳的pH 值不斷降低，出現(xiàn)過(guò)酸味甚至導(dǎo)致感官質(zhì)量下降的現(xiàn)象。后酸化除了縮短貨架期外，還會(huì)導(dǎo)致許多缺陷，例如乳清脫水、乳酸菌數(shù)量減少同時(shí)不利于益生菌在發(fā)酵乳中的穩(wěn)定性。發(fā)酵乳產(chǎn)生后酸化現(xiàn)象是制約發(fā)酵乳發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[3]。本文將通過(guò)分析導(dǎo)致后酸化的因素來(lái)揭示可能產(chǎn)生后酸化的機(jī)制，并對(duì)減弱后酸化的策略（物理、化學(xué)和微生物措施）進(jìn)行綜述，以期為減弱發(fā)酵乳后酸化提供一些可供參考的思路，為解決這一制約發(fā)酵乳制品行業(yè)的難題提供方向。

1 影響后酸化的因素

發(fā)酵乳制品的后酸化程度會(huì)受到多種因素的影響：發(fā)酵劑類(lèi)型、乳的成分、溫度和pH 值、均質(zhì)與攪拌、益生菌和益生元。

1.1 發(fā)酵劑類(lèi)型

發(fā)酵劑是指用于酸奶、奶酪、納豆和其他發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的細(xì)菌以及其他微生物的培養(yǎng)物。根據(jù)發(fā)酵途徑可分為同型發(fā)酵、兼性異型發(fā)酵和異型發(fā)酵3 種發(fā)酵類(lèi)型。

保加利亞乳桿菌是導(dǎo)致發(fā)酵乳后酸化的主要菌株。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)pH 值降低到5.0 左右時(shí)，保加利亞乳桿菌成為造成后酸化現(xiàn)象的優(yōu)勢(shì)菌株。關(guān)于后酸化對(duì)發(fā)酵乳品質(zhì)的影響因素研究發(fā)現(xiàn)，具有球菌/桿菌的高比例發(fā)酵劑的應(yīng)用可減弱發(fā)酵乳貯藏期的酸度下降程度[4]，因?yàn)楸＜永麃喨闂U菌的細(xì)胞膜或者細(xì)胞壁對(duì)乳糖酶活性具有保護(hù)作用，使乳糖酶貯藏過(guò)程中持續(xù)產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致后酸化現(xiàn)象的發(fā)生。Akgun 等[5]在研究不同的發(fā)酵劑類(lèi)型對(duì)水牛奶酸奶品質(zhì)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵劑類(lèi)型改變了水牛奶酸奶樣品在冷藏過(guò)程中的后酸化動(dòng)力學(xué)，顯著影響了冷藏過(guò)程中乳酸、乙酸和檸檬酸的產(chǎn)生。綜上，發(fā)酵劑的類(lèi)型可以影響發(fā)酵乳制品的后酸化程度，從改變發(fā)酵劑類(lèi)型的角度出發(fā)，有望找到降低后酸化現(xiàn)象的新途徑。

1.2 發(fā)酵乳的成分

酸化和酸化后的動(dòng)力學(xué)取決于不同動(dòng)物的乳、乳成分等的相互作用。羊乳在酸奶生產(chǎn)過(guò)程中表現(xiàn)出更快的酸化，在儲(chǔ)藏第29 天時(shí)，羊乳的pH 值為3.9，而牛乳與羊乳的體積比為1∶1 時(shí)的pH 值為4.1，而且羊乳的后酸化程度高于牛乳[6]。由此可以看出乳成分對(duì)發(fā)酵乳后酸化有一定的影響，羊乳后酸化程度高與羊乳中乳糖的含量有關(guān)，由于羊乳中的乳糖含量高于牛乳[7]，乳糖在儲(chǔ)藏期可繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸使得羊乳的后酸化現(xiàn)象增加。發(fā)酵前向乳中添加物質(zhì)也可改變發(fā)酵乳的后酸化程度。發(fā)酵前將胡蘿卜汁添加到脫脂乳中顯著降低發(fā)酵乳的pH 值，在貯藏期內(nèi)后酸化作用增強(qiáng)，可滴定酸含量增加，胡蘿卜汁的添加加重了后酸化，這是由于胡蘿卜汁中含有的黏性多糖等膳食纖維在發(fā)酵過(guò)程中促進(jìn)乳酸菌的增殖[8]。

個(gè)別牛奶成分的修飾尤其是蛋白質(zhì)的改變可介導(dǎo)發(fā)酵前和發(fā)酵后的酸化動(dòng)力學(xué)。在發(fā)酵前用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理脫脂奶和全脂奶（40 ℃/2 h）可降低酸奶在25 d 貯藏期內(nèi)的后酸化程度，原因是酶處理使得蛋白質(zhì)凝膠孔徑減小、蛋白質(zhì)分布規(guī)則、（γ-谷氨酸）-賴(lài)氨酸鍵的持水能力提高，從而改善了發(fā)酵乳的保水性能。同時(shí)也導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)所需的低分子量肽減少，使得產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)減緩，產(chǎn)生乳酸減少，從而降低發(fā)酵乳的后酸化[9]。因此，乳成分的種類(lèi)、乳中添加的物質(zhì)以及乳成分的改變都會(huì)影響發(fā)酵乳的后酸化。

