脂肪酶固定化技術(shù)的研究進(jìn)展

梅玲，李道明

（陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西西安 710021）

目前，綠色化學(xué)是大多數(shù)化工行業(yè)發(fā)展的最終目標(biāo)[1]。與此同時，人們對環(huán)境保護(hù)和綠色生產(chǎn)的關(guān)注日益增加。在這種背景下，酶作為一種高效、綠色的生物催化劑被廣泛使用。脂肪酶作為重要的工業(yè)用酶廣泛應(yīng)用于食品加工、油脂改性、生物柴油制備、手性化合物拆分等方面[2]。雖然脂肪酶在工業(yè)上有著巨大的應(yīng)用潛能，但大多數(shù)游離脂肪酶獲取成本高、操作穩(wěn)定性低，且在有機(jī)相中不溶解，反應(yīng)過程中容易結(jié)塊，大大降低了酶的利用率，酶回收和再利用困難[3]，導(dǎo)致脂肪酶的應(yīng)用成本高。而脂肪酶固定化形態(tài)在多種性質(zhì)上均優(yōu)于游離態(tài)。酶經(jīng)固定化后，其具有穩(wěn)定性高、易回收、可反復(fù)使用、成本低等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此，酶固定化技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生并不斷發(fā)展。圖1 為游離酶和固定化酶應(yīng)用于催化反應(yīng)時的示意圖。

圖1 游離酶和固定化酶反應(yīng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of reaction of free enzyme and immobilized enzyme

酶的固定化技術(shù)是指將游離酶束縛在一定空間或完全附著在一定的載體上，從而限制游離酶自由流動，使其長時間發(fā)揮催化作用并可回收利用的生物技術(shù)[5]。它是一種常用、有效、便捷的生物酶修飾手段，對酶的催化活性和操作穩(wěn)定性具有極大的改善和提升作用[5]。

我國對酶的固定化技術(shù)研究始于20世紀(jì)60年代，20世紀(jì)80年代以后固定化脂肪酶在食品加工、生物能源、生物醫(yī)藥等方面的應(yīng)用也越來越廣泛[6]。傳統(tǒng)的脂肪酶固定化技術(shù)經(jīng)過幾十年的發(fā)展，在改善酶的催化特性上取得了一些成果，但仍受到適用范圍小、成本較高、產(chǎn)品分離困難等因素的限制。因此，在較為成熟的傳統(tǒng)固定化技術(shù)基礎(chǔ)上，研究者們對新型固定化技術(shù)進(jìn)行了大量的研究與創(chuàng)新，形成了以固定化載體和固定化方式為核心的新型固定化技術(shù)。

本文圍繞脂肪酶的傳統(tǒng)及新型固定化方法以及固定化對酶性質(zhì)的影響等方面進(jìn)行概述，對其進(jìn)行了總結(jié)與展望，以期為推動脂肪酶固定化技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

1 脂肪酶來源

自然界中的脂肪酶普遍存在于動植物的各種組織及多種微生物中[7]。自1834年關(guān)于兔胰脂肪酶的報道至今，有關(guān)脂肪酶的研究已有近200年的歷史[8]。植物中的脂肪酶主要存在于油脂豐富的油料作物種子中（如油菜籽、花生、大豆）[9]；動物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織等[10]；在微生物中，脂肪酶的含量更為豐富。20世紀(jì)初研究人員首次發(fā)現(xiàn)了微生物脂肪酶[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)脂肪酶的微生物屬包括細(xì)菌28 個屬、放線菌4 個屬、酵母菌10 個屬以及真菌23 個屬[12]。微生物脂肪酶具有比動植物脂肪酶更為廣泛的作用pH 值、溫度以及作用底物范圍[13]。因此，微生物脂肪酶是工業(yè)脂肪酶的重要來源之一。