1.3 溫度

發(fā)酵溫度可能通過(guò)影響微生物生長(zhǎng)來(lái)影響發(fā)酵乳的后酸化程度。Sanusi 等[10]的研究表明，相較于低發(fā)酵溫度（39 ℃）的復(fù)合發(fā)酵乳，較高發(fā)酵溫度（41～43 ℃）的復(fù)合發(fā)酵乳酸化速率提高。除了發(fā)酵溫度外，冷藏溫度對(duì)發(fā)酵乳后酸化的控制也起到關(guān)鍵的作用。發(fā)酵乳在后發(fā)酵過(guò)程中迅速冷卻至冷藏條件（＜10 ℃），是通過(guò)限制發(fā)酵劑的代謝活性來(lái)控制其最終pH 值（4.0～4.4）的最關(guān)鍵因素。但是由于微生物的殘留活性，此方法仍然無(wú)法防止后酸化。低溫可以抑制發(fā)酵乳中微生物的活性，降低微生物發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸的能力；高溫則能增強(qiáng)微生物發(fā)酵乳糖產(chǎn)生乳酸的能力，從而加重發(fā)酵乳后酸化的程度。

1.4 均質(zhì)和攪拌

發(fā)酵乳生產(chǎn)過(guò)程中，一般在溫度55～65 ℃、壓力10～18 MPa 的條件下對(duì)牛奶進(jìn)行均質(zhì)處理，使得脂肪球的大小減小，從而增加了脂肪與其他成分（如酪蛋白和乳清蛋白）之間的接觸面積。這使得脂肪能夠更好地結(jié)合到蛋白質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)中，脂肪的結(jié)合能力增強(qiáng)，從而在酸化過(guò)程中能更好地保持脂肪與酪蛋白和乳清蛋白的結(jié)合，從而更好地改善乳的凝膠特性[11]。冷凍/解凍的發(fā)酵乳的后酸化更為嚴(yán)重，Tribst 等[12]研究表明，均質(zhì)后的發(fā)酵乳在貯藏28 d 時(shí)的酸度值較未均質(zhì)發(fā)酵乳有所降低。Sert 等[13]的研究表明高壓均質(zhì)后的綿羊奶酸奶酸化速率提高，并在貯藏第14 天和第28 天時(shí)，經(jīng)過(guò)均質(zhì)后的綿羊奶發(fā)酵乳的pH 值降低。雖然以上的研究表明均質(zhì)對(duì)發(fā)酵乳的后酸化有一定的作用，但是出現(xiàn)了不同的影響效果，均質(zhì)工藝對(duì)后酸化的影響可能基于不同的基質(zhì)和發(fā)酵體系表現(xiàn)出不同的影響作用，仍需要展開(kāi)進(jìn)一步的探究。

按照組織狀態(tài)和制備方法，發(fā)酵乳分為攪拌型和凝固型兩種類(lèi)型。相較于在容器中發(fā)酵的凝固型發(fā)酵乳來(lái)說(shuō)，攪拌型發(fā)酵乳具有高黏度以及光滑的質(zhì)地[14]。將凝固型酸奶轉(zhuǎn)化為攪拌型酸奶后，顯示出更好的保水能力，但由于攪拌型凝膠在冷藏后酸化過(guò)程中能夠恢復(fù)其結(jié)構(gòu)，因此質(zhì)地粗糙且呈顆粒狀。

1.5 益生菌和益生元

益生菌是通過(guò)定殖在人體內(nèi)從而改變宿主某一部位菌群組成的一類(lèi)活性微生物，益生菌數(shù)量充足時(shí)能夠促進(jìn)宿主的身體健康。發(fā)酵乳制品中添加益生菌不僅能夠提供充足的營(yíng)養(yǎng)，還可在發(fā)酵階段促進(jìn)益生菌的生長(zhǎng)。Zhang 等[15]的研究表明LactobacillusplantarumK25 和酸奶發(fā)酵劑制成的益生菌發(fā)酵乳比僅用酸奶發(fā)酵劑制成的發(fā)酵乳風(fēng)味好，且添加益生菌后該發(fā)酵乳在冷藏過(guò)程中后酸化程度降低。添加Lactobacillusacidophilus（DD910）和Bifidobacteriumlactis（DD920）降低了酸奶貯藏過(guò)程中乳酸的形成，在一定程度上降低酸奶后酸化程度[16]。單一益生菌或多種益生菌組合在貯藏過(guò)程中表現(xiàn)出不確定的pH 值變化，但對(duì)降低發(fā)酵乳后酸化程度有一定的效果。

益生元是指一些不被宿主消化吸收卻能有選擇性地促進(jìn)其體內(nèi)有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而改善宿主健康的有機(jī)物質(zhì)，包括功能性低聚糖類(lèi)、多糖類(lèi)等，其中功能性低聚糖類(lèi)是最常見(jiàn)的益生元。Yang 等[17]研究表明添加0.1%委陵菜多糖（Potentillaanserinepolysaccharide，PAP）可延緩牦牛酸奶在儲(chǔ)存過(guò)程中的后酸化過(guò)程。有研究表明益生元參與放大發(fā)酵行為和后酸化速率。乳果糖與益生菌共培養(yǎng)提高發(fā)酵脫脂乳的品質(zhì)，與不添加乳果糖的對(duì)照發(fā)酵相比，在脫脂乳中添加乳果糖增加了所有益生菌的數(shù)量，提高發(fā)酵乳的酸化速率和乳酸酸度，同時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間并降低了冷藏結(jié)束1～35 d 的pH 值[18]。綜上所述，益生元可以放大發(fā)酵乳制品中的后酸化，主要是因?yàn)樗鼈儽惶囟ǖ囊嫔赀x擇性利用。

2 后酸化的產(chǎn)生機(jī)制

乳酸菌等細(xì)菌在酸奶等酸性環(huán)境中主要是通過(guò)從細(xì)胞中排出H+來(lái)維持pH 值穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)外界環(huán)境的pH 值低于胞內(nèi)正常范圍的pH 值且不超過(guò)一定程度時(shí)，乳酸菌能夠依靠自身的耐酸機(jī)制抵御外界的干擾。但當(dāng)環(huán)境介質(zhì)的pH 值過(guò)低時(shí)，乳酸菌的耐酸機(jī)制可能無(wú)法有效應(yīng)對(duì)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的pH 值穩(wěn)態(tài)無(wú)法維持，這會(huì)影響其正常的新陳代謝過(guò)程。細(xì)胞的新陳代謝紊亂會(huì)導(dǎo)致重要的生物化學(xué)反應(yīng)受阻，細(xì)胞無(wú)法正常運(yùn)作。如果pH 值過(guò)低的環(huán)境持續(xù)存在，最終導(dǎo)致乳酸菌死亡。乳桿菌用以維持細(xì)胞內(nèi)pH 值穩(wěn)態(tài)的主要機(jī)制是谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）機(jī)制和FoF1-三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）。

2.1 GAD

GAD 系統(tǒng)是乳桿菌維持胞內(nèi)pH 值穩(wěn)態(tài)的有效途徑之一，谷氨酸脫羧酶是GAD 系統(tǒng)的核心酶，可以催化谷氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），GABA 在反向運(yùn)輸系統(tǒng)作用下運(yùn)至細(xì)胞外，使得細(xì)胞內(nèi)H+減少，pH 值升高，維持細(xì)胞內(nèi)pH 值穩(wěn)態(tài)。因?yàn)镠+被排到外界環(huán)境中，從而使得外界環(huán)境的pH 值下降，導(dǎo)致發(fā)酵乳制品后酸化的產(chǎn)生[19]。

有研究表明：添加轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TG）的低脂發(fā)酵乳中，TG 能夠減慢發(fā)酵乳的后酸化過(guò)程[20]。同樣，Chr Lorenzen 等[9]的研究也表明了TG酶和嗜熱酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵的發(fā)酵乳在儲(chǔ)藏期間的后酸化程度較低。TG 對(duì)菌株的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，因此在發(fā)酵乳中添加TG 可抑制保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)，降低發(fā)酵乳的后酸化[21]。TG 具有促使蛋白質(zhì)水解的功能，使得菌株因營(yíng)養(yǎng)缺乏生長(zhǎng)受到阻礙，使得發(fā)酵乳在貯藏期后酸化程度降低。但是發(fā)酵菌株本身不能生產(chǎn)TG，僅能通過(guò)人為添加，這也無(wú)形之中增加了產(chǎn)品生產(chǎn)的成本。

2.2 FoF1-ATPase

在FoF1-ATPase 中，F(xiàn)1部分位于細(xì)胞質(zhì)側(cè)，其α、β、γ、δ、ε 5 類(lèi)亞基共同形成一個(gè)結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)在酶催化二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）和無(wú)機(jī)磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿姿嵯佘眨╝denosine triphosphate，ATP）的過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。而Fo部分則嵌入在細(xì)胞膜中，它由a、b、c 3 個(gè)亞基組成，形成一個(gè)質(zhì)子通道，負(fù)責(zé)質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)。

當(dāng)乳酸菌處于低pH 值環(huán)境時(shí)，F(xiàn)oF1-ATPase 會(huì)增加其酶活性，通過(guò)排出胞內(nèi)的H+來(lái)提高活力，并維持跨膜pH 值梯度。這個(gè)跨膜pH 值梯度對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定非常重要，它參與調(diào)控多種細(xì)胞功能和代謝過(guò)程。然而，當(dāng)胞內(nèi)pH 值進(jìn)一步下降時(shí)，F(xiàn)oF1-ATPase 的酶活性也會(huì)急劇下降。這可能是由于胞內(nèi)pH 值低迫使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其催化能力降低。當(dāng)FoF1-ATPase 活性下降，乳酸菌可能無(wú)法有效排出H+，維持跨膜pH 值梯度，這會(huì)對(duì)胞內(nèi)pH 值平衡產(chǎn)生一定的影響，并可能進(jìn)一步影響細(xì)胞的代謝和生存能力[22]。而質(zhì)子轉(zhuǎn)移ATP 酶（plasma membrane ATPase，H+-ATPase）活性作為可逆的離子轉(zhuǎn)位泵，催化氫離子穿過(guò)細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的pH 值保持中性，導(dǎo)致發(fā)酵乳后酸化的產(chǎn)生。因此，很多學(xué)者通過(guò)篩選具有低H+-ATPase 活性的保加利亞乳桿菌來(lái)作為發(fā)酵菌株，以此來(lái)降低發(fā)酵乳制品在貯存期間的后酸化。