2 傳統(tǒng)脂肪酶固定化方法

根據(jù)酶與載體材料之間的作用方式不同，傳統(tǒng)的固定化方法可分為物理方法和化學(xué)方法，物理方法包括吸附法和包埋法，化學(xué)方法包括共價結(jié)合法和交聯(lián)法[9]。在物理方法中，酶和載體之間是通過較弱的鍵（如氫鍵、范德華力等）產(chǎn)生相互作用，因此酶與載體之間的結(jié)合是可逆的。而化學(xué)方法形成的共價鍵使得酶與載體之間相互作用更強(qiáng)，因此這個過程是不可逆的。圖2 為傳統(tǒng)的脂肪酶固定化技術(shù)分類。

圖2 傳統(tǒng)的脂肪酶固定化技術(shù)Fig.2 Conventional lipase immobilization

吸附法也稱為非共價法[14]，是最早應(yīng)用的酶固定化方法之一。它通過載體和酶分子自身結(jié)構(gòu)之間產(chǎn)生的非特異性的物理吸附、離子吸附、生物特異性吸附等，將酶分子固定在載體周圍從而形成固定化酶。該方法最常用的載體是陽離子和陰離子交換樹脂、活性炭、硅膠、陶瓷、纖維素和瓊脂糖等天然材料，以及一些工業(yè)殘留物。Ulker 等[15]通過物理吸附將南極假絲酵母脂肪酶B（Candidaantarcticlipase B，CALB）固定在表面修飾稻殼灰上，從而獲得了具有良好的儲存穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和回收再利用穩(wěn)定性的固定化脂肪酶制劑。通過吸附法可以使脂肪酶的各種特性得到提升，但酶與載體之間的作用力較弱，在催化使用中脂肪酶容易脫離載體。

包埋法是一種能保持酶原有構(gòu)象，并帶來良好的機(jī)械和儲存穩(wěn)定性的方法[16]。在包埋固定化過程中，酶被保留在聚合物結(jié)構(gòu)中，其孔隙允許底物和產(chǎn)物通過。Nobakht 等[17]研究了兩種載體包埋豬胰脂肪酶的應(yīng)用，與游離脂肪酶相比，包埋固定化脂肪酶具有更高的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和可重復(fù)使用性。在肉桂酸芐酯的合成過程中，固定化酶在連續(xù)5 次催化循環(huán)后，仍保持了90.4%的初始活性，循環(huán)使用8 次后，肉桂酸芐酯產(chǎn)率仍能達(dá)到80.0%。但經(jīng)過大量的實(shí)際應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，使用包埋法制備的固定化酶易出現(xiàn)擴(kuò)散限制、載體難以回收等問題。

共價結(jié)合法是將酶分子表面的官能團(tuán)與載體材料的活性基團(tuán)通過共價鍵連接的一種方法[18]。Zhou等[19]在2019年通過引入聚賴氨酸將CALB 直接共價固定化在氧化亞麻粉上，在最佳條件下，固定化CALB的活性回收率為（98.9±3.8）%。與游離脂肪酶相比，固定化CALB 具有良好的熱穩(wěn)定性，在55 ℃下保持了（58.4±2.8）%的活性，而游離CALB 的初始活性僅為（21.2±2.2）%。共價鍵使得酶與載體之間結(jié)合牢固，從而使該方法制備的固定化酶具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，但在共價結(jié)合過程中，酶分子的構(gòu)象容易發(fā)生變化，導(dǎo)致酶的活性降低。

交聯(lián)法是一種不需要載體的固定化酶的方法，固定化過程使用交聯(lián)劑進(jìn)行。這種試劑有兩個末端能與可溶性酶表面的特定氨基酸基團(tuán)形成分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)，從而形成交聯(lián)酶。交聯(lián)劑的主要功能是保護(hù)酶免受外部環(huán)境的影響[20]。這種無載體固定化系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)是催化酶活性高、穩(wěn)定性高，由于排除了固定化載體，生產(chǎn)成本降低。Guajardo 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CALB 經(jīng)過交聯(lián)形成的聚集體（cross-linking aggregates，CLEA）在低共熔溶劑（deep eutectic soivents，DES）中的固定化穩(wěn)定性顯著，其采用CLEA-CALB 衍生物催化苯甲酸和甘油酯化生產(chǎn)單苯甲酸甘油酯，與商業(yè)生物催化劑Novozym 435 相比，獲得了多出約30%的產(chǎn)品。固定化衍生物可以重復(fù)使用至少6 個周期，而不損失任何活性。但是這種傳統(tǒng)的交聯(lián)法也存在一些缺陷，比如在固定化過程中酶活力損失較大、固定化酶回收率不高、交聯(lián)劑價格昂貴等。

表1 總結(jié)了各類傳統(tǒng)固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 傳統(tǒng)的脂肪酶固定化方法的比較Table 1 Comparison of conventional methods for lipase immobilization

3 新型脂肪酶固定化技術(shù)

目前，新型脂肪酶固定化技術(shù)的研究主要集中在以下兩個方面。一是新型固定化材料的開發(fā)及傳統(tǒng)材料的改造，如納米材料、磁性材料、金屬有機(jī)骨架材料等固定載體的開發(fā)與應(yīng)用[5，22]；二是固定化新技術(shù)的開發(fā)，如微波輻射輔助固定化技術(shù)、膜固定化技術(shù)等的開發(fā)與應(yīng)用[23]。

3.1 基于新型固定化載體的固定化酶技術(shù)

新興的技術(shù)為酶載體創(chuàng)造了新的材料，以生產(chǎn)更堅(jiān)固、更環(huán)保、更便宜的生物催化劑。固定化過程中使用的載體在提高生物催化劑的性能方面起著重要的作用。研究表明，多種新型材料被用作脂肪酶固定化的載體，如納米材料、磁性材料、金屬有機(jī)骨架材料及改性后的傳統(tǒng)載體材料[23]。

3.1.1 改性傳統(tǒng)載體

改性載體是對傳統(tǒng)載體材料進(jìn)行化學(xué)修飾改造，從而顯著提高所制備固定化酶的性能[24]。一些應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)載體材料（如介孔材料、金屬氧化物及鹽類、大孔樹脂、天然多糖等），經(jīng)過不斷的研究已被證實(shí)在脂肪酶固定化方面具有很大的應(yīng)用潛力，但因其仍具有部分缺陷，如回收再利用困難、容易使酶的活性受損等，通過有目的地修飾與改造，克服其應(yīng)用缺陷，制備出新型的載體材料以推動固定化酶的工業(yè)化應(yīng)用，成為當(dāng)前固定化領(lǐng)域內(nèi)的研究熱點(diǎn)之一[5]。

介孔二氧化硅材料由于具有較高的比表面積、有序的結(jié)構(gòu)和較大的孔隙體積，成為各種化合物固定化的優(yōu)良載體。然而在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)介孔二氧化硅固定的催化劑機(jī)械強(qiáng)度不夠，且酶容易從載體材料上脫落。因此，對這種介孔材料進(jìn)行改性成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。Wang 等[25]將CALB 固定在鹵素和鹵代烷烴改性的SBA-15 介孔二氧化硅上。使用鹵素和鹵代烷烴對SBA-15 進(jìn)行硅烷化改性，經(jīng)過改性，得到功能化的SBA-15，命名為SBA-15-R（R 為鹵素或鹵代烷烴），并比較SBA-15 和改性的SBA-15 介孔材料作為不同脂肪酶的載體時催化活性的差異。結(jié)果表明，功能化的SBA-15 不僅具有良好的催化活性，而且可以防止酶脫落。因此，改良的SBA-15 是脂肪酶固定化的良好載體。

脂肪酶固定化載體SBA-15 結(jié)構(gòu)示意圖見圖3[26]。

圖3 脂肪酶固定化載體SBA-15 結(jié)構(gòu)示意圖Fig.3 Structure of SBA-15 as a lipase immobilization carrier