3 后酸化的控制措施

發(fā)酵乳在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程中的冷藏溫度（2～10 ℃）是防止后酸化的首要步驟。但是資源貧乏的國(guó)家和地區(qū)對(duì)制冷條件無(wú)法持續(xù)維持，本文將對(duì)除了制冷條件外的后酸化的控制措施進(jìn)行闡述，并將其分為三大類(lèi)：物理措施、化學(xué)措施以及生物措施（見(jiàn)圖1）。

圖1 適用于發(fā)酵乳制品的控制措施Fig.1 Control measures applicable to fermented dairy products

3.1 物理措施

3.1.1 熱處理

熱處理是在乳制品加工過(guò)程中使用的一種常見(jiàn)方法，通過(guò)高溫短時(shí)間的加熱，可以有效殺死存在于發(fā)酵乳中的有害菌。高溫也會(huì)對(duì)乳酸菌產(chǎn)生一定的影響，使部分乳酸菌失去活性，從而防止酸度的持續(xù)增加，又可延長(zhǎng)發(fā)酵乳的貨架期，在控制發(fā)酵乳后酸化的發(fā)生中得到廣泛應(yīng)用，但是熱處理的時(shí)間和溫度必須根據(jù)產(chǎn)品的需求來(lái)使用。楊新堯等[23]在58 ℃下熱處理發(fā)酵乳4 min，顯著地改善發(fā)酵乳在冷鏈缺失狀況下的后酸化，降低發(fā)酵乳在貯藏過(guò)程中的后酸化水平。吳彤等[24]以不同的熱處理?xiàng)l件對(duì)凝固型酸乳進(jìn)行處理，酸乳溫度從70 ℃升高到95 ℃可以降低貯存24 h 和21 d時(shí)的pH 值，從而降低酸乳后酸化的水平。有些研究通過(guò)對(duì)益生菌進(jìn)行輕度熱脅迫處理來(lái)控制菌株帶來(lái)的后酸化，通過(guò)短時(shí)間的高溫處理，可以降低益生菌的活性，減少其在酸乳中的代謝活動(dòng)，從而降低后酸化的風(fēng)險(xiǎn)。Zhang 等[25]研究發(fā)現(xiàn)輕度熱脅迫處理（46 ℃，1 h）可通過(guò)降低Lactobacillusrhamnosushsryfm 1301 的代謝和增殖來(lái)限制其引起的后酸化。雖然，經(jīng)熱處理的發(fā)酵乳保存良好，也避免了后酸化，但受限于消費(fèi)者對(duì)產(chǎn)品中有益微生物活性的需求。因此，采用熱處理來(lái)控制后酸化需要進(jìn)一步的探索。

3.1.2 脈沖電場(chǎng)

脈沖電場(chǎng)（pulsed electric fields，PEF）是一種新型的非熱食品殺菌技術(shù)，以較高的電場(chǎng)強(qiáng)度（10～50 kV/cm）作為電脈沖通過(guò)食物傳導(dǎo)到微生物細(xì)胞膜上，引起電穿孔，在一定強(qiáng)度下造成不可逆的細(xì)胞膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和細(xì)胞死亡[26]。盡管PEF 的發(fā)展?jié)摿艽?，但僅限于沒(méi)有任何氣泡的液體食品，且取決于PEF 參數(shù)、培養(yǎng)基組成和細(xì)胞類(lèi)型、食物特性（pH 值、離子強(qiáng)度、抗菌性）[27]。用S.thermophilusDIL 5218 和L.delbrueckiisubsp.bulgaricusDSMZ 20081 酸化的重組脫脂乳顯示，與未經(jīng)PEF 處理的樣品相比，PEF 處理的樣品酸化速度加快12 min，氧化還原電位急劇下降。PEF 樣品中發(fā)酵速率的提高是由于培養(yǎng)細(xì)胞的電滲透作用，從而增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，縮短了延滯期[27]。Stühmeier-Niehe 等[28]的研究表明經(jīng)PEF 處理的培養(yǎng)物比未經(jīng)PEF 處理的培養(yǎng)物的發(fā)酵延滯期平均縮短22 min，對(duì)發(fā)酵劑進(jìn)行PEF 預(yù)處理，通過(guò)降低pH 值滯后期導(dǎo)致酸化的顯著加速。綜合以上研究，為了在發(fā)酵乳生產(chǎn)中成功應(yīng)用PEF，通過(guò)優(yōu)化操作參數(shù)和試驗(yàn)方案，在確保控制發(fā)酵乳后酸化的同時(shí)，最大程度地發(fā)揮益生效果，提高產(chǎn)品質(zhì)量和生理功效。