瓊脂糖是一種天然多糖，在脂肪酶的固定化方面具有巨大的應(yīng)用潛能。李冉[27]通過對瓊脂糖凝膠進(jìn)行了環(huán)氧、氨基和羧基化改性，成功制備了一種N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）修飾的瓊脂糖凝膠，然后篩選出了安全性高和固定化效果好的改性載體和偶聯(lián)方法，分別固定化L-天冬酰胺酶和T1脂肪酶，并在模擬應(yīng)用體系中探究其應(yīng)用性能。結(jié)果表明，固定化T1 脂肪酶在經(jīng)過6 次循環(huán)使用后，仍能保持77.58% 的活力，固定化后雖然最適溫度略有下降，但固定化T1 酶的可操作性和穩(wěn)定性明顯增加，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力。

大孔樹脂是一類不含交換基團(tuán)且有大孔結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，在樹脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便等諸多優(yōu)點(diǎn)。然而，作為固定化載體，大孔樹脂的可重用性較差，在使用過程中酶容易脫離載體。李雪玉等[28]分別以經(jīng)多巴胺修飾的大孔樹脂NKA（交聯(lián)-聚苯乙烯樹脂）和以對苯醌修飾活化的大孔樹脂HA（交聯(lián)-聚苯乙烯氨基樹脂）固定化褶皺假絲酵母脂肪酶（Candidarugosalipase，CRL），將其用于催化合成L-薄荷醇酯。在最優(yōu)條件下，油酸薄荷醇酯酯化率分別達(dá)到91%（NKA）和89.8%（HA）。研究表明多巴胺和對苯醌對大孔樹脂的修飾均能明顯提升固定化脂肪酶的催化性能。

3.1.2 納米載體

近年來，納米技術(shù)的最新進(jìn)展為酶的固定化提供了高性能的納米材料，由于納米顆粒具有高的比表面積、良好的機(jī)械強(qiáng)度和低質(zhì)量傳遞限制等優(yōu)越的性能，研究者逐漸將其應(yīng)用到包括生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)在內(nèi)的各個領(lǐng)域，成為酶固定化的潛在載體。在脂肪酶的固定化中，酶與納米載體結(jié)合形成的納米生物催化劑，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性和較好的催化性能，提高了酶的可重用性以及酶與底物的親和性[29]。常用于脂肪酶固定化的納米材料主要包括多孔納米金顆粒、納米管、石墨烯等。Zhong 等[30]將CALB 共價固定在溶膠-凝膠沉淀合成的羧基功能化中空介孔硅納米顆粒上，與游離CALB 相比，固定化CALB 對反應(yīng)pH 值和溫度變化的抗性更強(qiáng)。此外，固定化CALB 在重復(fù)使用8 次后保持了60%的殘留活性，表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。

3.1.3 磁性載體

自20世紀(jì)70年代以來，磁性顆粒越來越多地用于生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。此后，超順磁性納米顆粒被用作酶固定的有效載體。磁性材料的引入解決了酶的分離問題，固定化酶可以很容易地通過施加外部磁場進(jìn)行分離和恢復(fù)，從而快速終止酶促反應(yīng)并回收酶以供其繼續(xù)使用。單一的磁性顆粒一般不直接用于酶的固定化，通常與其他有機(jī)高分子聚合物或多孔無機(jī)材料聯(lián)合使用，以獲得較高的固定化效率[5]。磁性納米顆粒（magnetic nanoparticles，MNPs）結(jié)合了納米材料和磁性材料的優(yōu)勢，既具有大的比表面積和良好的機(jī)械強(qiáng)度又易于分離，在作為固定化酶的多功能載體方面具有獨(dú)特的地位[31]。Ren 等[32]利用聚多巴胺包裹的磁性納米顆粒（PD-MNPs），建立了一種簡單的脂肪酶固定化方法。圖4 為兩步合成PD-MNPs 固定化脂肪酶的示意圖。首先將Fe2+和Fe3+堿性共沉淀制備的Fe3O4MNPs在堿性多巴胺溶液中浸泡數(shù)小時，使MNPs 表面形成黏附的聚多巴胺膜，然后將PD-MNPs 置于含有脂肪酶的溶液中，合成PD-MNPs 固定化脂肪酶。在最佳條件下，脂肪酶的有效固定化率為73.9%，脂肪酶裝載量高達(dá)429 mg/g。酶分析結(jié)果顯示，與游離脂肪酶相比，固定在PD-MNPs 上的脂肪酶表現(xiàn)出更高的pH 值和熱穩(wěn)定性。此外，經(jīng)過循環(huán)反應(yīng)21 次和磁分離后，固定化酶仍保持了70%以上的初始活性。

圖4 兩步合成PD-MNPs 固定化脂肪酶Fig.4 Two-step lipase immobilization by poly（dopamine）magnetic nanoparticles（PD-MNPs）

3.1.4 金屬有機(jī)骨架材料載體

金屬有機(jī)骨架（metal-organic framework，MOF）是具有高度有序微孔晶體結(jié)構(gòu)的多孔混合聚合物，由特定的金屬離子如過渡金屬、堿金屬和有機(jī)黏合劑（羧酸鹽、硝酸鹽和磷酸鹽）組成[33]。MOF 作為固定化酶的載體材料，最大的優(yōu)點(diǎn)在于具有可調(diào)節(jié)的孔隙率、大的比表面積、高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性[34]。沸石咪唑酯骨架（zeolitic imidazolate frameworks，ZIFs）是一種在酶固定化方面具有廣闊前景的MOF，ZIFs 可以在溫和的條件下形成，解決了原位MOF 合成所需相對苛刻的條件問題[35]。Wang 等[36]將CALB 與硝酸鋅水溶液混合，直接包埋在沸石咪唑酸鹽框架ZIF-8 中，固定化酶表現(xiàn)出較高的活性、穩(wěn)定性和可重用性。表2 總結(jié)了脂肪酶固定化的新型載體存在的優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 脂肪酶固定化的新型載體比較Table 2 Comparison of novel carriers for lipase immobilization

3.2 新型固定化酶制備技術(shù)

3.2.1 微波輻射輔助固定化技術(shù)

近年來，微波輻射在有機(jī)化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用，可控微波輻射已被證實(shí)可以顯著加速化學(xué)反應(yīng)，并減少固定化所需的反應(yīng)時間。由于微波具有“致熱效應(yīng)”和“非熱效應(yīng)”，使得作用物體分子間的摩擦以及能量轉(zhuǎn)換增加，從而誘導(dǎo)極性分子發(fā)生旋轉(zhuǎn)，最終起到改善酶活性中心與底物的誘導(dǎo)契合作用、增強(qiáng)酶催化的專一性、縮短反應(yīng)時間、提高轉(zhuǎn)化率的作用[37]。

Du 等[38]采用微波輻照技術(shù)在低溫下將脂肪酶共價固定化在介孔硅質(zhì)泡沫上，以提高酶的性能。該研究使用智能微波反應(yīng)器共價固定CALB，并配有RPT-300+溫度控制傳感器，在冰水系統(tǒng)中溫度控制在0～4 ℃，研究微波輻照對酶性能的影響。研究發(fā)現(xiàn)，最佳微波輻照功率和時間分別為400 W 和120 s。微波照射下固定化脂肪酶的比活力為114.4 U/mg，是傳統(tǒng)無微波照射方法的1.23 倍。