3.1.3 二氧化碳（CO2）處理

CO2具有可溶于水并與水反應(yīng)生成碳酸的性質(zhì)，從而抑制一些不耐酸微生物的生長(zhǎng)，達(dá)到防腐、延長(zhǎng)貨架期的作用。研究表明，向液態(tài)乳中充入適量CO2，可延長(zhǎng)其保質(zhì)期：1）與普通牛奶相比，CO2牛奶在pH 4.95 和pH5.40 處有2 個(gè)緩沖的極值峰，在pH 5.10處有1 個(gè)峰值。2）高密度CO2（dense phase carbon dioxide，DPCD）以通過(guò)加壓CO2或者超臨界CO2的分子效應(yīng)來(lái)滅活牛奶中廣泛存在的細(xì)菌和真菌的營(yíng)養(yǎng)型和內(nèi)生孢子型。

在高壓狀態(tài)下，CO2分子溶解在微生物細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層中，導(dǎo)致細(xì)胞膜中的脂質(zhì)物質(zhì)被提取出來(lái)，進(jìn)而增加了膜的流動(dòng)性和通透性。同時(shí)，在壓力作用下，CO2可以降低細(xì)胞內(nèi)的pH 值，使與糖代謝相關(guān)的酶鈍化，減弱乳酸菌產(chǎn)生乳酸的能力，進(jìn)而能夠?qū)崿F(xiàn)降低發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象的目的。特別是對(duì)于發(fā)酵乳，使用CO2處理的牛奶，酸奶的保質(zhì)期延長(zhǎng)至4 個(gè)月，而未碳化的樣品在30 d 內(nèi)變質(zhì)[29]。同樣，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的發(fā)酵乳在CO2處理后的乳酸產(chǎn)量略低。

3.1.4 超聲處理

超聲（ultrasound，US）也是一種非加熱的技術(shù)，不僅可以保留營(yíng)養(yǎng)，還可以延長(zhǎng)保質(zhì)期和提高乳制品的品質(zhì)。高強(qiáng)度的超聲波可以提高用于發(fā)酵的發(fā)酵劑的益生菌株的活力，也可以釋放酶和產(chǎn)酸來(lái)刺激乳糖水解，從而縮短發(fā)酵的時(shí)間[30]。Delgado 等[31]發(fā)現(xiàn)US 處理降低了酸奶貯藏28 d 內(nèi)的后酸化，并且US 處理6 min 時(shí)，發(fā)酵乳后酸化的降低程度較顯著。US 處理可以破壞β-半乳糖苷酶的活性，從而降低酸奶的后酸化程度。研究表明未經(jīng)過(guò)US 處理的酸奶，酸化至pH2.0可導(dǎo)致酶活性快速并永久喪失。在pH4.0（接近酸奶的自然pH 值）條件下，酶的活性至少穩(wěn)定60 min。對(duì)超聲酸奶進(jìn)行體外酸化處理，即使在pH4.0 的條件下，也會(huì)導(dǎo)致酶的活性快速永久損失，60 min 后僅剩20%的酶活。在較低的pH 值下培養(yǎng)，活性完全喪失[32]。同樣，US 處理對(duì)乳酸菌代謝活動(dòng)產(chǎn)生刺激作用，從而縮短發(fā)酵時(shí)間；對(duì)L.plantarumA3 產(chǎn)酸能力的抑制作用（10 min，600 W，33 kHz，20 ℃），成功實(shí)現(xiàn)了（后）發(fā)酵過(guò)程中的酸化調(diào)控，以緩解后酸化問(wèn)題或提高工藝效率[33]。此外，與傳統(tǒng)均質(zhì)化相比，低頻（20～100 kHz）高強(qiáng)度（10～1 000 W/cm2）超聲具有投入少且易于清潔的優(yōu)點(diǎn)。

低水平的US 處理導(dǎo)致β-半乳糖苷酶釋放，刺激乳糖水解和半乳糖的轉(zhuǎn)化，而乳糖和半乳糖的轉(zhuǎn)化會(huì)增加發(fā)酵液中的可用碳源，從而加速乳酸生成速率，導(dǎo)致酸化加快和酸度過(guò)高，在發(fā)酵乳的后續(xù)酸化過(guò)程中不利于酸度的控制[34]。較高水平的US 處理可能造成細(xì)胞膜的物理破壞，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄。乳酸菌的大量死亡會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵乳的后續(xù)酸化能力降低和失去益生效果。因此采用US 處理控制后酸化，要精確量化和控制工藝參數(shù)。

3.1.5 輻照技術(shù)

輻照技術(shù)是一種非熱加工技術(shù)，γ 射線（1～10 kGy）輻照酸奶在4、20、35℃均能延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期，且對(duì)感官性狀、氨基酸含量等均無(wú)不良影響，降低過(guò)敏性[35]。在研究輻照殺菌技術(shù)對(duì)發(fā)酵乳的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中的乳酸菌數(shù)量與輻照劑量反比，在一定程度上降低后酸化的產(chǎn)生[36]。但是輻照技術(shù)在發(fā)酵乳中的應(yīng)用存在一定的爭(zhēng)議，同時(shí)有關(guān)輻照酸奶的法律在輻照食品的法律中也是非常多樣化的。