微波輻照通過增加外傳質(zhì)系數(shù)和有效的粒子內(nèi)擴(kuò)散系數(shù)來加速酶的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而提高了載體對酶的負(fù)載。此外，加速酶的運(yùn)轉(zhuǎn)可以抑制酶蛋白的自溶，增強(qiáng)酶分布的均勻性，從而降低了酶的聚集，提高了底物對酶活性位點(diǎn)的吸附性。這些因素可能是導(dǎo)致微波照射下固定化酶活性增強(qiáng)的主要原因。此外，微波輻射還可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)折疊的動力學(xué)[39]，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄕ丈湟部梢哉{(diào)節(jié)酶的結(jié)構(gòu)，提高其活性[40]。

3.2.2 膜固定化技術(shù)

酶膜生物反應(yīng)器（enzyme membrane bioreactor，EMR）將酶固定化和膜技術(shù)相結(jié)合，將高效的酶促反應(yīng)與可選擇的膜分離技術(shù)相結(jié)合，表現(xiàn)出較高的催化活性和分離能力，能夠減少產(chǎn)物抑制、提高酶的穩(wěn)定性、增加反應(yīng)循環(huán)次數(shù)，并可持續(xù)地從溶液中分離產(chǎn)物。EMR 的性能主要依賴于酶的負(fù)載量和活性，它們分別與支撐膜的微結(jié)構(gòu)和微環(huán)境有著密切的聯(lián)系[41]。

實(shí)際上，絕大多數(shù)的EMR 都是將酶固定在細(xì)胞膜上的反應(yīng)器（reactor with enzyme immobilized on membranes，REIMs）。酶的活性、穩(wěn)定性和膜通量是評價REIM 系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)。固定化膜通常具有高酶載能力、高穩(wěn)定性和低傳質(zhì)阻力，但也經(jīng)常導(dǎo)致酶活性的損失和膜通量的降低[41]。一般來說，在REIM 中，酶可以在溶液中游離、固定在附加載體上或者直接固定在膜的多孔結(jié)構(gòu)上，其中酶直接固定在膜上的系統(tǒng)是一種相對簡單并且應(yīng)用最廣泛的方法。

Guo 等[42]在細(xì)胞流體鑲嵌模型的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一種結(jié)合仿生界面和固定化的簡便方法來構(gòu)建一種性能增強(qiáng)的EMR。通過表面終端過濾，將脂肪酶固定化在卵磷脂修飾的聚砜中空纖維膜上，制備了固定化脂肪酶膜生物反應(yīng)器，以三乙酸甘油水解為模型反應(yīng)，研究其性能、膜通量、底物濃度和溫度等操作變量，確定了最佳的試驗(yàn)條件。結(jié)果表明，制備的EMR 具有良好的催化性能，比空白材料的酶活性提高了42%，催化效率提高了78%。此外，在5 個循環(huán)后的剩余活性約為首次使用的88%，這表明EMR 具有良好的耐久性。此外，EMR 可用于連續(xù)的過程以提高生產(chǎn)率，并可用于進(jìn)行多相反應(yīng)。酶膜生物反應(yīng)器具有協(xié)同催化分離性能，已越來越多地應(yīng)用于實(shí)際應(yīng)用。

3.2.3 毛細(xì)管柱固定化技術(shù)

微型生物分析系統(tǒng)正越來越多地應(yīng)用于生化研究領(lǐng)域。研究人員已經(jīng)建立了毛細(xì)管電泳中的固定化酶微反應(yīng)器（immobilized enzyme microreactors in electrophoresis，IMERs），并將其用于小型生物分析系統(tǒng)。目前正在使用的兩種常用的IMER 包括微芯片和微毛細(xì)管[43]。在形成微型生物反應(yīng)器的過程中，酶可以兩種形式固定在毛細(xì)管上，一種是在毛細(xì)管的內(nèi)壁上；另一種是直接附著在毛細(xì)管的整體柱上[44]，所得反應(yīng)器命名為開管柱固定酶微反應(yīng)器和整體柱固定酶微反應(yīng)器。