3.2 化學(xué)措施

3.2.1 添加化學(xué)添加劑

通過(guò)使用商業(yè)批準(zhǔn)的化學(xué)品限制菌株的生長(zhǎng)來(lái)控制后酸化，從而提高發(fā)酵產(chǎn)品的保質(zhì)期是普遍采用的做法。山梨酸和苯甲酸及其鹽類(lèi)對(duì)真菌和大部分細(xì)菌有抑制作用，因此常用這兩類(lèi)化學(xué)品進(jìn)行后酸化的控制。但是苯甲酸進(jìn)入人體后，能與人體內(nèi)氨基乙酸化合生成馬尿酸，還能與人體內(nèi)的葡萄糖醛酸結(jié)合生成葡萄糖苷酸而隨尿液排出體外，因此相較于山梨酸及其鹽類(lèi)，苯甲酸及其鹽類(lèi)對(duì)人體有一定的毒副作用。山梨酸鉀通過(guò)抑制參與碳水化合物和檸檬酸鹽利用的關(guān)鍵代謝酶如乳酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、延胡索酸酶等來(lái)抑制微生物生長(zhǎng)。張小濤等[37]發(fā)現(xiàn)采用0.35%的山梨酸鉀可控制山竹風(fēng)味酸乳。同樣，在控制紅棗酸羊乳的后酸化時(shí)，發(fā)現(xiàn)添加0.3%的山梨酸鉀可有效抑制后酸化現(xiàn)象[38]。

不僅山梨酸鉀能夠控制后酸化現(xiàn)象，銅在抑制發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象時(shí)也有一定的作用。Zhang 等[39]發(fā)現(xiàn)LDB_RS05285 是L.delbrueckiisubsp.BulgaricusATCC11842 后酸化的特異性基因，在其基因表達(dá)上調(diào)后有效抑制酸奶的后酸化。Wang 等[40]發(fā)現(xiàn)2.5 mg/L的Cu2+能上調(diào)LDB_RS05285 的基因表達(dá)。銅可以在不影響酸奶品質(zhì)的情況下有效控制酸奶的過(guò)度酸化，改善酸奶的風(fēng)味。銅還可以促進(jìn)乳糖的水解，富集半乳糖和葡萄糖（從而抑制乳酸的產(chǎn)生），增加L-異亮氨酸、苯丙氨酸和3-甲基丁醛苯甲醛的豐度，有助于酸奶整體風(fēng)味的形成。此外，發(fā)酵前向全脂牛奶中添加1.25 mg/kg 的Cu2+可有效減緩發(fā)酵乳的后酸化，并對(duì)發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵菌株嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)均無(wú)顯著影響[41]。但是由于消費(fèi)者對(duì)添加劑的認(rèn)識(shí)不足，限制其在增強(qiáng)貨架期和控制后酸化現(xiàn)象中的應(yīng)用。

3.2.2 細(xì)菌素

細(xì)菌素是由細(xì)菌核糖體合成的具有抗菌活性的多肽，通常對(duì)鄰近細(xì)菌具有抑制作用[42]。許多人類(lèi)微生物能夠產(chǎn)生細(xì)菌素，據(jù)報(bào)道，細(xì)菌素與人類(lèi)健康密切相關(guān)，如促進(jìn)腸道菌群平衡、抑制外來(lái)致病菌入侵等[43]。

細(xì)菌素作為食品添加劑在后酸化調(diào)控中具有廣泛的應(yīng)用前景，可以有效延長(zhǎng)食品保質(zhì)期并提供其他功能。乳酸鏈球菌素、片球菌素、腸球菌素和乳酸菌素是目前較為常見(jiàn)的細(xì)菌素類(lèi)型。Hussien 等[44]研究表明2%菊糖、2%低聚果糖和嗜酸乳桿菌細(xì)菌素結(jié)合可將酸奶的保質(zhì)期延長(zhǎng)5 周以上。邱爽等[45]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)添加終濃度為28 mg/mL bifidocin A 到凝固型酸奶中可替代乳酸鏈球菌素，使得凝固型酸奶貯存過(guò)程中后酸化的程度得到一定的抑制。同樣，研究表明產(chǎn)細(xì)菌素LactobacillusplantarumQ7 對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，在酸奶貯藏期具有緩解后酸化的效果[46]。并且添加細(xì)菌素的樣品活菌數(shù)減少，有效地解決發(fā)酵乳后酸化的問(wèn)題。雖然細(xì)菌素對(duì)抑制后酸化現(xiàn)象有一定的效果，但是考慮到添加的細(xì)菌素可能具有細(xì)胞毒性，因此在對(duì)細(xì)菌素進(jìn)行安全性評(píng)估方面應(yīng)給予更多的關(guān)注。

3.3 生物措施

3.3.1 誘變育種

誘變育種是利用物理或化學(xué)方法處理菌株，使突變頻率和數(shù)量增加以獲得突變體，并通過(guò)采取有效的方法從突變體中篩選出所需目的菌株。誘變育種是延緩發(fā)酵乳發(fā)生后酸化的方法之一，常用的誘變方法主要有3 種：物理誘變、化學(xué)誘變和復(fù)合誘變。3 種誘變方法對(duì)發(fā)酵乳制品后酸化的影響如表1所示。

表1 3 種誘變育種對(duì)發(fā)酵乳后酸化的影響Table 1 Effects of three mutation breeding methods on post-acidification of fermented milk