Li 等[45]采用一種簡便、高效的共價固定化方法，將CALB 作為一種新型的手性固定相固定在毛細(xì)管內(nèi)壁上。由于共價鍵合方法的有效性和CALB 的固有穩(wěn)定性，制備的CALB 固定化毛細(xì)管柱具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。圖5 為CALB@毛細(xì)管柱的制備流程示意圖。

圖5 CALB@毛細(xì)管柱的制備流程示意圖Fig.5 Schematic diagram of preparation flow of CALB@capillary column

通過將酶的高選擇性與微結(jié)構(gòu)流式反應(yīng)器的高效流體相結(jié)合，IMERs 在生物分析方面表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢，它結(jié)合了酶固定化的優(yōu)點(diǎn)（能夠提高穩(wěn)定性和重復(fù)使用），以及毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢（即樣品消耗量少、分析時間短和高效的分析）[46]。IMERs 將酶固定在微通道中進(jìn)行生物催化，是小型化分析的重要工具，在連續(xù)流生物制造中具有良好的應(yīng)用前景[47]。此外，將開管柱固定酶微反應(yīng)器與毛細(xì)管電泳、納米高效液相色譜、質(zhì)譜和表面等離子體共振等先進(jìn)的分析技術(shù)直接相結(jié)合也具有較好的前景[48]。

表3 總結(jié)了基于新技術(shù)的新型脂肪酶固定化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，并指出了未來的發(fā)展方向。

表3 新型脂肪酶固定化技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及未來的發(fā)展方向Table 3 Advantages，disadvantages，and development direction of novel methods for lipase immobilization

4 固定化技術(shù)對脂肪酶性質(zhì)的影響

4.1 對脂肪酶催化活性的影響

在大多數(shù)情況下，固定化脂肪酶的催化活性會比游離脂肪酶低，這是由于在固定化過程中，根據(jù)固定化方法的不同，酶分子的空間構(gòu)象和活性中心都有可能發(fā)生變化，內(nèi)擴(kuò)散阻力也會使底物分子與活性中心的接近受阻，從而導(dǎo)致固定化后的酶活力下降。

然而，在某些情況下，固定化脂肪酶會表現(xiàn)出超活化現(xiàn)象。脂肪酶作為一種界面酶，具有能在油滴/介質(zhì)界面中移動的多肽鏈的靈活構(gòu)象，稱為“蓋子”[49]。脂肪酶作用機(jī)制的一個特點(diǎn)就是界面激活機(jī)制：脂肪酶可能以兩種不同的構(gòu)象存在，一種是開放的活性構(gòu)象，另一種是封閉的非活性構(gòu)象[50]。在均勻的水介質(zhì)中，這些構(gòu)象處于平衡狀態(tài)向封閉構(gòu)象移動。在底物疏水液滴的存在下，脂肪酶會吸附在這些液滴的界面上，構(gòu)象平衡向脂肪酶的開放形式轉(zhuǎn)移。超活化現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于當(dāng)脂肪酶被固定在疏水載體上時，它們的“蓋子”保持打開，活性位點(diǎn)完全暴露，從而促進(jìn)底物輸入，因此該酶的活性顯著增強(qiáng)。

4.2 對脂肪酶穩(wěn)定性的影響

穩(wěn)定性是指固定化酶能否長期穩(wěn)定操作和反復(fù)回收使用。從已有的研究報道來看，通常情況下，固定化技術(shù)可以顯著提高脂肪酶的穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性、pH 值穩(wěn)定性、有機(jī)溶劑耐受性、操作穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性等[51]。其原因可能是固定化后，酶與載體之間形成了多點(diǎn)連接，剛性增強(qiáng)，從而防止酶分子的伸展變形，酶失去了分子間相互作用的機(jī)會，抑制了其自身的降解過程[52]。

從固定化方法看，采用物理吸附法制備的固定化酶，都有可能導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性降低，因此要提高酶的熱穩(wěn)定性，采用物理吸附法是不合適的，而采用交聯(lián)法制備的固定化酶，其熱穩(wěn)定性將會得到改善[53]。穩(wěn)定性的提高使得脂肪酶在反應(yīng)中的催化作用發(fā)揮的更好，反應(yīng)后也更易從產(chǎn)物中分離出來。操作穩(wěn)定性的提高，讓固定酶的重復(fù)利用成為可能，這也在一定程度上降低了催化反應(yīng)的成本[54]。

4.3 對脂肪酶最適條件的影響

固定化后大多數(shù)酶的熱穩(wěn)定性提高，所以最適溫度也隨之提高。酶固定化后對底物作用的最適pH 值常常會發(fā)生偏移。帶負(fù)電荷的載體固定化酶的最適pH 值向堿性偏移，帶正電荷的載體固定化酶的最適pH 值向酸性偏移[55]。這是因?yàn)槎嗑坳庪x子載體會吸引溶液中陽離子，包括H+，使其附著于載體表面，結(jié)果使固定化酶擴(kuò)散層H+濃度比周圍的外部溶液高，即偏酸，這樣外部溶液中的pH 值必須向堿性偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使其表現(xiàn)出酶的最大活力。反之，使用帶正電荷的載體其最適pH值向酸性偏移。

4.4 對脂肪酶特異性的影響

脂肪酶的底物特異性是指在一定反應(yīng)條件下，對具有不同底物分子的催化速率存在差異[56]。酶底物特異性取決于酶分子的結(jié)構(gòu)，特別是酶活性中心的結(jié)構(gòu)，因此，酶結(jié)構(gòu)的差異使酶的底物特異性也有所不同。而脂肪酶的特異性可以簡要分為位置或區(qū)域選擇性、立體選擇性和脂肪酸選擇性。

一般來說，通過化學(xué)方法制備的固定化酶，其空間結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化，導(dǎo)致固定化酶與游離酶的底物特異性存在差異。這種差異與底物相對分子質(zhì)量的大小有一定關(guān)系。對于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異性沒有明顯變化。而對于那些可作用于大分子底物、又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特異性往往會發(fā)生變化[55]。

Kahveci 等[57]通過生物印跡和固定化技術(shù)提高CRL 和南極假絲酵母脂肪酶A（candidaantarcticlipase A，CALA）的活性和選擇性，并對所有改性脂肪酶進(jìn)行了魚油選擇性乙醇解以濃縮omega-3 多不飽和脂肪酸的測試。結(jié)果表明，除固定化的酶外，其他酶均不催化乙醇分解，處理后的脂肪酶表現(xiàn)出更高的活性和更好的脂肪酸選擇性。

5 總結(jié)與展望

在酶的固定化研究中，相比較傳統(tǒng)的固定化方法，新型固定化載體和新型固定化技術(shù)具備機(jī)械強(qiáng)度大、穩(wěn)定性高、分離效率高等諸多優(yōu)勢和發(fā)展?jié)摿?。本文主要從脂肪酶固定化的新技術(shù)和新載體的角度對脂肪酶固定化技術(shù)進(jìn)行了全面綜述，比較分析了各種固定化方法存在的優(yōu)缺點(diǎn)。結(jié)合當(dāng)前固定化脂肪酶的發(fā)展趨勢，在未來的脂肪酶固定化技術(shù)研究中，還需要在以下幾個方面做出努力：1）著力于開發(fā)過程簡單、易于操作、具有普適性的新方法；2）尋找廉價易得、易分離、使用壽命長、機(jī)械強(qiáng)度好的新載體；3）通過批次反應(yīng)、放大試驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)固定化脂肪酶穩(wěn)定、連續(xù)、規(guī)?；a(chǎn)。利用固定化技術(shù)提高脂肪酶的穩(wěn)定性、酶活力、選擇性以及重復(fù)利用率等性能可以使脂肪酶更好地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域，具有十分廣闊的前景。