物理誘變育種是通過(guò)一系列物理方法[如紫外線、微波、常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma mutagenesis，ARTP）等]對(duì)菌株進(jìn)行誘變，以獲得具備特定形狀的突變菌，并通過(guò)篩選找出符合預(yù)期目標(biāo)的變異菌株。周虹瑾等[47]采用ARTP 對(duì)菌株進(jìn)行誘變，用新霉素篩選出低H+-ATPase 活性的突變菌株，其中突變菌株BJT-7 經(jīng)全脂牛乳發(fā)酵在20 d儲(chǔ)藏期間幾乎無(wú)明顯酸度上升，并且具有較好的遺傳穩(wěn)定性。同樣，有研究表明通過(guò)低能N+注入對(duì)保加利亞乳桿菌DL1 進(jìn)行誘變后，經(jīng)過(guò)青霉素篩選，獲得一株后酸化能力較弱的突變菌株DL1-3。與出發(fā)菌株DL1 相比，突變菌株DL1-3 在25 ℃條件下貯藏后，后酸化程度降低18.8%，且在42 ℃條件下發(fā)酵脫脂乳的產(chǎn)酸能力差異較小，并可穩(wěn)定遺傳[49]。

化學(xué)誘變育種是通過(guò)使用一定劑量的誘變劑（如化學(xué)試劑或者是化學(xué)藥物），干擾DNA 復(fù)制或者損傷DNA，來(lái)引起生長(zhǎng)良好的菌株發(fā)生突變，從而改變其生長(zhǎng)及其發(fā)酵特征。Wang 等[53]從新霉素誘變的德氏乳桿菌保加利亞亞種成功分離到2 株H+-ATPase 缺陷變種，突變菌株的H+-ATPase 活性分別降低了51.3% 和34.3%，其生長(zhǎng)情況以及產(chǎn)酸能力較原始菌株明顯減弱。將突變菌株接種于發(fā)酵乳中，結(jié)果表明發(fā)酵乳在貯藏過(guò)程中的后酸化現(xiàn)象被顯著抑制。張祥等[54]利用硫酸新霉素誘變L.plantarumZUST 菌株，篩選出兩株低H+-ATPase 活性植物乳桿菌，從而使突變菌的產(chǎn)酸能力下降，對(duì)緩解后酸化現(xiàn)象有一定的作用。同樣，使用硫酸新霉素誘變的L.delbrueckiissp.BulgaricusND06的突變菌株ND06-2 具有較低的H+-ATPase 活性，其在發(fā)酵或者儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生乳酸的能力明顯低于原始菌株[50]。楊玲等[55]也是用硫酸新霉素誘變，獲得1 株弱后酸化LactobacillushelveticusL551-1。與原始菌株比，L551-1 延遲了發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)酸時(shí)間，同時(shí)使得發(fā)酵結(jié)束時(shí)的酸度更容易控制，L551-1 發(fā)酵乳貨架期后酸化問(wèn)題得到顯著改善。

復(fù)合誘變是將兩種以上的方法進(jìn)行結(jié)合，相較于單一誘變的方法，復(fù)合誘變可以彌補(bǔ)單一誘變的缺陷。李學(xué)叢[52]對(duì)LactobacilluscaseiN1115 進(jìn)行紫外誘變和硫酸二乙酯誘變，采用新霉素進(jìn)行篩選，誘變菌株C1可延長(zhǎng)發(fā)酵乳冷藏期間保質(zhì)期5 d 左右，并且能很好地改善原菌株N1115 的感官品質(zhì)。誘變育種雖然能在短時(shí)間內(nèi)得到具有弱后酸化的突變菌株，但是在突變過(guò)程中容易出現(xiàn)突變性狀不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)突變逆轉(zhuǎn)到原始狀態(tài)的情況。

誘變育種方法可以改變菌株的性狀，延緩發(fā)酵乳的后酸化。通過(guò)增加突變頻率和數(shù)量，可以獲得更適合生產(chǎn)需求的菌株，以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。但需要注意的是，在誘變過(guò)程中，需要對(duì)處理?xiàng)l件進(jìn)行仔細(xì)控制，以確保獲得安全和有效的突變體。

3.3.2 改變發(fā)酵劑比例和組成

發(fā)酵劑是發(fā)酵乳發(fā)酵的基礎(chǔ)，其在發(fā)酵完成后同樣可代謝產(chǎn)生乳酸，造成后酸化現(xiàn)象。為了降低發(fā)酵乳的后酸化現(xiàn)象，研究者們采用改變發(fā)酵劑組成的策略，即從改變發(fā)酵劑的組成和比例兩個(gè)方向入手，來(lái)抑制發(fā)酵乳制品的后酸化現(xiàn)象。Settachaimongkon 等[56]對(duì)L.plantarumWCFS1 在亞致死脅迫（NaCl 升高和pH值較低）條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，將亞致死預(yù)培養(yǎng)的LPWCFS1 與傳統(tǒng)酸奶發(fā)酵劑共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)添加亞致死預(yù)培養(yǎng)的LP-WCFS1 顯著抑制了保加利亞乳桿菌亞種的存活，從而減少了冷藏期間酸奶的后酸化。杜昭平等[57]的研究表明在發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中適當(dāng)提高球桿菌比例，有利于減弱發(fā)酵乳后酸化的現(xiàn)象。綜上，改變發(fā)酵劑的比例和組成能在一定程度上降低發(fā)酵乳制品的后酸化現(xiàn)象。

3.3.3 基因工程

基因工程是在基因水平上對(duì)發(fā)酵劑進(jìn)行改造，通過(guò)這種方法來(lái)達(dá)到降低發(fā)酵乳后酸化現(xiàn)象的目的。基因工程經(jīng)常被應(yīng)用于所需功能的乳酸菌的生物技術(shù)升級(jí)。與誘變育種相比，基因工程能夠跨越難以突破的物種界限，有目的地改變?nèi)樗峋蛱卣?，以獲取具有穩(wěn)定遺傳特性的突變菌株。李晨等[58]使用帶有ISS1的載體pGhost9：ISS1 引入到保加利亞乳桿菌中，經(jīng)復(fù)制型轉(zhuǎn)座后獲得了3 株抗后酸化的突變菌株，并且得到的菌株突變性狀穩(wěn)定。Zhang 等[59]評(píng)估了69 個(gè)后酸化候選基因與不同保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸奶酸度變化的相關(guān)性，從而篩選出用于后酸化的生物標(biāo)志物L(fēng)DB_RS00370，并通過(guò)此標(biāo)記物篩選發(fā)現(xiàn)100 mg/kg的煙酸可抑制發(fā)酵乳的后酸化。但是基因操作可能會(huì)使菌種間的劃分界限變得模糊，使得對(duì)發(fā)酵劑中菌種的鑒定不精確。因此，基因工程技術(shù)在抑制發(fā)酵乳制品后酸化現(xiàn)象中的應(yīng)用還需要進(jìn)一步的探究。

4 總結(jié)與展望

發(fā)酵乳因其獨(dú)特的口感和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值備受消費(fèi)者的青睞，但后酸化現(xiàn)象破壞了保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵乳的品質(zhì)，制約了發(fā)酵乳的銷(xiāo)售和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。本文闡述了發(fā)酵乳后酸化與發(fā)酵劑類(lèi)型、乳的成分、溫度和pH值、均質(zhì)和攪拌、益生菌和益生元等因素有關(guān)，并討論了其后酸化的產(chǎn)生機(jī)制以及控制措施。在不影響發(fā)酵乳的流變、感官性狀以及貨架期的情況下，本文中討論的各種策略可以單獨(dú)或者聯(lián)合應(yīng)用，來(lái)防止后酸化的現(xiàn)象。但是，每種方法都有自己的優(yōu)缺點(diǎn)。發(fā)酵乳的熱處理雖然延長(zhǎng)了發(fā)酵乳的貨架期，減少了后酸化，但由于失去了不耐熱的生物活性肽和有益微生物，不適合作為功能性發(fā)酵產(chǎn)品。研究發(fā)現(xiàn)，CO2添加有助于延長(zhǎng)發(fā)酵乳制品的貨架期和延緩酸的形成，但其對(duì)感官特性和后酸化的平行影響尚未見(jiàn)報(bào)道。新興的非熱技術(shù)（超聲、輻照等）需要進(jìn)一步探索其對(duì)發(fā)酵乳或者人體是否有不利影響以及制定更加完整、有效的監(jiān)管審批。細(xì)菌素在酸奶中的直接摻入因其高昂的純化成本和在食品基質(zhì)中的穩(wěn)定性而受到阻礙。添加防腐劑比添加細(xì)菌素的成本更加低廉，但是必須通過(guò)安全評(píng)價(jià)的驗(yàn)證。進(jìn)行誘變育種雖然是緩解后酸化現(xiàn)象的一個(gè)途徑，但是一定要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的篩選，同時(shí)還要防止突變的菌株出現(xiàn)性狀的退化或者是逆轉(zhuǎn)到原來(lái)性狀。

未來(lái)有望通過(guò)以下方法來(lái)緩解后酸化：1）通過(guò)誘導(dǎo)成分變化來(lái)增強(qiáng)緩沖能力，即通過(guò)膜過(guò)濾來(lái)調(diào)整牛奶中的蛋白質(zhì)/乳糖比例，從而開(kāi)發(fā)用于制造溫和風(fēng)味發(fā)酵產(chǎn)品的牛奶。2）使用包裹GRAS 抗菌劑的pH 值敏感凝膠，以便在達(dá)到所需pH 值后允許抗菌藥物的持續(xù)釋放。3）探究允許的/天然添加劑對(duì)后酸化的影響，同時(shí)結(jié)合經(jīng)濟(jì)有效的加工方法進(jìn)行嘗試。

總之，對(duì)于所討論的技術(shù)需要進(jìn)一步的努力，以開(kāi)發(fā)緩解后酸化現(xiàn)象且不影響其理化性狀的產(chǎn)品，并將其轉(zhuǎn)化為工業(yè)化生產(chǎn)。希望該文能夠?yàn)槲磥?lái)制定新的成本低且效益高的策略來(lái)緩解發(fā)酵乳后酸化的相關(guān)工作提供參考。